Abstract

Embora a expressão de célula de proteínas de sinalização é usado como biomarcador prognóstico e preditivo, a variabilidade dos níveis de proteína dentro dos tumores é não bem estudado. Foram avaliados heterogeneidade intratumoral da expressão da proteína dentro de câncer de ovário primário. proteínas de comprimento total foram extraídos a partir de amostras de tecido 88 fixadas em formalina e embebidas em parafina de 13 carcinomas ovarianos primários de alto grau serosas com 5-9 amostras cada. Além disso, 14 amostras de epitélio trompa de Falópio normais serviram como referência. arrays de proteínas de fase reversa quantitativa foi usada para analisar a expressão de proteínas de sinalização de células, incluindo HER2 36, EGFR, PI3K /Akt, e vias angiogénicos, bem como 15 proteínas activada (fosforilada). Encontrámos considerável heterogeneidade intratumoral na expressão de proteínas com um coeficiente de variação médio de 25% (intervalo de 17-53%). O grau de heterogeneidade intratumoral diferiram entre proteínas (p 0,005). Curiosamente, não houve diferenças significativas no grau de heterogeneidade entre as proteínas fosforiladas e não-fosforilados. Em comparação, avaliou a variação dos níveis de proteína entre os tumores de pacientes diferentes, que revelou um coeficiente médio similar de variação de 21% (entre 12-48%). Com base no agrupamento hierárquico, as amostras do mesmo paciente agrupados de forma mais estreita em comparação com amostras de doentes diferentes. No entanto, uma clara separação de tumor contra o tecido normal pelo agrupamento só foi alcançado quando os valores médios de todas as amostras individuais por tumor foram analisados ​​de expressão. Embora a expressão diferencial de algumas proteínas foi detectada independentemente do método de amostragem utilizada, a maioria das proteínas só demonstrou expressão diferencial quando os valores médios de expressão de múltiplas amostras de tumor foram analisados ​​por. Nossos dados indicam que a avaliação de proteínas de sinalização celulares estabelecidas e novos marcadores de diagnóstico ou de prognóstico podem exigir amostragem de câncer de ovário seroso em vários locais distintos para evitar viés de amostragem

Citation:. Mittermeyer G, Malinowsky K, Beese C, Höfler H, Schmalfeldt B, Becker KF, et al. (2013) Variação de Sinalização Celular Protein Expression pode introduzir Amostragem de Bias em epitelial cancro do ovário primário. PLoS ONE 8 (10): e77825. doi: 10.1371 /journal.pone.0077825

editor: Rubi John Anto, Rajiv Gandhi Centro de Biotecnologia, Índia |

Recebido: 04 de julho de 2013; Aceito: 05 de setembro de 2013; Publicação: 28 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mittermeyer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiada por doações internas do Departamento de Patologia e do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a segunda neoplasia ginecológica mais comum e aquele com a maior taxa de mortalidade no mundo ocidental [1]. Durante as fases iniciais da doença é geralmente assintomática e, consequentemente, a maioria dos pacientes são diagnosticados com fases avançadas, resultando numa taxa de sobrevivência de cinco anos pobre total inferior a 40% [2]. O tratamento padrão para pacientes com câncer de ovário é cirurgia seguida de platina e taxanos quimioterapia à base de combinação. Embora a maioria dos pacientes apresentam resposta inicial a quimioterapia, a maioria posteriormente desenvolve resistência e 50-75% dos pacientes recaída no prazo de cinco [3] anos. A avaliação de proteínas de sinalização celular oferece a oportunidade de identificar alvos potenciais novas drogas, bem como para prever a resposta ao tratamento e auxílio na individualizadas decisões de tratamento [4]. A fim de servir como um biomarcador para uma terapia direcionada otimizada aproximar a identificação e análise quantitativa de estruturas alvo e /ou das respectivas cascatas de sinalização a jusante é de elevada importância. No entanto, o potencial heterogeneidade intratumoral de sinalização celular expressão de proteínas pode introduzir um viés de amostragem e não tem sido amplamente avaliados em cancro do ovário.

