Abstract
O câncer de ovário é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica. A desregulação da p53 e /ou vias apoptóticas associada a p73 contribuem para a resistência à base de platina no cancro do ovário. Noxa, um BH3-única proteína pro-apoptótica, é identificada como um alvo a transcrição de p53 e /ou p73. Neste estudo, verificou-se que variantes genéticas de proteínas Bcl-2 existem entre as células de cancro do ovário a cisplatina-sensíveis e resistentes ao, e as respostas de Noxa e Bax a cisplatina são regulados principalmente por p53. Foram avaliados ainda mais o efeito de noxa em cisplatina. Noxa induzida apoptose e sensibilizados A2780s e SKOV3 células à cisplatina
in vitro
e
in vivo
. Os efeitos foram mediados pela expressão elevada Bax, a activação de caspase aumentada, libertação de Cit C e Smac para o citosol. Além disso, o silenciamento do gene da Bax ou Smac atenuou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células A2780s quimiossensíveis, ao passo que a sobre-expressão do Bax ou adição de péptido Smac-N7 aumentou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células SKOV3 quimiorresistentes. Para o nosso conhecimento, estes dados sugerem um novo mecanismo pelo qual Noxa chemosensitized células de cancro do ovário a cisplatina, induzindo alterações no eixo Bax /Smac. Tomados em conjunto, os nossos resultados mostram que Noxa é potencialmente útil como um chemosensitizer na terapia do cancro do ovário
Citation:. Lin C, Zhao X-y, Li L, Liu H-y, Cao K, Wan Y, et al. (2012) Noxa Induzida por alterações no eixo Bax /Smac aumentar a sensibilidade das células do cancro do ovário para Cisplatina. PLoS ONE 7 (5): e36722. doi: 10.1371 /journal.pone.0036722
editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América
Recebido: 28 Março, 2012; Aceito: 10 de abril de 2012; Publicado em: 09 de maio de 2012
Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Key Pesquisa básica da China (2010CB529900) e Natural Science Foundation da China (30900744; 81071817 /H1609; 81.001.010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica [1]. Apesar de existirem algumas melhorias, a sobrevivência a longo prazo continua pobre devido a toxicidade dose-dependente, eventual recorrência do tumor e surgimento da doença resistentes aos medicamentos. Para superar esses obstáculos, as investigações têm cada vez mais focado em novas estratégias terapêuticas: modulação da quimio-sensibilidade celular, invertendo a resistência do tumor, e aumentando efeitos terapêuticos da quimioterapia [2]. evidências emergentes sugerem que a via de apoptose desregulada é um dos principais contribuintes para iniciação do tumor, progressão e desenvolvimento de resistência adquirida aos tratamentos anticancerígenos [3], [4].
Como um evento genético comum no carcinoma do ovário, mutação p53 está associada com a resistência à quimioterapia à base de platina [5]. Relatórios recentes têm mostrado que a p73, um membro das proteínas da família p53, é um regulador chave da susceptibilidade apoptose a cisplatina (cis) em células de cancro do ovário A2780 [6], [7], e que o programa de transcrição dependente de p73 é um contribuinte importante para a via de quimiossensibilidade em células de carcinoma do ovário BRCA1 deficiente em [8], indicando que afectam alguns mecanismos de expressão p73 e funções podem contribuir para o desenvolvimento de resistência a apoptose induzida por cisplatina em células de cancro do ovário [7]. Todas estas observações sugerem que a desregulação de vias apoptóticas e /ou associada a p73 dependente de p53 pode contribuir para a resistência à base de platina no cancro do ovário. Assim, a restauração do p53 e /ou via p73, ativando-se ou seus alvos a jusante pode ser uma avenida atraente para melhorar a eficácia de terapias anticâncer.
Noxa foi identificado pela primeira vez como um alvo transcricional de p53 [9], e, recentemente, também foi mostrado para ser regulado transcricionalmente por p73 [8]. Como muitas proteínas da família Bcl-2 que translocação para a mitocôndria e modulam a função mitocondrial, noxa transloca para a mitocôndria e, em seguida, leva a citocromo C (Cit C) libertação e caspase-9 activação, e, em última análise, o que leva à morte da célula [10], [ ,,,0],11]. Noxa funções através da Bax e /ou Bak para induzir a apoptose em algumas células cancerígenas, tais como células HeLa epiteliais humanas de cancro do colo do útero [9], células de melanoma [11], células MCF-7 de cancro da mama humano [12], etc. Além disso, um recente relatório mostrou um potencial terapêutico de noxa no tratamento de cancro da mama humano [12]. No entanto, o papel de Noxa nas respostas terapêuticas de células de cancro do ovário aos medicamentos anticancerígenos à base de platina permanece obscuro.
