Pig
Abstract
Fundo
O pulmão é um local frequente de cancro colorectal ( CRC) metástases. Após a ressecção cirúrgica, metástases pulmonares recorrências têm sido relacionados com a presença de micrometástases, potencialmente acessível a uma quimioterapia de alta dose administrada através de adjuvante isolado perfusão pulmonar (PLI). Procuramos determinar
in vitro
a droga mais eficiente quando administrado a linhas celulares de CRC durante uma curta exposição e
in vivo
sua tolerância imediata e tardia, quando administrado via ILP.
Métodos
primeiro, a eficácia de várias moléculas citotóxicas contra um painel de linhas celulares de CRC humanos foi testado
in vitro utilizando o ensaio de
citotóxica depois de uma exposição de 30 minutos. Então, no início (operacional) e tardia (1 mês) tolerância de duas concentrações da molécula administrada via ILP foi testado em 19 porcos adultos usando hemodinâmica, biológicos e critérios histológicos.
Resultados
In vitro
, gemcitabina (GEM) foi a droga mais eficaz contra linhas celulares de CRC selecionados.
In vivo
, GEM foi administrado através de PLI em (/ml 100 ug) concentrações normal (20 ug /ml) ou alta. administração GEM foi associada com a vasoconstrição pulmonar e transitória dependente da dose, conduzindo a uma diminuição no fluxo voluntária da bomba, a fim de manter uma pressão arterial pulmonar estável. Após esta modulação, ILP usando GEM não foi associada a qualquer fuga sistémica, danos sistêmica e toxicidade pulmonar histológico agudo ou retardado. Estudos farmacocinéticos revelou absorção dependente da dose associada com a distribuição heterogênea da molécula para o parênquima pulmonar, e citotoxicidade persistente do efluente venoso.
Conclusões
GEM é eficaz contra as células CRC, mesmo após uma exposição curta . ILP com GEM é uma técnica segura e reprodutível
Citation:. Pagès P-B, Facy O, Mordant P, Ladoire S, Magnin G, Lokiec F, et al. (2013) Isolado perfusão pulmonar como tratamento adjuvante do cancro colorectal metástases pulmonares: Um estudo pré-clínico em um modelo suíno. PLoS ONE 8 (3): e59485. doi: 10.1371 /journal.pone.0059485
editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 23 Agosto, 2012; Aceito: 14 de fevereiro de 2013; Publicação: 18 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Pagès et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo francês Liga Nacional contra o cancro [SW /SP-116F.2010] e do Comité Científico da Escola de Medicina de Dijon, França. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cerca de 11% dos pacientes que sofrem de cancro colorectal (CRC) acabará por desenvolver metástases pulmonares [1]. Esta condição está associada com taxas de sobrevivência de 5 anos que variam de 5 a 50%, de acordo com a possibilidade de alcançar a ressecção cirúrgica completa [2] – [7]. Apesar de ressecção cirúrgica, recorrência pulmonar ocorre em mais de 40% dos pacientes, provavelmente devido à micrometástases que já estavam presentes durante o procedimento inicial [3]. A quimioterapia adjuvante melhora livre de progressão, mas não sobrevida global [8], eo aumento da dose sistêmica está associada com toxicidades inaceitáveis [9].
O tumor e controle completos de metástases sempre foi a pedra angular de terapias anticâncer. Além disso, dados recentes indicam que a metástase é um processo pelo qual as células cancerosas multidireccional pode semear locais distantes, bem como o próprio tumor primário [10]. Este processo posterior, conhecido como “auto-semeadura,” foi validado em diversos modelos experimentais [11], e constituem um forte argumento a favor do controle local de doenças metastáticas.
A fim de diminuir a recorrência de metástases pulmonares de CRC, alguns autores desenvolveram a técnica de perfusão isolada do pulmão (PLI) [12], o que permite aumentar a dose do agente citotóxico entregue ao tecido pulmonar sem exposição sistémica. Esta técnica tem sido provado ser segura e eficaz contra metástases pulmonares CRC em modelo de roedor [13] – [17]. Os principais objetivos deste estudo foram determinar
in vitro
a droga mais eficiente quando administrado a linhas celulares de CRC durante uma curta exposição e
in vivo
sua tolerância imediata e tardia, quando administrado via ILP em um modelo suíno.