Um número de proteínas de sinalização celulares foram previamente identificados como possíveis alvos terapêuticos ou como potencial ou prognóstico biomarcadores preditivos. Estes incluem o VEGF, VEGFR, PDGFR, EGFR ou HER2, PI3K, AKT, mTOR e outros [5], [6], [7], [8]. Da mesma forma importante é a ativação de vias de sinalização celular refletidas pelas formas fosforiladas das proteínas-alvo ou componentes de suas respectivas vias de sinalização a jusante [9], [10], [11].

O objetivo geral deste estudo foi avaliar o nível de heterogeneidade de expressão de proteínas de sinalização celular em cancro do ovário seroso. Foram analisados ​​36 proteínas de sinalização celular, incluindo 15 proteínas fosforiladas representam proliferação e vias relacionadas angiogênese. Nós, adicionalmente investigado o impacto potencial de heterogeneidade na detecção da expressão da proteína diferencial entre tumor e tecido normal ou entre os subgrupos de tumores.

Em comparação, avaliou a variação fisiológica da expressão da proteína no tecido epitelial seroso normal entre os diferentes pacientes. epitélio trompa de Falópio de indivíduos saudáveis ​​e de tubos contralateral não envolvidas de pacientes com câncer foi utilizado como um tecido de referência, uma vez que estudos anteriores demonstraram que os cancros serosa são molecularmente mais estreitamente relacionadas com epitélio tubário. células epiteliais trompa de Falópio foram sugeridos como as células de origem para, pelo menos, alguns carcinomas serosos de alto grau [12], [13].

Para a análise de grande número de amostras e como proteínas alvo aplicadas nesta estudo, a metodologia immunoblot convencional não é adequado como seria necessário mais de 3500 faixas de Western blot para realizar uma única análise de todas as amostras e anticorpos. O array de proteínas de fase inversa (RPPA) permite a análise simultânea de várias amostras para a expressão de várias proteínas sob as mesmas condições experimentais [14], [15]. Análise de proteínas em duplicados e as diluições em série permite a detecção quantitativa reprodutível de expressão da proteína. RPPA tem amplamente demonstrado a sua viabilidade para a análise de amostras clínicas criopreservados [16], [17], [18]. Mais recentemente, o nosso grupo e outros estabelecido que a tecnologia RPPA também permite de forma fiável a análise de (FFPE) amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina [19], [20], [21], [22] e é uma ferramenta adequada para heterogeneidade proteína endereço dentro de tais amostras [23].

Materiais e Métodos

amostras de Tecido

Um total de 88 amostras FFPE de 13 pacientes com câncer de ovário seroso de alto grau primário foram estudados. 14 amostras de epitélio trompa de Falópio normais, incluindo 10 indivíduos saudáveis ​​e 4 tubos contralateral não envolvidas de pacientes com câncer foram usados ​​como referência. Um esquema da amostra de pacientes e selecção de amostras é representado na Figura 1.

Para todos os 13 casos, 5-9 amostras de tecido estavam disponíveis. Em dez pacientes com tumores bilaterais, as amostras foram obtidas a partir de ambos os ovários

H . Secções E manchadas de todas as amostras embebidos em parafina foram revisadas por um patologista experiente (SA) para caracterizar o tipo histológico, o percentual de tumor invasivo viável células, fibrose ou necrose, porcentagem de infiltração de células inflamatórias, e frequência de mitoses.

