Abstract

Introdução

Estudos anteriores demonstraram que MicroRNA-92a (miR-92a) foi significativamente diferencial expressa entre o cancro colorectal (CRC) pacientes e controlar coortes, que fornecem evidências oportuna relevantes para miR-92a como um novo biomarcador promissor nos pacientes com câncer colorretal. Esta meta-análise teve como objetivo avaliar o potencial valor diagnóstico de plasma miR-92a.

Métodos

literaturas relevantes foram coletadas no PubMed, Embase, chinês Biomedical Literatura banco de dados (CBM), chinês Infra-estrutura Nacional de Dados de Conhecimento (CNKI) e Tecnologia de Chongqing (VIP), e Wan fang dados. A sensibilidade, especificidade e as probabilidades de diagnóstico relação (DOR) para miR-92a no diagnóstico da CRC foram reunidas utilizando modelos de efeitos aleatórios. receptor Resumo operating characteristic (SROC) análise da curva ea área sob a curva (AUC) foram utilizados para estimar o desempenho global do teste.

Resultados

Esta meta-análise incluiu seis estudos com um total de 521 pacientes com CCR e 379 controles saudáveis. Para miR-92a, a sensibilidade combinada, especificidade e DOR para prever pacientes com CCR foram de 76% (95% intervalo de confiança [CI]: 72% -79%), 64% (95% intervalo de confiança [CI]: 59% -69 %) e 8,05 (95% CI: 3,50-18,56), respectivamente. Além disso, a AUC de miR-92a no diagnóstico CRC é 0,7720.

Conclusões

MicroRNA-92a pode ser um romance potencial biomarcador para o diagnóstico de cancro colorectal, e mais estudos são necessários para destacar os pontos fortes teóricos

Citation:. Yang X, Zeng Z, Hou Y, Yuan T, Gao C, Jia W, et al. (2014) MicroRNA-92a como um potencial biomarcador em Diagnóstico de câncer colorretal: uma revisão sistemática e meta-análise. PLoS ONE 9 (2): e88745. doi: 10.1371 /journal.pone.0088745

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 29 de novembro de 2013; Aceito: 10 de janeiro de 2014; Publicação: 14 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China (NSFC 81.072.147, NSFC 30.940.096); o Fundo de Doutorado do Ministério da Educação, China (20105503110001, 20125503110001); a Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses, Ministério da Educação, China ([2011] 508); o Programa Maior de Chongqing University Medical XBZD201006; e da Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos Estudiosos da Universidade de Medicina de Chongqing. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias mais comuns. Com uma estimativa de 1,2 milhões de novos casos e mais de 6 mil mortes a cada ano, o câncer colorretal (CCR) é o quarto câncer mais comum principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, o terceiro tipo de câncer diagnosticado mais familiar em homens ea segunda em mulheres [ ,,,0],1]. Embora a doença desenvolve-se lentamente a partir de lesões pré-malignas de carcinoma invasivo, o prognóstico é extremamente insatisfatório devido ao seu diagnóstico em fase avançada [2]. Felizmente, há evidências de que o rastreio do CCR em estágio inicial permite a remoção cirúrgica das lesões precursoras do câncer e potencialmente reduz a mortalidade da doença [3]. Para detectar câncer em estágio inicial, várias estratégias de triagem CRC, incluindo o teste oculto nas fezes com sangue (FOBT) e colonoscopia, foram implementadas há anos. No entanto, a fecal teste oculto-sangue (FOBT), que é atualmente a ferramenta de triagem não invasiva mais disponível, tem a limitação de baixa sensibilidade e requer restrição dietética punctilious [4]. Por outro lado, como o método padrão-ouro para a detecção precoce do CRC, colonoscopia foi rejeitada devido à sua natureza invasiva e o alto custo [5]. Como resultado, é urgentemente necessária uma nova abordagem não-invasiva para melhorar a detecção de CRC em estágio inicial.

