Abstract

Estudos anteriores demonstraram que

c-MET

é overexpressed em casos de câncer de bexiga agressivo (BCA). Identificação de crosstalk entre

c-MET

e outros RTKs tais como

AXL

e

PDGFR

sugerem que

c-MET

genes de rede (

c-MET Restaurant –

AXL Restaurant –

PDGFR

) pode ser clinicamente relevante para BCa. Aqui, nós examinamos se a expressão de

c-Met

genes de rede pode ser utilizada para identificar pacientes BCa em maior risco de desenvolver doença agressiva.

In vitro

análise,

c-Met

knockdown suprimiu a proliferação celular, invasão e migração, e aumento da sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina. Além disso,

c-MET

gene de rede (

c-MET

,

AXL

, e

PDGFR

) expressão permitida a discriminação dos tecidos BCa do normal tecidos de controle e apareceu para prever a progressão da doença pobres em não-musculares pacientes BCa invasoras e pobres sobrevida global em pacientes musculares BCa invasivos. Estes resultados sugerem que

c-MET

expressão do gene de rede é um novo marcador de prognóstico para prever quais pacientes BCa têm um risco aumentado de desenvolver a doença agressiva. Estes genes pode ser um marcador útil para a terapia co-alvo, e espera-se que desempenham um papel importante na melhoria tanto da resposta ao tratamento e sobrevida dos pacientes BCa

Citation:. Kim YW, Yun SJ, Jeong P, Kim SK, Kim SY, Yan C, et ai. (2015) O

c-MET

Rede como Novel prognóstico marcador para prever bexiga pacientes com câncer com um risco aumentado de desenvolver doença agressiva. PLoS ONE 10 (7): e0134552. doi: 10.1371 /journal.pone.0134552

editor: Renato Franco, Istituto dei Tumori Fondazione Pascale, ITALY

Recebido: 26 Março, 2015; Aceito: 13 de julho de 2015; Publicação: 30 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP; http:. //www.msip.go .kr /web /main /main.do) (No. NRF-2014R1A2A1A09006983) e pelo Programa Ciência básica Research através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (http: //www.moe.go.kr/main.do)(2012R1A1A4A01008753). Além disso, este trabalho foi apoiado em parte pelo R01DK100974; U01 DK103260; U24 DK097154; NIH NCATS UCLA CTSI UL1TR000124; um Fundo de Descoberta Steven Spielberg no Prêmio de Desenvolvimento Prostate Cancer Research Carreira; um IMAGINE NO Award Programa de Pesquisa IC (JK). JK é um American Urological Association Research Foundation Scholar e Harvard Medical School Eleanor e Miles Shore Scholar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a superexpressão de receptores tirosina-quinase (RTK) ocorre em casos de câncer de bexiga agressivo (BCA); terapias assim RTK-alvo são recomendados para tais pacientes [1, 2]. inibição farmacológica da atividade RTK (por exemplo, com gefitinib) é o tratamento padrão ouro para pacientes bca, embora tenha se reuniu com sucesso limitado [3, 4].

O

c-MET

proto -oncogene, que está localizado no cromossoma 7q21-31 [5], é sobre-expressa em BCa.

c-Met

é activado pelo seu ligando, o factor de crescimento de hepatócitos (HGF), e induz o aumento da proliferação, migração, motilidade e invasão de células BCa [6]. Após a estimulação e a dimerização do

c-Met

, a fosforilação da tirosina ocorre em locais específicos dentro do domínio intracelular (ou seja, Y1234, Y1235, Y1349, Y1356 e), o que aumenta a actividade intrínseca de tirosina-cinases e leva à recrutamento de muitas proteínas de sinalização, incluindo a proteína ligada ao receptor do factor de crescimento 2 (GRB2), Grb2-associados ligante-1 (Gab1), Src domínio de homologia 2 contendo (SHC), fosfolipase C1 (PLC1), e fosfoinositida 3-quinase (PI3 -K) [7]. O Ras /Erk-MAPK, PI3-K /Akt /mTOR [8], vias de sinalização e STAT3 também são ativados, induzindo assim várias respostas biológicas [6, 9].