Extração de Proteínas

Todas as amostras de tecido do mesmo paciente foram processados ​​simultaneamente. Extracção de proteínas foi realizada como previamente descrito [24]. Resumidamente, secções de tecido FFPE foram desparafinadas, e as proteínas foram extraídas com tampão de EXB Plus e tratamento térmico (Qiagen, Hilden, Alemanha). 2-7 secções com uma espessura de 10 um foram processados ​​em 100-170 ul de tampão de extracção. O ensaio de proteína de Bradford (BioRad, Hercules, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante para determinar as concentrações de proteína. As concentrações de proteínas foram ajustadas a 2 mg /ml com mais tampão EXB. Um Western blot de sondagem para β-actina foi realizada a partir de lisados ​​seleccionados aleatoriamente (n = 11) para demonstrar a extracção de proteínas bem sucedida e adequabilidade para análise de array de proteínas de fase inversa. Todos os lisados ​​de proteína produzida uma banda clara β-actina na Western blot.

Análise de Expressão de Proteína por Protein Arrays fase reversa (RPPA)

Os níveis de 36 proteínas, incluindo 15 proteínas fosforiladas foram expressão determinada por RPPA. Os anticorpos e as condições experimentais encontram-se resumidos na Tabela S1. RPPAs foram gerados utilizando o SpotBot® extremo observador Microarray de acordo com as instruções do fabricante (Arrayit, Sunnyvale, CA 94089, EUA). Para cada lisado e diluição (ajustado (2 mg /ml), 1:02, 1:04, 1:08, 1:16, tampão de extração), 2 repetições foram aplicadas sobre uma lâmina de vidro revestida de nitrocelulose (Grace Bio-Labs, bend, EUA), que produziu 12 pontos de dados por amostra.

a imunodetecção foi realizada semelhante para análise de Western blot, e tal como anteriormente descrito [25]. Para a estimativa da quantidade de proteína total, as matrizes foram coradas em paralelo com Sypro rubi Proteína mancha Mancha (Molecular Probes, Eugene, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Mais detalhes sobre a metodologia RPPA, validação e reprodutibilidade técnica foram previamente descritos [23], [25]. Todos os anticorpos utilizados neste estudo foram validados para a especificidade por análise de Western blot.

Análise estatística

heterogeneidade intratumoral, bem como a gama da expressão de proteínas entre diferentes pacientes (variação inter-individual), e a variabilidade da expressão da proteína entre o epitélio Falópio de indivíduos saudáveis ​​foram avaliados usando o

coeficiente de variação

(CV). O CV, definida como a razão do desvio padrão para a média multiplicado por 100, fornece uma medida relativa para a variação independente dos valores absolutos, e, portanto, permite comparar a variação de proteínas com diferentes níveis de expressão absolutos.

heterogeneidade intratumoral foi avaliada separadamente para cada proteína pelo cálculo do CV de todas as amostras de tumor primário do mesmo doente. Como resumo estatístico, o (RMS) da média da raiz quadrada média dos CV [26] foi calculado para incluir todos os 13 pacientes para avaliar a heterogeneidade intratumoral geral para uma determinada proteína.

A variação entre os tumores de diferentes pacientes foi avaliada para cada proteína individual por meio do cálculo do CV de valores médios de expressão entre os diferentes pacientes. Os resultados são apresentados graficamente usando box-plots mostrando o valor da expressão mediana, 25

th e 75

th quartis, e bigodes (1,5 vezes o intervalo interquartil) para cada paciente.

O teste de Friedman foi usado para comparar currículos para diferentes proteínas e o teste de Mann Whitney foi utilizado para comparar a expressão da proteína entre grupos de amostras não relacionadas a um nível dois lados 5% de significância. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando IBM Estatística (IBM Corporation, versão 19.0).

Para comparar a expressão da proteína entre os tecidos normais e tumorais e visualizar variação entre amostras de pacientes individuais, o agrupamento não-supervisionado hierárquica foi realizada utilizando Cluster e TreeView software [27]. Após a transformação log e centralização de valores medianos, agrupamento hierárquico médio foi realizada para o cálculo de Spearman.