Felizmente, a descoberta de microRNAs abriu uma nova janela para o diagnóstico precoce do cancro por um não-invasivo detecção. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de ARN não-codificantes evolutivamente conservadas e pequenas que regulam uma variedade de processos celulares críticos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, apoptose e metabolismo [6]. Embora os mecanismos naturais da desregulação de miARNs estão longe de ser completamente entendida, miARNs têm demonstrado desempenhar papéis importantes na formação e progressão do tumor, eles próprios actuar como oncogenes ou supressores de tumor, afectando o diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e tratamento para humanos cancros [7], [8].

Durante as últimas décadas, anos, estudos têm demonstrado que a expressão miARNs são significativamente diferentes entre o tecido tumoral e tecido normal [8], e estes miARNs associados a tumores foram detectados em o sangue de pacientes com cancro [9], [10]. Os estudos anteriores revelaram diferentes tipos de câncer têm perfis de miRNA distintas [11] – [14]. Em 2009, Ng

et al.

[15] relatada pela primeira vez que o miR-92a, pertencendo do miR-17-92 cluster, foi significativamente regulada positivamente no plasma de pacientes com câncer colorretal em comparação com indivíduos saudáveis, sugerindo que miR- 92a poderia ser um potencial não-invasiva molecular para o rastreio de CRC. A seguir, os pesquisadores crescentes dedicar-se ao valor clínico de miR-92a no CRC [16] – [20].

Para entender se o miR-92a poderia servir como um biomarcador de diagnóstico para CRC, nós fizemos a sistemática revisão e meta-análise usando pool de literaturas publicadas procurou a partir de várias bases de dados electrónicas de autoridade sem restrições de data de publicação e o início de fontes de dados foi publicado em 14 de fevereiro de 2006. Nossos dados mostraram que microRNA-92a pode ser um romance potencial biomarcador no diagnóstico de câncer colorretal

Materiais e Métodos

Fontes de dados e Pesquisa Estratégia

Todos os artigos relevantes, limitado no título e resumo, foram pesquisados ​​através de bases de dados eletrônicas.: PubMed, Embase, chinês Biomedical Literatura banco de dados (CBM), chinês Infra-estrutura do Conhecimento Nacional (CNKI) e Tecnologia de Chongqing (VIP), e Wan fang dados até 29 de novembro de 2013. Não há restrição foi usada na língua, ano de publicação e publicação estado. As palavras-chave utilizadas para a recuperação de literatura incluiu: (1) Colorectal ou cólon ou do cólon ou rectal ou reto; (2) O cancro ou tumor ou tumor ou carcinoma ou neoplasia ou carcinomata; (3) miR-92 ou microRNA-92 ou HSA-mir-92 ou miR-92a ou microRNA-92a ou HSA-mir-92a. Além disso, nós também procurou manualmente as referências de artigos incluídos e relatórios publicados relevantes.

Inclusão e Exclusão Critérios

Todos os estudos foram cuidadosamente decidido por dois investigadores (XY e Zyz) com base independentemente em títulos e resumos, em seguida, encontrou texto completo para qualquer potencial elegibilidade. Qualquer desacordo foi resolvido por totalmente a discussão a um consenso. Além disso, se necessário, nós nos voltamos para os autores originais para dados perdidos. Cada artigo de inclusão devem satisfazer a seguinte critérios: (1) O diagnóstico de CRC foi baseada na colonoscopia ou exame histológico; (2) Os indivíduos controles pareados foram incluídos com uma recente resultado negativo de colonoscopia e sem uma história pessoal de quaisquer tipos de câncer; (3) Todas as amostras de sangue foram coletadas antes da colonoscopia e sem qualquer tratamento; (4) Os pesquisadores avaliaram o miR-92a na amostra de sangue por si só; (5) Os estudos devem conter os dados de sensibilidade, especificidade (ou a possibilidade de obter tais valores a partir dos dados), e um valor de clara de corte; (6) Apenas o estudo com mais de 20 casos e controlos correspondentes foram incluídos. Todos os estudos foram excluídos se tivessem qualquer um dos seguintes itens: (1) as publicações duplicadas; (2) As cartas, editoriais, encontrando resumos, relatos de casos e comentários; (3) os doentes e sujeitos de controlo não qualificado, bem como as suas amostras de sangue; (4) Dados insuficientes. Se o mesmo autor relatou seus resultados adquiridos a partir da população de sobreposição ou vários dados publicados nas diferentes obras, apenas o mais próximo ou o relatório mais completo foi incluído.