Materiais e Métodos
In vitro Anti tumoral Efeito
As linhas celulares.
um painel de linhas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano (HT29, HCT8, HCT116, SW480) foi escolhida para representar a diversidade de CRC sensibilidade quimioterapia e estado mutacional (Tabela 1), adquirida de American Tissue and Cell Colecção (ATCC, Rockville, MD, EUA) e mantidas em cultura como recomendado.
compostos
os seguintes compostos foram escolhidos como as drogas mais eficientes contra a CRC no cenário clínico [18] – [19]:. gemcitabina (GEM) (Gemzar®, Lilly) , cisplatina (cisplatina Mylan®, Mylan), 5 fluorouracil (5-FU) (fluorouracile Accord®, Accord Healthcare), oxaliplatina (Eloxatine®, Sanofi), Raltritexed (Tomudex®, Hospira) e irinotecano (Campto®, Pfizer).
ensaio de citotoxicidade.
efeito anti tumoral destes compostos foi determinado utilizando o ensaio citotóxico, como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 24 cavidades, deixou-se crescer até confluência em 24 horas, e expostos a compostos seleccionados, isoladamente ou em combinação, durante 30 minutos. Após 4 dias, as células foram coradas com violeta de cristal, e a absorvância foi medida em cada poço por um fotómetro automática (filtro de 590 nm, Spectra-A®, Varian, França). A sobrevivência celular foi calculada como a percentagem de absorvância no tratado
vs
poços não tratados, e IC50 (concentração alcançar uma inibição do crescimento de 50% das células) foram determinados. A droga mais eficiente foi definido como o composto com o menor IC 50 [20], e testado em combinação com o segundo composto mais eficiente.
Isolado perfusão pulmonar
Animais.
Três meses de idade grandes porcos brancos (n = 19), pesando 50 ± 3 kg cada, foram adquiridos a Hazotte (Beaumont, França). Os animais foram deixados para se aclimatar ao ambiente do laboratório durante 7 dias, com livre acesso a comida e água. Experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Borgonha, França (A0809).
Anestesia.
Os animais foram anestesiados como descrito anteriormente [21]. A pressão arterial sistêmica foi monitorada através de um cateter inserido na artéria do úmero. O ritmo cardíaco, eletrocardiograma, temperatura nasal, a saturação de oxigênio no sangue foram monitorizados usando o sistema NICO (Novametrix Medical Systems, Wallingford, CT). A heparina não fraccionada (100 IU /kg) foi administrada antes da exclusão vascular do pulmão. Para alcançar analgesia peri-operatória, 20 mL de ropivacaína a 0,75% foram injetados na pele e parede torácica perilesional. Tramadol e paracetamol foram prescritos no pós-operatório em intervalos regulares.
Técnica Cirúrgica.
Depois de ter colocado o animal em decúbito lateral direito, toracotomia póstero-lateral esquerda foi realizada no quarto espaço intercostal . Pericárdio foi aberto amplamente, ea artéria esquerda principal pulmonar (IMPA) e ambas as veias pulmonares esquerdas (LPV) foram isolados. A canulação foi realizada utilizando um metal derrubado cânula direito do anguled (High Flow Arco Aórtico cânula 3,8 mm, de Terumo®, Ann Arbor, EUA) inserido no IMPA e uma cânula venosa (DLP do Coração Esquerdo respiradouro cateter, Medtronic®, Minneapolis, EUA) inserido na convergência das LPVs via a aurícula esquerda (LA). Uma linha do monitor foi inserido na origem do IMPA. O IMPA e LA foram de preso, o pulmão esquerdo foi ventilado e do brônquio principal esquerdo foi enlaçados para ocluir arterial brônquica [22].
Isolado perfusão pulmonar.