Resultados

morfológica Avaliação de amostras de tecido

Todas as amostras apresentaram um celularidade do tumor 70% e 10% de células inflamatórias. Não houve diferenças significativas no conteúdo epitelial de células de tumor e estroma tumoral ou infiltrados de células inflamatórias entre as amostras do mesmo paciente. Além disso, não foram identificadas diferenças regionais na atividade mitótica entre as amostras do mesmo paciente.

intratumoral heterogeneidade dos níveis de proteína

Todos os 36 proteínas analisadas neste estudo mostrou considerável heterogeneidade intratumoral com um CV médio de 25% (intervalo de 17-53%) (Tabela 1 e Tabela S2). O grau de heterogeneidade intratumoral diferia entre as 36 proteínas estudadas (p = 0,005), com p4EBP1, pp44 /42 MAPK e VEGF mostrando maior variabilidade, e EGFR, JNK /SAPK e p38MPK mostrando menos variabilidade dentro de tumores individuais. Não houve diferença significativa na extensão de heterogeneidade intratumoral entre fosforilada (média CV 28%) e não-fosforilada (média CV 23%) de proteínas (p = 0,252). A heterogeneidade intratumoral de todas as proteínas está resumida na Tabela S2. A figura 2 ilustra a heterogeneidade intratumoral para as proteínas exemplares de VEGF, VEGFR p1068EGFR e EGFR.

Os diagramas de caixa mostram a mediana (linha dentro da caixa), percentis 25 e 75, e bigodes estão mostrando 1,5 vezes o intervalo interquartil.

variação dos níveis de proteína entre os pacientes

a variação da expressão da proteína entre os diferentes pacientes foi semelhante ao grau de heterogeneidade intratumoral com um CV médio de 21% (intervalo de 12- 48%). A variabilidade inter-pacientes diferiram significativamente entre as proteínas analisadas. Enquanto Hif1α, PDGF e PI3K apresentaram baixa variação entre todos os pacientes analisados, p4EBP1, pp44 /42 MAPK e p1068EGFR mostrou uma alta variabilidade inter-paciente. Variação entre diferentes pacientes não foi significativamente diferente para fosforilada (média CV 25%) e não-fosforilada (média CV 18%) proteínas (p = 0,072). Tabela S2 resume a variação entre os diferentes pacientes para todas as proteínas. A Figura 2 ilustra a variação entre os pacientes para as proteínas exemplificativas VEGF, VEGFR, EGFR e p1068EGFR.

variação inter-pacientes de expressão da proteína também foi avaliada por epitélio normal da serosa trompas de Falópio de indivíduos saudáveis ​​e para morfologicamente normais contralateral tubos de pacientes com câncer. A variabilidade inter-pacientes do epitélio tubário de indivíduos saudáveis ​​(média CV 27%, intervalo 14-47%) foi semelhante à variação inter-individual de tubos contralateral de pacientes com câncer (média CV 31%, intervalo de 3-78%). Em geral, a variação do epitélio normal, seroso entre diferentes indivíduos estava numa gama semelhante em comparação com a variação entre os tumores de diferentes doentes (21%). A variabilidade não foi diferente entre as proteínas fosforiladas e não-fosforilados em qualquer tipo de tecido de referência. Os resultados são resumidos na Tabela 1.

A variação entre amostras tumorais individuais apreciadas pela Hierarchical Clustering

Para avaliar a variação entre amostras de tumores individuais que realizamos agrupamento hierárquico não supervisionado de todas as 88 amostras tumorais tomadas individualmente a partir de 13 pacientes com base na expressão de todas as 36 proteínas analisadas (Figura 3). As amostras do mesmo paciente agrupados de forma mais estreita em comparação com amostras de doentes diferentes. No entanto, as amostras de quatro pacientes (pacientes 3, 4, 6, 11) foram espalhados por todo todos os clusters, e para os pacientes restantes duas ou mais amostras por paciente não agrupar com o resto. Não havia nenhum paciente para o qual todas as amostras agrupadas (Figura 3).

Diferentes pacientes são como indicado na legenda da figura codificados por cores. expressão relativa alta de proteínas é apresentada na expressão vermelho e baixo na cor verde. espaços cinzentos indicam falta pontos de dados.