Extração de dados

Dois investigadores (XY e ZYZ) lidos os textos completos dos estudos incluídos e extraídos os seguintes dados de forma independente: autores, país, revista, ano de publicação, desenho do estudo, o número e as características dos pacientes e controles, respectivamente, método de ensaio dos marcadores, valores de corte e de dados brutos para a tabela de quatro vezes e assim por diante. Discordâncias foram resolvidas por discutir plenamente com o terceiro pesquisador sênior para chegar a um consenso.

Avaliação da Qualidade

A qualidade de cada estudo foi avaliada de forma independente por dois investigadores (XY e Zyz) de acordo com o QUADAS -2 (Avaliação da Qualidade da precisão do diagnóstico estudos 2). O QUADAS-2 é reconhecido como uma melhor ferramenta, redesenhado que compreende 4 domínios-chave (seleção de pacientes, teste do índice, padrão de referência, e de fluxo e tempo), apoiado por sinalização perguntas para ajudar o julgamento sobre o risco de viés, o risco de classificação de parcialidade e preocupações sobre aplicabilidade como “alta”, “claro” e “baixo”, e estudos de manipulação em que o padrão de referência consiste de follow-up [21].

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizada por Meta-disco e STATA 12,0 software estatístico [22]. Todos os dados de precisão de cada estudo (verdadeiros positivos, falsos positivos, verdadeiros negativos e falsos negativos) foram extraídas para obter pool sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança positiva (PLR), razão de verossimilhança negativa (NLR), valor previsto positivo, valor previsto negativo, odds ratio de diagnóstico (DOR) e o seu intervalo de confiança de 95% [IC 95%], simultaneamente, gerar o operador receptor resumo característica (SROC) curva e calcular a área sob a curva (AUC). A sensibilidade, especificidade, valor previsto positivo e negativo, razão de chances de diagnóstico de miR-92a foram apresentados como parcelas florestais. Além disso, a heterogeneidade entre os estudos causadas por efeito de limiar foi quantificada usando análise de correlação de Spearman. O efeito não-limite foi avaliada pelo método de Cochran-Q e o teste do índice de inconsistência (I

2), e um p-valor baixo (≤0.05) e alto I

2 valor (≥50%) sugerem a presença de heterogeneidade de efeito não-limiar causado. Se o efeito não-limite existiu, meta-regressão seria usado para descobrir as fontes. Para viés de publicação, todos os estudos elegíveis foram avaliadas pelo teste de Begg e teste de Egger usando STATA 12,0 software estatístico. O

valor P

com menos de 0,05 mostra um resultado de significância estatística.

Resultados

Seleção de Dados

Noventa literaturas foram primitivamente identificados de acordo com a literatura estratégia de busca a partir de bases de dados e busca mão (Figura 1A). Seguindo os títulos e busca resumo destes, 23 duplicatas e 23 comentários foram removidos. Destes permaneceu 44 literaturas, suas versões de texto completo foram recuperados. Destes, 15 estudos não eram diagnóstico, 11 não foram utilizados amostra de sangue, 4 não foram CRC, 2 não foram avaliadas miR-92a, e um não foi no câncer humano, de modo que todos os 33 desses estudos foram excluídos da análise posterior. 11 literaturas foram considerados potencialmente elegíveis foram recuperados para leitura de texto completo. Entre os 11 estudos de coorte, um adicional de 5 estudos foram excluídos da análise mais aprofundada devido às 2 resumos de reuniões [23], [24] e ausência 3 de dados [25] – [27]. Assim, seis estudos de coorte de alta qualidade de grupo de pesquisa independente preencheram os critérios de elegibilidade, incluindo o consentimento informado dos participantes para esta revisão sistemática e meta-análise [15] – [20]. Além disso, enviamos 4 de e-mails com os autores para solicitar mais detalhes sobre sensibilidade, especificidade e AUC, apenas 1 autor nos dar a resposta dele [20], um autor afirmou que o índice combinado, não o único índice de miRNAs tem foi detectado em seu estudo [25], e 2 autor não tinha resposta para nós [26], [27].