O sistema de circulação extracorpórea composta uma bomba (Biomedicus®, Minneapolis, EUA), trocador de calor, reservatório e tubo de PVC com diâmetro de ¼ de polegada. Escorva foi conseguida com uma solução contendo 850 ml de voluven (6% hidroxietilamido 130 /0,4) e 150 ml de sangue da circulação pulmonar. Após o início da perfusão, o caudal da bomba foi gradualmente aumentada para obter uma média IMPA pressão equivalente à pressão antes da oclusão. A quimioterapia foi em seguida injectada no circuito [23], o fluxo da bomba foi modulado para estabilizar a pressão média IMPA, e quimioterapia durou perfusão durante 30 min seguido por um período de 15 min de lavagem. Aos 5, 10, 20 e 30 minutos da perfusão, foram tomadas amostras de sangue sistémicos. Aos 30 min de perfusão, duas amostras pulmonares foram tiradas para medir a concentração de droga no tecido pulmonar e para avaliar a lesão pulmonar aguda histológica. As amostras de fluido foram tomadas no circuito de perfusão para medir a concentração da droga, e efluentes do pulmão foi desenhado para avaliar o seu efeito citotóxico sobre células tumorais in
in vitro
. No final do procedimento, cânulas foram retirados, toracotomia foi encerrada em um tubo no peito temporária, e os animais foram despertados.
Os grupos experimentais.
estudo de Fase I definiu uma dose máxima tolerada seguinte uma infusão IV de 30 minutos de GEM equivalente a dose sistémica de 20 ug /ml /h [24]. Como uma projecção, a concentração de GEM utilizado para PLI foi 0 ug /ml (grupo de controlo, n = 5), 20 ug /ml (grupo de dose normal, n = 7 animais) e 100 ug /ml (grupo de dose elevada, n = 7).
Farmacocinética.
Para determinar a concentração de GEM em amostras de sangue e do parênquima pulmonar, as amostras foram spin-seco a 4 ° C e 12.000 G durante 10 minutos. Quantificação de GEM no plasma e, em seguida, surpernatant foi alcançado utilizando o sistema de alto desempenho cromatografia líquida (HPLC) de fase inversa isocatic como previamente descrito [25]. Concentração de GEM no final da PLI foi estabelecido no circuito, em duas biópsias pulmonares diferentes, e na circulação sistémica. citotoxicidade residual do efluente venoso foi estudada utilizando diluições em série e em ensaio citotóxico vitro.
toxicidade sistêmica aguda.
O procedimento ILP foi realizado em dezenove porcos. A toxicidade sistémica de GEM foi avaliada por medição da função hepática e renal. tolerância hemodinâmica foi avaliada pelo registro da frequência cardíaca e da pressão arterial sistêmica.
toxicidade pulmonar aguda.
tolerância respiratória foi avaliada através da gravação de pressão média IMPA, oxiemoglobina saturação (SpO2) e da pressão parcial de dióxido de carbono durante a expiração (PCO2). A gravidade das lesões pulmonares foi avaliada histologicamente usando a pontuação Chiang, que foi criado para avaliar a lesão pulmonar aguda após a sequência de isquemia /reperfusão dos pulmões transplantados [26]. Resumidamente, esse escore lesões como edema e infiltração de células estima. Edema é classificada como 1 para o edema perivascular; 2 para edema peribrônquico ou intersticial; 3 para o edema alveolar. infiltração de células é classificada como 2 para infiltração de células perivascular; 3 para a infiltração celular intersticial; 4, para a infiltração de células alveolares. A soma de todas as pontuações patológicas foi a pontuação para cada escopo e, em seguida, foi calculada a pontuação média para o pulmão esquerdo pela soma da parte superior e a pontuação lobo inferior, sendo 0 uma pontuação normal.
toxicidade retardada.
Depois de um mês de follow-up, doze animais foram reoperados. toxicidade retardada foi avaliada usando os mesmos métodos e os critérios tal como descrito para a toxicidade aguda. Os animais foram então sacrificados com uma injeção intracardíaca de pentobarbital (Dolethal®, Vetoquinol).
A análise estatística.