Neste trabalho, primeiro selecionado (A2780s, IGROV1 e OAW42) sensível à cisplatina e resistente à ( A2780cp, OVCAR-3 e SKOV3) linhas de células de cancro do ovário humano para testar as variações de proteínas pró-apoptóticas e prosurvival família Bcl-2 de expressão. Em seguida, analisámos os níveis de expressão induzida por cisplatina de p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, noxa e Bax em várias linhas celulares de cancro do ovário humano com o estado de p53 diferente incluindo A2780s (p53 de tipo selvagem, p53 WT), SKOV3 ( p53 mutante duplo deleção, p53 – /-), OVCAR-3 (que alberga R248Q mutante p53) e A2780cp (contendo p53 sequência do gene de tipo selvagem, mas que mostra a perda de função de p53) [13], [14]. Descobrimos que p53, p73, p21
WAF1 /cip1, Noxa e Bax foram significativamente induzida pela cisplatina em linhagem de células A2780s tipo p53-selvagem, mas em outras linhas de células de cancro do ovário três p53 mutantes, as expressões de p73, p21
WAF1 /cip1, noxa e Bax permaneceu inalterada. Além disso, as respostas de noxa Bax e a cisplatina são regulados principalmente pelo p53 que não p73 em linhas celulares de cancro do ovário. Considerando a grande função reguladora de p53 em noxa e Bax, dois genes p53 e /ou p73-alvo a jusante, que seleccionado ainda mais a linha celular SKOV3 p53 duplo mutante de deleção como um modelo de resistência intrínseca [15] – [17], e a p53 a linha tipo -wild A2780s célula, o qual foi derivado de um paciente não tratado com carcinoma do ovário principal [17], [18], como um modelo de quimio-sensibilidade intrínseca, para avaliar o efeito de noxa sobre a eficácia quimioterapêutica da cisplatina em A2780s e SKOV3 ovário modelos de cancro
in vitro
e
in vivo
. Descobrimos que noxa induz a apoptose independente de p53 em ambos os A2780s e células SKOV3, e que a expressão elevada de noxa podem aumentar a sensibilidade de células de cancro do ovário a cisplatina através das alterações no eixo Bax /Smac. Para o nosso conhecimento, nós fornecemos nova evidência para o potencial de aplicação de Noxa como um chemosensitizer na terapia do câncer de ovário.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovado pelo Comitê de Assistência e Tratamento Institucional animal de Estado-chave do Laboratório Bioterapia, Universidade de Sichuan.
Materiais
o peptídeo Smac-N7 (AVPIAQKPRQIKIWFQNRRMKWKK) foram adquiridos a partir de Calbiochem, Inc. (San Diego , CA). Ela foi modificada para ser permeável célula por ligação da lisina COOH-terminal para a arginina de um péptido 16-mer Antennapedia homeodom�io através de um ligante de prolina. Os anticorpos primários para transferência de western são como se segue: Anti-Bcl-2 (SC-130307), anti-Bcl-x
L (sc-8392), anti-Mcl-1 (SC-69839), anti-noxa (SC-30209), anti-p53 (DO-1), anti-p73 (H-79), anti-p21
WAF1 /Cip1 e anti-β-actina (Santa Cruz, CA); anti-Bax N-20 (SC-493); anti-caspase-3, anti-caspase-3, anti-caspase-9 e a sua forma clivada (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); anti-Smac (clone FKE02, R D Systems, Minneapolis, MN); anti-Cit C (sc-13156), citocromo oxidase subunidade IV (Molecular Probes).
Os plasmídeos
Ambos pcDNA3.1 (pc3.1) e plasmídeo pcDNA3.1 gene que codifica Noxa Humano (pcDNA3.1-hNOXA, pc3.1-hNoxa) foram purificados por duas rodadas de passagem em colunas EndoFree (Qiagen, Chatsworth, CA), conforme relatado anteriormente [19]. construções pc3.1-Bax foram gerados de acordo com os nossos métodos anteriores [20].