A superexpressão do

c- TEM

correlaciona com BCa metástase [7, 10]; Com efeito,

c-Met

é sobre-expresso em mais de 60% dos casos localmente avançados e metastáticos BCa [5], e está ligada à sobrevivência pobre [11]. Considerando que a dimerização das RTK é importante para controlar a sua função biológica no contexto do câncer, crosstalk entre

c-MET

e outros RTKs deve ser investigada com cuidado, se quisermos entender o papel da

c- TEM

na progressão do cancro humano. Seções do tumor primário de pacientes com um tipo raro de BCa, chamado neuroendócrino (NE) BCa, mostra

c-MET

expressão [12]. Isto sugere que a NE BCa pode ser um alvo adequado para

c-Met

inibidores. Um estudo anterior demonstrou que um membro da

c-Met

família, RECEPTOR d’origine Nantais (RON), forma um heterodímero com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [13]. Além disso, a análise de microarray RTK revelou que RTKs tais como

AXL

e

PDGFR

crosstalk com

c-MET

[11].

AXL

e

PDGFR

estão associados com o peito agressiva [14], rim [15], pulmão [16, 17], e cancros da próstata [18, 19], sugerindo que

c-MET Network –

AXL Restaurant –

PDGFR

pode ser clinicamente relevante para BCa [11]

o objetivo do presente estudo foi examinar a associação clínica. entre a expressão de

c-MET

genes de rede (

c-MET Restaurant –

AXL Restaurant –

PDGFR

) e a evolução da doença para pacientes BCA e para investigar se

c-MET

genes de rede pode ser usado para identificar pacientes BCa em maior risco de desenvolver a doença agressiva.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido

amostras de tumor primário de pacientes submetidos à ressecção transuretral (RTU) ou cistectomia radical na Universidade Nacional de Chungbuk na Coreia do Sul foram histologicamente confirmado como carcinoma urotelial. Normal de mucosa da bexiga foi colhido de pacientes com doenças benignas como a hiperplasia benigna da próstata (HBP), pedras ureter, e incontinência urinária de esforço, após consentimento informado. Todos os tecidos de controle foram histologicamente confirmados como normal. Os pacientes com carcinoma concomitante

in situ

(CIS), lesões da CEI sozinho, um curto período de seguimento (menos de 6 meses), ou para os quais os dados estavam incompletos, foram excluídos para produzir uma população estudo mais homogênea. Um total de 165 (30 do sexo feminino 135 homens e mulheres; idade média, 65 anos) pacientes BCa e 34 controles (19 homens e 15 mulheres, idade média, 54 anos) foram incluídos. Todos os tumores foram dissecados macro-(tipicamente dentro de 15 minutos de ressecção cirúrgica), e cada amostra BCa foi confirmada por análise patológica de uma secção de tecido fresco congelado derivado de TUR espécimes ou cistectomia. As amostras de tumor foram então congeladas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. pacientes NMIBC submetidos a um segundo TUR 2-4 semanas após a ressecção inicial se o espécime BCa não incluiu a camada muscular adequada ou quando foi detectado um tumor de alto grau. Os pacientes com um tumor T1, vários tumores, tumores grandes ( 3 cm de diâmetro), ou de alto grau Ta NMIBC recebeu um ciclo de tratamento intravesical [bacilo de Calmette-Guérin (BCG) ou mitomicina-C]. A resposta ao tratamento foi avaliada por cistoscopia e citologia urinária. Os pacientes que estavam livres da doença no prazo de 3 meses de tratamento foram acompanhados a cada 3 meses para os primeiros 2 anos e depois a cada 6 meses depois. pacientes CINM com tumores clinicamente localizado ou localmente avançado e bom estado geral Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) (0 ou 1) foram submetidos a cistectomia radical e completa nó dissecção linfática pélvica. Os pacientes não elegíveis para cistectomia radical devido a doença metastática, a expectativa de vida pobre, ou o status mau desempenho ECOG (≥2) foram submetidos TUR ou biópsia para o diagnóstico histopatológico. Pacientes com pT3, pT4, ou doença de nódulo positivo (com base na análise de amostras radical cystectomy) e aqueles com doença metastática, mas boa performance status recebido pelo menos quatro ciclos de quimioterapia baseada em cisplatina. Os pacientes que se recusaram ou não completaram uma imagem work-up [tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (MRI)], pelo menos uma vez a cada 3 meses para avaliar as respostas foram excluídos da análise posterior.