As variáveis categóricas foram relatados como números e proporções. variáveis contínuas normais são relatados como média ± desvio padrão. Em relação aos parâmetros hemodinâmicos, foram comparados os valores médios moderados de um modo repetido para o mesmo animal por medidas repetidas ANOVA. A regressão linear foi realizada para estimar a correlação entre variáveis contínuas. Quando os resultados da análise de variância foram estatisticamente significativas (p 0,05), foi realizada uma
posthoc
comparação usando o método de Benferroni para reduzir o risco α. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico STATA 12 (StataCorp, College Station, EUA).
Resultados
citotóxica Ensaio
Administrada através de uma exposição curta, GEM foi mais eficiente de 5-FU, cisplatina, oxaliplatina e irinotecano (Figura 1 A B). Raltitrexed mostrou a mesma eficácia que GEM em HCT8 e HT29, mas não em células HCT116 e SW480. Adjunção de raltitrexed a GEM não aumentou a citotoxicidade (Figura 1 C). Portanto, GEM sozinho foi selecionado para o procedimento ILP.
A- valores IC50 após a exposição in vitro de 30 min de células CRC SW480, HT28, HCT116 e HCT8 com oxaliplatina, 5 FU, cisplatina, GEM, irinotecano e raltitrexeda. B- curvas de dose-resposta após exposição in vitro durante 30 min de células de CRC SW480, HT28, HCT116 e HCT8 com oxaliplatina, 5-FU, cisplatina, Gema, irinotecano e Raltitrexeda. curvas C- dose-resposta após a exposição in vitro de 30 min de células CRC SW480, HT28, HCT116 e HCT8 com a combinação de GEM e Raltitrexed.
Farmacocinética
Após 30 min de perfusão, a concentração de GEM foi maior para a dose elevada do que para o grupo de dose regular, quando medido no circuito (74,29 ± 18,06 vs 22,85 ± 6,51 ug /mL, respectivamente, p = 0,0001) e no parênquima pulmonar (141,46 ± 117,07 pg /g vs 56,91 ± 28,06 mg /g, respectivamente, p = 0,014). Ensaio de citotoxicidade mostrou um efeito citotóxico mantida do efluente de pulmão no fim da PLI, sem diferença entre a dose regular e o grupo de dose elevada mesmo para a diluição a 10% do efluente do pulmão (Figura 2). Na circulação sistémica, a concentração máxima de GEM após a ILP foi 0,638 ± 0,27 ug /ml para o grupo de dose elevada e 0,248 ± 0,15 g /ml do grupo de dose regular (Tabela 2).
As células foram expostos a diferentes diluições (10%, 50% e 100%) do efluente pulmão.
aguda Toxicidade sistémica
em relação à tolerância hemodinâmica sistêmica, não houve mudança significativa na pressão arterial, a frequência cardíaca, e electrocardiograma, tal como determinado antes, durante, e depois do procedimento (Tabela 3). Nenhum grande fígado ou toxicidade renal aguda foi observada (Tabela 4).
pulmonar agudo Toxicidade
Antes de aperto, variações individuais na pressão média IMPA foi observado no início do estudo, com valores que variam de 18 a 34 mmHg. Após fixação, o fluxo de perfusão foi aumentada progressivamente para atingir um fluxo de entrada de 500 a 600 ml /min. Nos grupos gem, a pressão média IMPA gradualmente aumentada, levando a uma diminuição do fluxo da bomba extracorporal para manter a pressão IMPA média inicial (Figura 3A). Como consequência, a pressão média IMPA não foi significativamente diferente entre os três grupos (figura 3B), mas a perfusão influxo significativo aos 30 min foi menor nos grupos gem do que no grupo de controlo (Figura 3A). Houve uma correlação inversa entre a concentração de GEM no circuito de perfusão, a vazão média após 30 min de perfusão (p = 0,0158). Não houve diferença na pressão IMPA médio antes e após a PIM (p = 0,7187, Figura 3C). As análises histológicas revelaram uma pontuação média Chiang de 5,05 ± 3,52 no grupo controle, sem diferença significativa entre os grupos GEM. Também não houve correlação entre a Chiang marcar ea dose GEM infundido (p = 0,7491, Tabela 5) ou a concentração GEM no parênquima pulmonar (p = 0,7278).