Gene silenciamento com pequenos RNAs de interferência
pequeno RNA de interferência (siRNA) oligonucleotídeos foram adquiridos de Dharmacon (Lafayette, CO ) com sequências de direccionamento Bax (5′-AACUGAUCAGA ACCAUCAUGG-3 ‘) e Smac (5′-AACCCUGUGUGCGGUUCCUAU-3’). Para a construção da Bax e Smac shRNA, o Bax e Smac siRNA foram clonados no pSilencer 2,1-U6 plasmídeo higro
Cultura de células e transfecção
A2780s, IGROV1, OAW42, A2780cp, OVCAR-3. e linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV3 foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA) e cultivadas em DMEM ou RPMI 1640 de cultura contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), respectivamente, a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO
2. A transfecção foi realizada com Lipofectamine ™ 2000 de acordo com as instruções do fabricante
Tratamentos de células no
in vitro
experimentos
A2780s e células SKOV3 foram tratados como se segue:. Control, as células foram deixadas sem tratamento e colhida quando cultivadas durante 72 h. pc3.1 (vector vazio), as células foram transfectadas com pc3.1, e, em seguida, colhidas às 48 h após transfecção. hNOXA, as células transfectadas com pc3.1-hNOXA foram colhidas às 48 h após transfecção. A cisplatina, cisplatina (5 ug /ml) foi adicionado quando as células foram cultivadas durante 48 horas. 24 horas mais tarde, as células foram recolhidas. hNOXA mais cisplatina, as células transfectadas com pc3.1-hNOXA foram adicionados cisplatina (5 ug /ml) às 24 h após transfecção. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram recolhidas.
Para o silenciamento do gene ou a sobre-expressão da Bax e Smac, os siRNAs ou correspondentes plasmídeos foram co-transfectadas com plasmídeos pc3.1 /pc3.1-noxa em A2780s ou SKOV3 células. As células tratadas de cima foram adicionados a cisplatina durante mais 12 horas a 12 horas pós-transf ecção, e em seguida, colhidas às 24 h pós-transfecção.
A detecção de expressão hNOXA
In vitro e
in vivo
para a detecção de expressão hNOXA
in vitro
, as células A2780s foram tratados de acordo com os horários descritos acima. As células colhidas foram usadas para detectar a expressão hNOXA por RT-PCR e western blot, respectivamente. Os tecidos tumorais foram colhidas para detectar a expressão hNOXA
in vivo
por RT-PCR. Os iniciadores utilizados para a amplificação de hNOXA e GAPDH foram os seguintes: noxa-F 5′-AAGAACGCTCAACCGAGC-3’and noxa-R 5′-GGTTCCTGAGCAGAAGAGT-3 ‘; GAPDH-F 5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3 ‘e GAPDH-R 5′-CAT CACGCCACAGTTTCC-3’.
A viabilidade celular e apoptose ensaios
A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT [21] . A apoptose foi avaliada como se segue: de detecção da fragmentação de ADN celular com o ELISA de Detecção de Morte Kit (Roche Diagnostics), análise por Western blot da activação de caspase, a medição de células apoptóticas por citometria de fluxo (coloração de PI para a sub-G1) e Hoechst 33258 coloração. A ELISA celular Detecção de Morte quantificadas as células apoptóticas através da detecção dos fragmentos de ADN associado a histonas (mono- e oligo-nucleossomas) gerados pelas células apoptóticas [20], [22].
análise de citometria de fluxo e Hoechst 33258 coloração
análise citométrica de fluxo foi realizada para identificar as células sub-G1 /células apoptóticas e para medir a percentagem de células sub-G1 em tampão hipotónico, tal como descrito anteriormente [23]. Hoechst 33258 coloração foi realizada accordingto as instruções do fabricante.