(a) diagrama do processo de seleção do estudo. avaliação (B) Qualidade dos estudos incluídos por QUADAS-2. Ele resumiu “risco de polarização” e “preocupações aplicabilidade” através de julgar cada domínio para cada estudo incluído. Ele mostra as principais tendências concentradas sobre a “seleção de pacientes” e “text index”.

Características de Estudos

Todas essas literaturas elegíveis foram publicados de 2009 a 2013, acumulando 521 CRC pacientes e 379 controlos saudáveis. A colonoscopia foi considerado como padrão ouro para o diagnóstico da CRC. As características do estudo, incluindo o primeiro autor, publicar ano, país, o número de pacientes e controles, a média de idade, estágio TNM, tipo de ensaio, controlo interno, valor de corte, sensibilidade, especificidade e AUC, estão listados na Tabela 1.

avaliação da qualidade

A qualidade dos estudos incluídos foi avaliada usando QUADAS-2 avaliação da qualidade. Como mostrado na Figura 1B, todos os 6 inclusões são pertencem a qualidade média superior. No entanto, um grande preconceito foi encontrado nestes estudos incluídos. Em geral, as principais tendências destes estudos elegíveis foram concentradas sobre a “seleção de pacientes” e “text index”.

heterogeneidade e Threshold Effect

A heterogeneidade entre os estudos é uma chave fundamental para compreensão dos fatores que influenciam as estimativas de precisão, e avaliar a adequação do agrupamento de estatística das estimativas de precisão de vários estudos [22]. A fim de avaliar se a heterogeneidade de miR-92a estão entre os estudos elegíveis, foram calculados pela primeira vez o coeficiente de correlação e

P valor

entre o logit de sensibilidade e logit de 1-especificidade por meio do teste de Spearman para excluir a efeito de limiar. Como resultado, o coeficiente de correlação de Spearman foi 0.143 e

P

valor foi 0,787 ( 0,05), indicando que não houve heterogeneidade do efeito de limiar. Devido ao efeito sem limiar sendo outra chave para a heterogeneidade entre os estudos, o índice de inconsistência (I

2) foi empregado. O I

2 na trama floresta de índice de diagnóstico foi mais do que 50% (como mostrado na Figura 2) que sugeriram a heterogeneidade provocada por efeito não foi limiar existiu entre estes estudos.

As eficiências de ponto a partir de cada estudo são apresentadas como quadrados e as eficiências combinadas são mostrados como diamantes. Grau de liberdade é abreviado como df. Inconsistência é utilizado para quantificar a heterogeneidade provocada por efeito não-limiar. Desses estudos, o modelo de efeitos aleatórios foi utilizado para reunir esses dados. (A) Sensibilidade e especificidade, (B) e DCP NLR, (C) DOR, e seu IC de 95% são apresentados, respectivamente, o que sugere que o miR-92a pode ser um potencial biomarcador de diagnóstico não invasivo CRC.

Análise de dados

Devido à heterogeneidade potencial causado pelo efeito sem limiar estava entre esses estudos, o modelo de efeitos aleatórios foi utilizado para estimar o desempenho geral de miR-92a no CRC diagnóstico. Para miR-92a, a sensibilidade, especificidade, PLR, NLR e DOR de 6 estudos incluídos foram realizadas por parcelas florestais (Figura 2). A sensibilidade e especificidade reunidas de miR-92a foram de 76% (IC de 95%: 72% -79%) e 64% (IC de 95%: 59% -69%) para o diagnóstico de pacientes de CRC, respectivamente (Figura 2A). Sua PLR e NLR no CRC diagnóstico foi de 2,36 (IC 95%: 1,56-3,58) e 0,32 (95% CI: 0,20-0,51) em separado (Figura 2B). A DOR resumo (Figura 2C) e a área sob SROC foram 8,05 (IC 95%: 3,50-18,56). E 77,20% (Figura 3), sugerindo uma precisão diagnóstica moderada de miR-92a para o diagnóstico CRC

cada quadrado representa um estudo. A curva SROC é simétrica e a AUC é 0,7720, o que sugere uma precisão diagnóstica moderada para diagnosticar CRC.