influxo A- perfusão no pulmão isolado perfundidos com gelatina (580 ± 178,88 ml /min), GEM 20 ug /ml (257,14 ± 202.62 ml /min) e GEM 100 ug /ml (210 +/- 138,92 ml /min) durante 30 minutos (P = 0,0055). B- pressão de perfusão no pulmão isolado perfundido com gelatina, GEM 20 ug /ml, e GEM 100 ug /ml durante 30 min. C- esquerda média pressão da artéria pulmonar antes e depois ILP com gelatina, GEM 20 mcg /mL e GEM 100 ug /ml durante 30 min (p = 0,7187).
Long Term Toxicidade
Não foi observado necrose pulmonar nem fibrose, macroscopicamente ou microscopicamente. Na maioria das vezes lesões descritas foram edema peribrônquico e infiltrado intersticial. lesões graves, tais como infiltração celular alveolar apenas foram observados para os três primeiros animais do grupo de controlo, que apresentou um edema pulmonar, no final do procedimento ILP relacionado com um rápido aumento do influxo. Não houve correlação entre a concentração GEM no parênquima pulmonar e o escore Chiang (p = 0,0846) (Tabela 5).
Comentários
Inicialmente desenvolvido como um tratamento adjuvante de metástases pulmonares provenientes de sarcomas, ILP tem gerado um interesse considerável por causa da alta taxa de recorrência pulmonar e diminuição da sobrevivência a longo prazo nesta patologia, mesmo após a ressecção cirúrgica completa [3]. potenciais vantagens da ILP incluem a entrega de doses elevadas de quimioterapia para o pulmão, levando a rápida saturação do parênquima pulmonar e fuga sistémica limitada [14], [27] – [29]
O interesse do.
in vitro
ensaio citotóxico é escolher um medicamento de quimioterapia para o procedimento ILP, como sugerido por estudos anteriores. Fazer a ligação
et al
. demonstrou que
in vitro
ensaios poderiam identificar drogas ativas para perfusão artéria hepática individualizada [30]. Kornmann
et al
. mostrou que pacientes com CRC, que demonstrou
in vitro
sensibilidade pode se beneficiar de quimioterapia regional, pâncreas e cólicas com GEM [31]. Ao definir este ensaio preliminar, optamos por um painel de células representando a diversidade de CRC sobre os fatores de crescimento vias de sinalização [32]. Estas vias são segmentados em caso de doença metastática, sozinho ou em combinação com agentes citotóxicos, incluindo oxaliplatina e irinotecano [33]. No entanto, estas duas drogas foram menos eficientes do que GEM seguinte exposição curta, provavelmente porque GEM exibe um efeito dependente da dose, enquanto que o efeito de oxaliplatina e irinotecano é mais dependente do tempo [24], [34], [35].
Até à data, GEM não é um tratamento sistémico padrão de CRC metastizado [33]. No entanto, como foi referido anteriormente, algumas publicações justificar o uso do HTCA para escolher a quimioterapia activa em células CCR durante uma curta exposição de 30 min [30], [31]. Deve notar-se que os fármacos utilizados na perfusão de órgãos isolado, isolado como o pulmão ou fígado de perfusão, não são, necessariamente, as moléculas utilizadas para tratamentos intravenosos. Em oncologia torácica, Hendricks et al. relataram resultados encorajadores em uma fase I de ensaios clínicos utilizando melfalano durante a ILP para tratar metástases pulmonares [22]. Neste estudo, os cancros primários foram carcinoma colorrectal, carcinoma de células renais e sarcoma, e melfalano não era uma terapia padrão de qualquer destes cancros. Da mesma forma, em oncologia hepática, melfalano tem sido relatado para ser associado com a resposta clínica e sobrevivência prolongada seguinte perfusão do fígado isoladas, apesar da sua limitada eficácia após a administração intra venosa [28]. perfusão de órgãos isolados permanece uma técnica experimental realizada apenas por algumas equipes cirúrgicas na clínica, e todos os medicamentos disponíveis para a administração sistêmica não foram testados para a perfusão de órgãos isolados. Uma das principais vantagens de perfusão de órgãos isolado é permitir o uso de doses mais altas de agentes citotóxicos, expandindo assim o número de moléculas disponíveis para obter um efeito anti-tumoral. No entanto, até à data, não há nenhuma publicação na avaliação da eficácia de gemcitabina em metástases pulmonares de CRC no cenário clínico.