RT-PCR semiquantitativo
O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen). RT-PCR semiquantitativo foi feito para amplificar Noxa e GAPDH.
fracionamento subcelular e western blot
fracionamento subcelular foi feito para obter fracções mitocondriais e citosólicas como descrito anteriormente [24]. Os lisados celulares totais foram preparados como descrito previamente [25]. Os lisados de células totais e lisados subfraccionamento foram usadas para análise de Western blot.
modelos animais de tumores e o tratamento
A2780s e células SKOV3 (2 × 10
6 células) foram implantadas s.c. nos flancos direitos de ratinhos nus fêmea de 6 a 8 semanas de idade, respectivamente. Para explorar a eficácia terapêutica de noxa mais cisplatina, que trataram os ratos no dia 10 após a implantação de células tumorais, quando o diâmetro do tumor atingiu ~ 5 mm de diâmetro. Os ratos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos (5 ratos por grupo) e tratou-se com: (a) 0,100 ul de PBS; (B) 0,10 ug pc3.1 plasmídeo /lipossoma 30 ug em 100 ul de PBS; (C) 0,10 ug pc3.1 -hNoxa plasmídeo /lipossoma 30 ug em 100 ul de PBS; (D) 0,100 ul de 0,1 mg de cisplatina (5 mg /kg de peso corporal); (E) 0,10 ug pc3.1-hNoxa plasmídeo /lipossoma 30 ug em 100 ul de PBS e 100 ul de 0,1 mg de cisplatina. Os ratinhos foram tratados com o complexo de ADN-lipossoma, por administração intravenosa
através da veia da cauda, duas vezes por semana, e cisplatina por via intraperitoneal uma vez por semana durante 4 semanas. Os volumes dos tumores foram calculados pela seguinte fórmula: Volume do tumor (mm
3) = 0,52 × comprimento (mm) x largura (mm) x largura (mm) [26]. Os tecidos tumorais foram coletadas para experimentos TUNEL.
desoxinucleotidil-transferase mediada rotulagem final dUTP nick Terminal (TUNEL) Análise
TUNEL foi realizada com um Kit de detecção in situ Cell Death (Roche). apoptose celular foi quantificada por determinação da percentagem de células coradas positivamente para todos os núcleos em 20 campos escolhidos aleatoriamente /secção em 200 × ampliação. Slides dos estudos de apoptose foram quantificados de forma cega por dois revisores independentes dois momentos diferentes.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o software SPSS (versão 17.0 para Windows). Todos os valores foram expressos como médias ± DP. ANOVA e teste de Tukey-Kramer de teste de comparação múltipla foram usados em comparações. As curvas de sobrevida foram construídas de acordo com o método de Kaplan-Meier. A significância estatística foi determinada pelo teste de log-rank.
p
valor 0,05 foram considerados significativos. As barras de erro representam o SEM salvo indicação em contrário.
Resultados
variantes genéticas entre as células de cancro do ovário a cisplatina-sensíveis e resistentes ao
A análise Western blot mostraram que a cisplatina e minúsculas ( A2780s, IGROV1) e OAW42 linhas celulares expressam relativamente baixos níveis endógenos de proteína Bcl-2, Bcl-x
L e Mcl-1, enquanto resistente a cisplatina (A2780cp, linhas de células OVCAR-3 e SKOV3) foram pelo contrário. Em contraste com a bcl-2 prosurvival proteínas da família, os níveis de pró-apoptótica Bak e Bax no A2780s, linhas celulares IGROV1 OAW42 e são mais elevados do que aqueles em A2780cp, OVCAR-3 e linhas de células SKOV3 (Figura 1A).
(a) transferência de Western foi realizada para as variações de prosurvival expressão de Bcl-2, Bcl-x
L, e de Mcl-1 e proteínas Bak e Bax proapoptotic entre os sensíveis a cisplatina (A2780s, IGROV1 e OAW42) e -resistente ( A2780cp, OVCAR-3 e SKOV3) células de cancro do ovário. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) A2780s (p53 WT) e SKOV3 (p53 – /-), as células foram tratadas com cisplatina (5 mg /mL) durante 24 horas e analisadas quanto à expressão de p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, noxa e Bax por Western blotting. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) OVCAR3 (abrigando R248Q mutante p53) e A2780cp (contendo p53 sequência do gene de tipo selvagem, mas que mostra a perda de função de p53) as células foram tratadas com cisplatina (5 mg /mL) durante 24 horas e analisadas quanto à expressão de p53, p73 , p21
WAF1 /cip1, noxa e Bax por transferência de Western. β-actina foi usado como um controle de carga.