Meta-regressão

Devido a heterogeneidade gerada pelo não-limite dentro dos estudos pode ser, obviamente, observados na parcela florestal do índice de diagnóstico (como mostrado na Figura 2), que tentou explicar essa heterogeneidade, explorando as características do estudo, tais como idade, estágio TNM, espécime números, utilizando meta-regressão. Infelizmente, não há indícios satisfatórios foram encontrados.

viés de publicação

O viés de publicação é reconhecido como outro fator que influencia a precisão de diagnóstico [28]. O teste de Begg e teste de Egger foram utilizados neste meta-análise. O

valor P

é 1,000 para o teste de Begg e 0,812 para o teste de Egger, que é mais do que 0,05 e sugere que não há viés de publicação existe entre esses estudos incluídos (Figura 4).

É realizada por gráfico de funil. Cada ponto representa um estudo e da linha é a linha de regressão. Ele mostra não existe viés de publicação.

Discussão

Para o nosso conhecimento, não há avaliação baseada em evidências para miR-92a como um novo biomarcador para o diagnóstico CRC desde que foi relatada pela primeira vez sobre a avaliação quantitativa em pacientes com CCR. Nesta meta-análise, encontramos níveis de expressão discrepantes de miR-92a no plasma têm um significado certamente estatística entre os pacientes com CCR e os indivíduos de controle. Como conclusão, o miR-92a discriminados CRC dos controles e rendeu uma AUC de 0,772 com o resumo de 76% (95% CI: 72% -79%) sensibilidade e 64% (95% CI: 59% -69%) especificidade, sugerindo o seu valor de diagnóstico potencial de CRC como a detecção não invasiva. A proporção de diagnóstico de chances (DOR), como um índice que representa compacidade entre a eficiência de diagnóstico e os casos, tem excelente desempenho no teste com um valor extremamente elevado [29]. AUC é considerado como o teste de desempenho geral, e o valor óptimo é infinitamente perto de 1 [30]. Em nosso estudo, o valor DOR de (IC 95%: 3,50-18,56) 8,05. E AUC de 0,772 prompt de uma precisão diagnóstica moderada para diagnosticar CRC

É indispensável para qualquer meta-análise que potenciais fontes de heterogeneidade são examinados, antes de se considerar a partilha dos resultados dos estudos primários em estimativas de síntese com maior precisão [31]. Felizmente, não há heterogeneidade provocada por efeito de limiar na nossa meta-análise. No entanto, embora a heterogeneidade causada pelo efeito não-limite existe, não podemos encontrar as fontes de heterogeneidade por regressão Meta por causa da limitação dos números de artigo. Em uma meta-análise, uma preocupação importante é a seleção de estudos. Há um risco de que o viés de publicação pode prejudicar a confiabilidade das conclusões da meta-análise, se a amostragem é restrita a estudos publicados, porque os estudos publicados tendem à conclusão positiva. [32]. No entanto, o viés de publicação está ausente em nossa análise com um número menor de estudos primários também.

Como um potencial biomarcador para o diagnóstico da CRC, miR-92a tem várias vantagens óbvias.

Em primeiro lugar , miR-92a é um biomarcador estável. Retrospectivamente, uma nova classe de pequenos RNAs regulatórios, descrita pela primeira vez em 1993 por Lee et al. [33], tem sido o foco de investigações intensivas. Evidências crescentes demonstrou as funções cruciais de miRNAs na iniciação do câncer, progressão e metástase [7], [8]. Notavelmente, literaturas recentes confirmaram que miARN pode entrar no sistema de circulação, incluindo sangue e outros fluidos do corpo [34] – [36], que tem sido especulado para ser libertado a partir de células quebradas [37]. A descoberta de miRNAs e sua existência no sangue abriram novas perspectivas para o rastreio do cancro. Além disso, existem miRNAs plasma endógenas de uma forma que é resistente a actividade RNase plasma, o que significa miRNAs no plasma permanecem em grande parte intactos e são de fato bastante estável para a detecção [36].