Relevância da Heterogeneidade de Distinção entre Tumor Versus tecido normal

Clustering de tumor contra o tecido normal.

Foi avaliada a influência da heterogeneidade na classificação molecular de amostras de tecidos distintos como cancerosas ou normais com base no agrupamento hierárquico. Não havia separação evidente de amostras de tumor seroso contra epitélio normal quando utilizando todas as amostras de tumor individuais por capa (dados não mostrados). Em contraste, a análise dos valores de expressão médios para cada tumor resultou em muito boa separação de tecidos normais e tumorais (Figura S1).

expressão de proteínas diferencial em tumor contra o tecido normal.

A seguir, avaliada diferenças na expressão de proteínas entre o câncer de ovário e epitélio serosa normais, quer por tomar selecionados aleatoriamente amostras únicas por caso ou os valores médios de expressão da proteína. A análise foi repetida três vezes com três diferentes amostras únicas selecionados aleatoriamente por caso e os resultados foram comparados com aqueles obtidos utilizando a valores de expressão por caso significa como padrão de referência.

Dezesseis proteínas identificadas como diferencialmente expressos usando os valores médios de expressão todas as amostras por tumor (AKT, pAKT, Angiopoietina 2, B-Raf, p1068EGFR, p1148EGFR, FAK, pGSK-3β, pGSK-3β, HIF-1α, JNK /SAPK, mTOR, pmTOR, p38 MAPK, pPRAS40, PRAS40, PTEN , pPDGFR, S6RP) não foram detectados ao analisar selecionados aleatoriamente amostras únicas por caso. Dez proteínas, ou seja, Pb-Raf, EGFR, HER2, 4E-BP1, pPTEN, pVEGFR, VEGF, VEGFR, pS6RP, e VHL foram identificados como diferencialmente expressos por todas as quatro abordagens. PI3K e pHER2 foram identificados como diferencialmente expressos apenas em amostras únicas. Os valores de p para todas as proteínas identificadas como diferencialmente expressos em pelo menos uma abordagem encontram-se resumidos na Tabela 2.

Discussão

Encontrámos considerável heterogeneidade intratumoral na expressão de proteínas relacionadas com biomarcadores vias de sinalização celular em carcinoma de ovário seroso de alto grau. Todas as 36 proteínas analisadas através de array de proteínas de fase inversa (RPPA) mostrou uma heterogeneidade acentuada no cancro do ovário primário com um coeficiente médio de variação (CV) de 25% (intervalo de 17-53%) dentro de um tumor individual. Um grau semelhante de variação foi observada entre diferentes pacientes com um CV médio de 21% (intervalo de 12-48%). Nossos resultados sugerem que o viés de amostragem significativa pode ser introduzida quando da análise de amostras únicas de um tumor primário para a avaliação de biomarcadores de proteína. Embora todas as proteínas candidatas 36 mostrou considerável heterogeneidade intratumoral, a extensão total da heterogeneidade foi diferente para proteínas específicas com p4EBP1, pp44 /42 MAPK e VEGF mostrando maior variabilidade e EGFR, JNK /SAPK e p38MPK mostrando menos variabilidade. Não houve diferença no grau de heterogeneidade entre as proteínas fosforiladas e não-fosforilados, o que sugere que as formas activadas de proteínas de sinalização celular pode ser avaliada com fiabilidade semelhante.

Um estudo anterior no cancro da mama detectado um grau semelhante de intratumoral heterogeneidade na expressão da proteína (média CV 31%) [23]. Em contraste, a variação da expressão da proteína entre os diferentes pacientes era consideravelmente mais baixa em comparação com o cancro do ovário do cancro da mama (média CV 21% vs 51%). Uma possível explicação é um grupo de pacientes mais homogênea em nosso estudo constituído exclusivamente carcinomas serosos de alta qualidade, que compartilham um caminho patogênico comum e, portanto, são geneticamente menos heterogénea que diferentes tipos de cancros da mama [28]. O estudo do cancro da mama incluiu diferentes subtipos morfológicos e moleculares, tais como cancros da mama com receptores hormonais positivos, HER2-positivo e triplo negativo, o que pode ter contribuído para uma maior variação na expressão da proteína entre os tumores de diferentes doentes.