Nós ainda examinados os níveis de expressão induzida por cisplatina de p53, p73, p21
WAF1 /cip1, Noxa e Bax em várias linhas celulares de cancro do ovário humano com o estado de p53, incluindo diferentes A2780s (p53 wt), células SKOV3 (p53 – /-), OVCAR-3 (que alberga R248Q mutante p53) e A2780cp (contendo p53 sequência do gene de tipo selvagem, mas que mostra a perda de função de p53). Todas as células indicadas foram tratados com 5 ug /mL de cisplatina durante 24 h. Como mostrado na Figura 1B e C, p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, noxa e Bax foram encontrados para ser significativamente induzida por cisplatina em linha de células A2780s tipo p53 selvagem, mas resistente à cisplatina, em outras três p53 mutante OVCAR-3, A2780cp e linhas celulares SKOV3, as expressões de p73, p21
WAF1 /cip1, noxa e Bax permaneceu inalterada. Além disso, o nível de Bax endógeno em resistente a cisplatina OVCAR-3, linhas de células A2780cp e SKOV3 é muito baixo (Figura 1B e C). Estes resultados indicam que as respostas de noxa Bax e a cisplatina são regulados principalmente pelo p53 que não p73 em linhas celulares de cancro do ovário.
reduziu a viabilidade das células cancerosas do ovário e
In vitro
por hNOXA e cisplatina
a função pró-apoptótica de noxa e falta de indução noxa em SKOV3 resistentes a cisplatina intrinsecamente (p53 – /-) células ovarianas nos levou a investigar se a superexpressão de noxa suprime o crescimento de células de câncer de ovário. A sobre-expressão de hNOXA em células A2780s transfectadas foi confirmada por RT-PCR (Figura 2A) e análise de transferência de Western (Figura 2B), respectivamente. Considerando-se que as funções de noxa a jusante da via de apoptose mediada por p53, e que a acção citotóxica de cisplatina é mediada por danos no ADN, o qual, por sua vez, transactiva os genes alvo (egp53AIP, Puma, noxa) para causar apoptose, que prevê que a elevada expressão noxa pode sensibilizar células de cancro do ovário a cisplatina. Para testar esta hipótese, foram primeiro tratados com cisplatina, as células A2780s nas concentrações indicadas, com um intervalo de 24 ou de 48 horas, e constatou que a dose de CI
50 de cisplatina variou de 5 ug /ml a 10 ug /ml (Figura 2C). Em seguida, as células tratadas com cisplatina a uma dose sub-óptima (5 ug /ml), com um intervalo de 24/48 horas, de acordo com os vários esquemas, tal como descrito em Métodos e Meterials. Após o tratamento, a viabilidade das células foi determinada por ensaio MTT. Como se mostra na Figura 2D, em comparação com o controlo, quer hNOXA ou cisplatina reduziu significativamente a viabilidade das células A2780s por 41% /47% (P 0,001) e 43% /49% (P 0,001), respectivamente. hNOXA mais cisplatina muito reduzida significativamente a viabilidade das células A2780s por 68% /76% (P 0,001). Em células SKOV3 deficientes em p53, em comparação com o controlo pc3.1, hNOXA também reduziu significativamente a viabilidade das células (P 0,001), enquanto que a cisplatina apresentaram apenas um efeito ligeiro, mas estatisticamente não significativo sobre o crescimento de células SKOV3 (24 h, p = 0,874; 48 h, p = 0,921). No entanto, a combinação de hNOXA e cisplatina reduzida muito significativamente a viabilidade das células SKOV3 em 65% /68% (P 0,001). (Figura 2E)
(A) análise de RT-PCR da expressão hNOXA
In
vitro após transfecção de células A2780s. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (B) Análise de Western blot de expressão hNOXA
in vitro
após transfecção de células A2780s. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) O tratamento da cisplatina nas concentrações indicadas e períodos de reduzida viabilidade das células A2780s, mostrando que a dose de CI
50 variou de 5 ug /ml a 10 ug /ml. (D) O tratamento de hNOXA mais cisplatina reduziu a viabilidade das células A2780s de forma mais significativa do que o tratamento de hNOXA isoladamente ou cisplatina isoladamente fez. diferenças significativas em comparação com o grupo controle (24 h, ** P 0,001; 48 h,
## P 0,001). (E) O tratamento de cisplatina só tinha pouco efeito sobre a sobrevivência de células SKOV3, e a combinação de hNOXA mais cisplatina reduziu a viabilidade das células SKOV3 de forma mais significativa do que o tratamento de hNOXA isoladamente ou cisplatina isoladamente fez. diferenças significativas em comparação com o grupo controle (24 h, ** P 0,001; 48 h,
## P 0,001). foi calculado percentagem de sobrevivência. Os resultados são apresentados como médias ± DP de três poços em triplicado e as experiências. Em cada experimento, o tratamento só a médio (não tratada) indica a viabilidade celular de 100%.