Em segundo lugar, miR-92a é uma organização não biomarcador -invasive e conveniente. O câncer colorretal é, se detectado precocemente, uma doença altamente curável. foram certificadas-se que a queda nas taxas de incidência de CRC é em grande parte duo a colonoscopia e a remoção da lesão pré-cancerosa [38], no entanto, a vasta aplicação clínica deste procedimento é principalmente limitada pela natureza invasiva, desagradável, e inconveniente [5] . Ao contrário, biomarcadores de câncer como potencialmente poderoso, miRNAs circulantes têm vantagem notável em termos de conveniência, compliance e não invasivo [35]. Referindo-se FOBT, a menor sensibilidade notável (23,9%) [4]) em comparação com o miR-92a (sensibilidade de 76%) torna tal difícil de diagnóstico na fase precoce CRC. Além disso, eles também não têm necessidade de restrição alimentar e recolha meticulosa. Em conclusão, a nossa meta-análise inspirar que a expressão diferencial de um único miARN no plasma podiam discriminar CRC do normal, levantando a possibilidade de utilização de tais marcadores para desenvolver um teste de diagnóstico não invasivo e rápido para CRC no futuro.

Por último, mas não menos importante, miR-92a é um biomarcador maior sensibilidade. Ao longo dos últimos anos, muitos grupos têm themslves dedicados para definir assinaturas que predizem CRC, mas ainda não há um biomarcador de diagnóstico prático para CRC, com sensibilidade e especificidade satisfatórias. antigénio carcinoembrionário (CEA), que tem sido o primeiro marcador de sangue proposto em ligação com CRC [39], a sensibilidade global variava entre 43% e 69%, e mais outros marcadores tumorais comum para CRC, a sensibilidade global variava de 18% a 65% para o antigénio hidrato de carbono 19-9 (CA19-9) e 30% a 55% de hidratos de carbono antigénio 242 (CA242) [40]. Assim miR-92a, como uma maior sensibilidade promissor, e biomarcador não invasivo, tem uma vantagem importante em relação a outros marcadores para triagem de CRC.

Embora nossos resultados são promissores, há várias limitações nesta meta-análise. Por um lado, devido ao valor clínico de miR-92a tem sido explorado em CRC apenas para anos recentes, pequeno tamanho da amostra está contida na nossa meta-análise, e como resultado, os efeitos de pequeno estudo são inevitáveis. Por isso, é necessário reforçar a nossa conclusão por novas validações de miR-92a em grande coorte e em estudos independentes. Por outro lado, a especificidade de 64% (IC de 95%: 59% -69%) não é satisfatória no nosso estudo. O miR-92a, como uma parte importante do posicionamento de cluster mir-17-92 em 13q, está entre os melhores oncogenes miRNA caracterizada, cuja amplificação genómica ou elevação anormal são freqüentemente observadas em uma variedade de tipos de tumor [8]. Esta característica pode torná-lo incerto se este marcador é específico para CRC. Além disso, ainda existem alguns preconceitos em nossa mete-análise. Para o tipo de concepção de estudos elegíveis, apenas dois desses estudos afirmou claramente usando um desenho prospectivo, e 4 outros estudos não mencionou. O valor de cut-off para avaliar a expressão de miR-92a nos 6 estudos foi seleccionada a partir da curva ROC, o que é geralmente aceite para optimizar o desempenho geral do teste. Além disso, há estudos inequivocamente mencionado se um desenho cego foi utilizado na pesquisa.

Em conclusão, nosso estudo demonstra miR-92a tem sensibilidade razoável e é um potencial biomarcador para a detecção CRC pelo método de estatísticas. Se validado em um estudo de larga escala, miR-92a pode ser útil como uma ferramenta de triagem não invasivo para a prática clínica da CRC.

Informações de Apoio

Checklist S1.

PRISMA 2009 Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088745.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Isso funciona foi apoiado em parte pela

ng, EK et al

,

Huang, Z et al

, Giraldez,

MD et al

,

Luo, X et al

,

Liu, GH et al

,

e Vega, AB et al.

Graças a estes autores para suporte de dados.