A presença de diferentes clones de células tumorais é uma fonte potencial de heterogeneidade intratumoral na expressão da proteína. Um estudo recente demonstrou considerável heterogeneidade intratumoral clonal de cancro do ovário com base na auto-renovação e diferenciação tumorigénico de células de tumor derivadas de um carcinoma do ovário única clara de células [29]. Outro estudo relatou heterogeneidade intratumoral clonal e a variação entre os tumores primários e metástases para a perda de heterozigosidade de cromossomas 17q 18q e, em carcinomas do ovário serosas avançada [30]. Do mesmo modo, a ampla heterogeneidade clonal foi recentemente demonstrado para o carcinoma de células renais [31]. Uma análise abrangente de clonalidade de células tumorais que exigem dados de DNA, RNA e os níveis de proteína, que foi além do escopo deste estudo integrado. No entanto, uma única explicação para as variações consideráveis ​​na expressão de proteínas de sinalização celulares encontrados no nosso estudo é menos provável. carcinomas serosos de alta qualidade são geralmente caracterizadas pela alta proliferativa e atividade mitótica [28]. Embora as diferenças em crescimento tumoral e proliferação celular pode ter até certo ponto contribuíram para a heterogeneidade intratumoral, não identificamos diferenças regionais na proliferação de células tumorais com base na avaliação morfológica de mitoses. Outra explicação possível para a heterogeneidade intratumoral é a composição celular de cancro do ovário serosas. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas no conteúdo da célula tumor epitelial e estroma tumor ou células inflamatórias se infiltra entre as amostras do mesmo paciente.

Estudos anteriores relataram um menor grau de variação intratumoral da expressão da proteína no cancro do ovário. Dois estudos da década de 1990 encontraram baixa variação da expressão da proteína entre as diferentes áreas de 9 carcinomas ovarianos primários [32] ou entre os locais primários e metastáticos de 12 cancros do ovário epiteliais [33] usando eletroforese em gel de 2-dimensional e imuno-histoquímica, respectivamente. No entanto, o número de tumores em ambos os estudos foi relativamente pequeno. Uma série recente incluindo 123 de alto grau carcinomas de ovário seroso com tumores ovarianos emparelhados e metástases do omento expressão de dez proteínas avaliadas por imunohistoquímica, incluindo marcadores de subtipo de tumor, microambiente e adesão celular [34]. Os autores demonstraram que a maioria das proteínas, incluindo marcadores de diagnóstico comumente utilizados, tais como p53, WT1, CA125 e p16 não apresentaram diferenças significativas na expressão entre câncer ovariano primário e metástases peritoneal ou omental. Dois marcadores de resposta do tumor estromal (PDGFRB, SPARC) apresentaram expressão diferencial marcante entre ovariana primária e amostras de tumores metastáticos [28]. No entanto, uma comparação direta do nosso estudo com os relatórios anteriores é limitada pela falta de critérios uniformes para avaliação da heterogeneidade e falta de medidas estatísticas para a variação intratumoral. Além disso, estudos anteriores têm muitas vezes comparado primário cancros do ovário e lesões metastáticas Considerando que o nosso estudo incidiu exclusivamente sobre a variação dentro de uma única câncer primário. Uma possível explicação para o maior grau de heterogeneidade intratumoral em expressão de proteína observada neste estudo, pode ser a mais extensa amostragem de tumores ovarianos primários em 5-9 locais diferentes, bem como a resolução maior quantitativo de análise RPPA.