A indução de apoptose de células de cancro do ovário
in vitro
por hNOXA e cisplatina
a avaliação quantitativa de células sub-G1, por citometria de fluxo foi usada para estimar o número de células apoptóticas. Como mostrado na figura 3A, em células A2780s sensíveis a cisplatina, as células apoptóticas foram responsáveis por 34,6% no grupo tratado com hNOXA vs. 15,6% no grupo tratado com pcDNA3.1 e 8,7% no grupo de controlo. As células apoptóticas foram responsáveis por 63,6% no grupo de associação versus 48,3% no grupo tratado com cisplatina. Estes resultados sugerem que a cisplatina ou hNOXA apoptose induzida sozinho significativamente de células A2780s, e hNOXA mais cisplatina aumentada ainda mais a indução de apoptose. Resultados semelhantes foram obtidos em células SKOV3 intrinsecamente resistentes excepto que a cisplatina só se verificou ter pouca capacidade de induzir apoptose de células SKOV3 (Figura 3B).
(a) ADN que histogramas de fluorescência representativos de células PI-coradas. células A2780s foram tratados com hNOXA durante 24 h, em seguida, com 5 ug /mL de cisplatina durante um adicional de 24 h. células A2780s foram tratados com pcDNA3.1 ou hNOXA, cisplatina isoladamente ou cisplatina e hNOXA mais grupos Ctrl, pc3.1, hNOXA, cis e hNOXA + Cis correspondem a estas cinco tratamentos (o mesmo como mostrado nos painéis posteriores), com 8,7 % (Ctrl), 15,6% de células sub-G1 (células apoptóticas) (pc3.1), 34,6% (hNOXA), 48,3% (CIS) e 63,6% (+ hNOXA cis), respectivamente, tal como avaliado por citometria de fluxo. células (B) SKOV3 foram tratados com hNOXA durante 24 h, em seguida, com 5 ug /mL de cisplatina durante um adicional de 24 h. células SKOV3 não foram tratados, tratados com vector vazio ou hNOXA, cisplatina isoladamente ou hNOXA mais cisplatina, com 4,9% (Ctrl), 6,4% (pc3.1), 38,4% (hNOXA), 9,1% (Cis) e 52,3% (hNOXA + Cis) células sub-G1 (células apoptóticas), respectivamente, tal como avaliado por citometria de fluxo. (C) normal e morfologia nuclear apoptótica de células A2780s foi analisado por coloração Hoechst 33258. células A2780s foram tratadas com as mesmas condições como descrito acima. (D) e morfologia normais nuclear apoptótica de células SKOV3 foi analisado por coloração Hoechst 33258. células SKOV3 foram tratados com as mesmas condições como mencionado acima.
A apoptose também foi avaliada pela Hoechst 33258 coloração. De forma semelhante aos resultados acima, em ambas as células A2780s e SKOV3, o número de núcleos condensados (intactos ou fragmentados), que são características da apoptose, no grupo de combinação foram observados do que em hNOXA- ou células tratadas com cisplatina. Não houve núcleos significativamente condensadas em grupos apenas- e tratou-pc3.1 médios. No entanto, deve ser notado que as células SKOV3 tratados com cisplatina não apresentou sinais apoptóticos semelhantes (Figura 3C e D).
Os efeitos sensibilizadores de noxa são mediados pela libertação de Cit C e SMAC no citosol
noxa induz a apoptose através da activação do Bax e /ou Bak para provocar disfunção mitocondrial e activação de caspases-9 [10], [11], [27]. Como esperado, nas células A2780s sensíveis a cisplatina, quer hNOXA ou cisplatina isoladamente resultou em significativa sobre-regulação de Bax e activação das caspases 3 e 9, e sua combinação melhorada ainda mais a sobre-regulação de Bax e activação de caspases (Figura 4A ). Além disso, a apoptose foi acompanhada por libertação de Cit C e Smac para o citosol (Figura 4B). Resultados semelhantes também foram obtidos em células SKOV3 resistentes intrinsecamente, exceto que apenas a cisplatina foi encontrado para não causar o aumento da regulação de Bax e activação das caspases e liberação de Cit C e Smac (Figura 4A e B).