Em relação a perfusão dos órgãos isolado, o design escalonamento da dose clássica é inútil se chumbo circuito extra para um estábulo estado expondo o parênquima órgão para concentrações activas associadas a saturação de tecido normal [36]. No nosso estudo, as concentrações utilizadas durante GEM PLI foram 18-40 vezes mais elevada do que
In vitro IC50
, originando concentrações estáveis GEM no circuito ao longo da perfusão, com fugas sistémica mínima. Para ambos os grupos, as concentrações GEM no circuito eram muito maiores (de três a vinte vezes) à encontrada no plasma de pacientes tratados com gema IV [24]. Além disso, a actividade citotóxica do efluente pulmonar demonstrou a persistência de elevadas concentrações de GEM e actividade citotóxica preservada. Estes três elementos indicam uma saturação do parênquima pulmonar como um todo pelo GEM durante o procedimento ILP, mas distribuição espacial continua em dúvida.
Durante a ILP, a pressão de entrada foi mantida equivalente à pressão arterial pulmonar média antes da oclusão para evitar o edema pulmonar e lesão pulmonar aguda [37], [38]. Adjunção de GEM para o circuito foi associado com um aumento da resistência vascular intrapulmonar e subsequente aumento da pressão arterial pulmonar média (PAP). Esta toxicidade vascular transitória do GEM já foi relatado após a administração sistémica, e descrito como uma vasoconstrição transitória associada a uma síndrome de permeabilidade capilar [39]. Nós mostramos que, durante ILP este fenómeno vascular é dependente da dose e reversível, proporcionando que a redução do influxo ILP controla a PAP. Finalmente, encontramos concentrações heterogêneos de GEM no parênquima pulmonar de acordo com a região e qualquer que seja o grupo considerado, como já relatado com outros agentes citotóxicos [40]. Esta heterogeneidade pode ser interpretada como uma consequência de uma vasoconstrição induzida por drogas desigual, e pode ser contrabalançado pela adjunção de vasodilatadores durante a ILP usando GEM.
Maior pontuação histológica Chiang foram encontrados no grupo controle do que no GEM grupo, no final do procedimento e após um mês de sobrevivência. Franke et al. demonstraram que o aumento da pressão pulmonar em um ambiente de ILP irá resultar em efeitos deletérios sobre a morfologia [37], mas em nosso estudo, a pressão de perfusão foi significativamente diferente nos grupos de controlo e GEM. A única diferença significativa na hemodinâmica pulmonar entre os grupos foi maior entrada significativa de perfusão no grupo de controle. Este aumento do fluxo de perfusão pode ser responsável dos efeitos deletérios histológicas.
Este estudo demonstrou que ILP com GEM é uma técnica segura e reprodutível, permitindo a entregar alta dose de quimioterapia para o parênquima pulmonar com sistêmica muito limitada vazamentos. No entanto, transitória associada a GEM e vasoconstrição pulmonar dependente da dose levou a distribuição heterogênea da GEM no parênquima pulmonar. Outras experimentações são necessários para otimizar a distribuição da droga no parênquima pulmonar e para testar a eficácia desta abordagem antes de considerar estudos clínicos.
Reconhecimentos
Agradecemos a Paul Van Schil (Antuérpia, Bélgica ) para a sua espécie de boas-vindas e ensino precisa da técnica cirúrgica. Agradecemos também Valentin Derangere, Jean-Baptiste Lequeu, Thierry Benard, Philip Bastable e Pablo Ortega-Deballon por seu apoio entusiástico para este trabalho.