Para avaliar ainda mais a variação entre amostras de tumores individuais que realizamos agrupamento hierárquico não supervisionado. Apesar de termos observado um grau semelhante de heterogeneidade dentro de um tumor e entre tumores de diferentes doentes com base no coeficiente de variação, as amostras do mesmo paciente agrupados de forma mais estreita em comparação com amostras de doentes diferentes. Isto pode indicar que, apesar de um elevado grau de heterogeneidade em valores de expressão quantitativa de proteína, uma abordagem baseada na classificação como cluster pode ser menos afectada. Da mesma forma, uma análise global de proteínas em uma rede de sinalização, tendo em conta expressão relativa e classificação de proteínas individuais, pode ser menos afetado pela heterogeneidade.

A expressão de célula de proteínas de sinalização também está sendo usado como um biomarcador de diagnóstico para distinguir tumor do tecido normal associado. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa na sinalização celular expressão da proteína entre o câncer de ovário e epitélio serosa normal. No entanto, quando os valores de várias amostras de tumor por expressão foram combinados, foi detectada uma diferença significativa na expressão entre o cancro e o epitélio normal para a maioria de proteínas. Isso destaca a importância da amostragem múltipla. Uma abordagem prática em estudos futuros pode ser a de reunir várias amostras de diferentes regiões de um tumor individual antes da análise.

Em comparação, nós também avaliou a variação fisiológica da expressão da proteína no epitélio tubário serosa normal. Por razões técnicas e disponibilidade limitada de amostras de tecidos normais, não poderíamos comparar diferentes amostras do mesmo paciente. Entre o epitélio serosa normal a partir de diferentes pacientes observou-se uma variação semelhante (média CV 27-31%) em comparação com a variação entre os cânceres de ovário, de diferentes pacientes (média CV 21%).

Para excluir viés devido à técnica variações que anteriormente avaliou a reprodutibilidade técnica de quantificação de proteínas. Alta reprodutibilidade das medidas de proteína de extrações independentes e de análises independentes RPPA foi demonstrado [23] e, portanto, não encontramos nenhuma razão para acreditar que a heterogeneidade na expressão da proteína detectada neste estudo foi atribuível às variações técnicas.

Limitações o presente estudo incluem o número de casos e amostras de tumores individuais (n = 88). Analisamos heterogeneidade macroscópica, enquanto que diferenças em um nível celular não foram avaliados. Uma força importante é o grupo de pacientes altamente homogéneo, que compreende exclusivamente cancros do ovário seroso de alto grau conhecidos para compartilhar vias moleculares comuns, bem como o grande amostragem dos tumores em 5-9 áreas diferentes. Foram analisados ​​diferentes regiões dentro de cada cancro do ovário primário e não comparar lesões primários e metastáticos.

Em conclusão, a heterogeneidade intratumoral pode levar a viés de amostragem e avaliação fiável da expressão da proteína de sinalização celular no cancro do ovário para a avaliação do prognóstico ou biomarcadores preditivos deve incluir amostragem do tumor primário em vários locais diferentes.

Informações de Apoio

Figura S1.

Comparação de tumor contra o tecido normal por agrupamento hierárquico não supervisionado de 13 tumores e 14 amostras de epitélio serosa normal, com base em valores de expressão de proteína médios por tumor. Diferentes pacientes são codificados por cores, como indicado na legenda da figura. Principais clusters identificados pelo software são nomeados grupos A e B. expressão relativa alta de proteínas é apresentada na expressão vermelho e baixo na cor verde. espaços cinzentos indicam falta pontos de dados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s001

(DOC)

Tabela S1.

anticorpos e condições utilizados para a detecção de proteínas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s002

(DOC)

Tabela S2.

heterogeneidade intratumoral e variação entre os pacientes para a expressão de proteínas 36 avaliada por matrizes de fase reversa da proteína (CV, coeficiente de variação)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s003

(DOC)

Reconhecimentos

os autores gostariam de agradecer ao Munich Biobank Aliança do cluster M4 e Claudia Wolff para discussões e comentários úteis e Simone Keller para fornecer anticorpo JNK /SAPK.