(a) e células A2780s SKOV3 foram submetidas aos tratamentos indicados como descrito em Materiais e Métodos. activação de caspase foram analisados por transferência de Western. As setas indicam as formas activas das caspases. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. células A2780s e SKOV3 (B) foram submetidos aos tratamentos indicados como descrito em Materiais e Métodos. A libertação de Cit C e Smac para o citosol foram analisados por transferência de Western. Cox-IV blots indicam controlos de carga mitocondriais enquanto β-actina foi utilizado como um controlo de carga para a fracção citosólica.
alterações no eixo Bax /Smac determina a sensibilidade de células de cancro do ovário a cisplatina
observamos que a sobre-regulação de Bax e liberação de Smac para o citosol em noxa tratados A2780s e células SKOV3 (Figura 4), e que a cisplatina também levou a Bax-regulação e liberação Smac nas células A2780s (Figura 4 ), mas em células SKOV3, que não causou a sobre-regulação de Bax (figura 1 e 4) e a libertação de Smac para o citosol (Figura 4). Estas observações levaram-nos a especular que o eixo Bax /Smac pode ser um dos principais factores determinantes da quimiosensibilidade em células de cancro do ovário resistentes à cisplatina, e que as alterações induzidas por noxa do Bax /Smac Eixo podem aumentar a sensibilidade de células de cancro do ovário a cisplatina. Para testar a especulação, nós decidimos investigar se noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina foi atenuada em células A2780s sensíveis a cisplatina quando tratadas com siRNA alvejando Bax ou Smac, e se noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina fosse aumentado com cisplatina células SKOV3 resistentes quando pré-tratadas com péptido ou Bax construir Smac N7, respectivamente.
Como esperado, Bax siRNA atenuou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células A2780s (Figura 5A). Resultados semelhantes também foram encontrados em células A2780s após o tratamento com siRNA alvejando Smac (Figura 5B). A especificidade de Bax e Smac duplexes de ARNip foi avaliada através da análise da Bax e a expressão da proteína em células A2780s Smac transfectadas com a construção correspondente shRNA (Figura 5C). Em células SKOV3, a sobre-expressão da Bax, a qual foi confirmada por análise de transferência de Western (Figura 5D) pc3.1-Bax-transfectadas, aumentou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina (Figura 5E). Da mesma forma, a adição de um heptapéptido do terminal NH2 Smac (Smac-N7) também aumentou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina (Figura 5F).
siRNAs (A) segmentação Bax atenuou significativamente noxa e /ou cisplatina apoptose induzida em células A2780s quimiossensíveis (* P 0,01; ** P 0,001). (B) siRNAs segmentação Smac atenuou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células quimiossensíveis A2780s (
# P 0,05; * P 0,01; ** P 0,001). (C) A regulação de Bax ou Smac pela Bax siRNA ou Smac siRNA foram confirmados por Western Blot. (D) A sobre-expressão do Bax foi confirmada por Western blot. células (E) SKOV3 foram co-transfectadas com plasmídeos noxa e pc3.1-Bax, durante 12 horas, seguido de 5 ug /mL de cisplatina para tratamento adicional de 12 horas. A sobre-expressão do Bax aumentou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células quimiorresistentes SKOV3 (* P 0,01). células (F) SKOV3 foram tratados com noxa e /ou cisplatina, como acima descrito, em seguida, com o péptido /L Smac-N7 20 umol por um período adicional de 3 horas. péptido Smac-N7 aumentou significativamente noxa e /ou a apoptose induzida por cisplatina em células SKOV3 quimiorresistentes (
# P 0,05; * P 0,01)
eficácia antitumoral melhorada da combinação de hNOXA. e cisplatina in vivo
com base no
in vitro
inibidor do crescimento e os efeitos pró-apoptóticos de hNOXA e cisplatina, examinamos ainda mais o efeito antineoplásico de hNOXA mais cisplatina em A2780s e SKOV3 tumores
in vivo
. Como mostrado na Figura 6A e B, no dia 34 após a implantação, os tumores SKOV3 A2780s e de ratinhos tratados com PBS atingiu 1174,28 ± 70,43 e 73,27 milímetros 823.82 ±
3 em volume, respectivamente. Os A2780s e SKOV3 tumores tratados com hNOXA foram significativamente (modelo A2780s,
P Art 0,001; modelo SKOV3,
P Art 0,001) menor do que aqueles tratados com PBS, atingindo apenas 686,06 ± 81.39 e 429.38 ± 22,9 milímetros
3 em volume, respectivamente. o crescimento do tumor A combinação de hNOXA e cisplatina inclusive suprimida de tal forma que os A2780s e tumores SKOV3 atingiu 342,84 ± 38,8 e 279.27 ± 47,16 milímetros
3 em volume, respectivamente, que foram significativamente (modelo A2780s,
P Art 0,001; modelo SKOV3,
P Art 0,001) menor do que os tumores de controlo, e significativamente menor do que os tumores tratados com hNOXA (modelo A2780s,
P Art 0,001; SKOV3 modelo, p 0,05) ou cisplatina (modelo A2780s,
P Art 0,05; modelo SKOV3,
P Art 0,001). A cisplatina também resultou numa redução significativa do volume do tumor (577.08 ± 77,04 milímetros
3) em comparação com tumores de controlo (
P
0,001) no modelo A2780s. No entanto, no modelo de células SKOV3, não foi observada nenhuma diferença significativa no volume do tumor (605,44 ± 80,51 milímetros
3) no grupo tratado com cisplatina em comparação com o grupo tratado com pc3.1 (695.57 ± 79,28 milímetros
3) (
P
= 0,222).
supressão do tumor e vantagem de sobrevivência em camundongos. células A2780s (A, C) ou células SKOV3 (B, D) de 2 × 10
6 foram inoculados subcutaneamente em ratinhos nus fêmea em 6-8 semanas de idade. Os murganhos (cinco por grupo) foram tratados com PBS, pcDNA3.1, pcDNA3.1-hNOXA, cisplatina e pcDNA3.1-hNOXA + cisplatina. No modelo de tumor A2780s, diferenças significativas na supressão do tumor (** P 0,001) e tempo de sobrevivência (
? P 0,05) em ratinhos tratados com cisplatina ou hNOXA versus controlos de PBS e pcDNA3.1; diferença significativa para os tumores tratados com hNOXA + cisplatina contra PBS e controlos pcDNA3.1 (** P 0,001;
ΔΔP 0,01), e a diferença significativa para a terapia de combinação contra hNOXA ou monoterapia com cisplatina (
# P 0,05;
† P 0,05). Resultados semelhantes também foram encontrados no modelo SKOV3, exceto que não há diferenças significativas na supressão do tumor (
P
= 0,222) e sobrevivência tempo (
P
= 0,433) entre cisplatina e pcDNA3.1- tumores tratados foram encontrados. (E-F) de TUNEL coloração de tecidos tumorais. As secções representativas foram tomadas a partir A2780s (E) e SKOV3 (f) os tecidos de tumor de ratinhos que receberam PBS, pcDNA3.1, hNOXA, cisplatina e hNOXA + cisplatina. índice de (L) apoptótica dentro dos tecidos tumorais A2780s e SKOV3 foram contadas. No modelo A2780s, diferença estatisticamente significativa na taxa de apoptose em tumores tratados com cisplatina ou hNOXA contra PBS e controlos pcDNA3.1 (** P 0,001); diferença significativa para os tumores tratados com hNOXA + cisplatina contra os dois controlos (** P 0,001); e diferença significativa para a terapia de combinação contra hNOXA monoterapia ou cisplatina (
## P 0,001). Resultados semelhantes também foram encontrados no modelo SKOV3, excepto que não há diferenças significativas no índice apoptótico entre tumores tratados com cisplatina e o tumor tratado com pcDNA3.1 (P = 0,981) ou tumor tratado com PBS (P = 0,705) foram encontrados. O índice apoptótico foi calculada como a razão entre o número de células apoptóticas ao número total de células em cada campo. (H) Análise RT-PCR da expressão de hNOXA exógeno in vivo.
Sobrevivência análise da curva (Figura 6C) mostrou que o tumor A2780s ratinhos portadores no PBS ou grupos tratados com pc3.1 sobreviveu menos de 65 dias em média. Por outro lado, quer hNOXA ou cisplatina resultou em um aumento significativo (
P Art 0,05) aumento da expectativa de vida em comparação com os dois grupos de controle, com o tempo de sobrevida média sendo 74 e 80 dias, respectivamente.