Os tumores eram encenado e classificados de acordo com a classificação TNM 2002 eo

Associação Europeia de Urologia (EAU)

orientações baseadas em 1973

OMS

sistema de classificação [20, 21]. Recorrência foi definida como a recorrência de NMIBC primária com um menor ou mesmo estágio patológico, e progressão foi definida como a identificação de T2 ou doença em estágio mais elevado em cima recaída. No caso de MIBC, progressão foi definida como recidiva loco-regional ou uma nova metástase distante em pacientes cystectomized e um aumento ≥20% na massa do tumor primário ou de um novo metástase distante em pacientes não-cystectomized.

extracção de ARN e a transcrição reversa para ADNc

O ARN foi isolado a partir de tecidos por homogeneização com 1 ml de reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) num tubo de vidro de 5 mL. O homogeneizado foi depois transferido para um tubo de 1,5 ml e misturou-se com 200 ml de clorofórmio. Após incubação durante 5 min a 4 ° C, o homogeneizado foi centrifugado durante 13 min a 13000 g a 4 ° C. A fase aquosa superior foi transferida para um tubo limpo contendo 500 ml de isopropanol. A mistura foi incubada durante 60 min a 4 ° C e depois centrifugado durante 8 min a 13000 g a 4 ° C. A fase aquosa superior foi rejeitado e misturou-se com 500 ml de etanol a 75% e centrifugou-se durante 5 min a 13000 g a 4 ° C. A camada aquosa superior foi rejeitado e o sedimento foi seco a temperatura ambiente, dissolveu-se em água tratada com DEPC, e a seguir armazenado a -80 ° C. A qualidade ea integridade do RNA foram confirmados usando um dispositivo Nanodrop. O ADNc foi preparado a partir de 1 mg de RNA total usando um kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

Cultura de células e transfecção

T24 BCa células foram obtidas e cultivadas de acordo com as instruções fornecer pelo ATCC. Os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino, 2% de glutamina e 1% de antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA), e as células foram mantidas sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Para as experiências de knockdown, as células foram transfectadas transientemente com 200 pmol siRNA piscina para silenciar MET (Met siRNAs, Life Technologies, número de catálogo 103545, 103551, 103557, 103767 e 103769) ou ARNsi de controlo negativo, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

ensaio de proliferação

células transfectadas com ARNsi foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1 x 10

4 /cavidade. As células foram então coradas com violeta de cristal e contadas após 7 dias [22].

Anchorage-independente ensaio de crescimento em agar mole

células transfectadas com ARNsi (1 × 10

4) foram semeadas em 3 ml de 0,35% de agar em FBS contendo meio de cultura e sobrepostos em 2 ml de agar a 0,7% em SBF contendo meio de cultura em placas de 6 poços. Imagens de 3- (4, 5-dimethylthiaz-113 olilo-2) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) -stained colónias foram capturados com um microscópio Zeiss como descrito anteriormente

ensaio de invasão [22].

células (3 x 10

5 células /ml) foram contadas e semeadas em inserções revestidas com colagénio (Millipore Corp., Billerica, MA). Após 16 h, as células que migraram para a superfície inferior das inserções foram coradas com solução de violeta de cristal. O corante foi extraído das células utilizando uma solução de ácido acético a 10%, e a absorvância foi lida num leitor de microplacas Fluostar Omega (BMG Labtech, Cary, NC) como descrito anteriormente [22].

Ensaio

apoptose celular

T24 células transitoriamente transfectadas com ARNsi foram incubadas em meio com ou sem cisplatina 10 uM por 8 horas. A viabilidade celular foi medida num ensaio de MTT como anteriormente descrito [23]. apoptose celular foi quantificada pela medição da massa metabolicamente activo das células tratadas após a normalização contra células não tratadas.

cicatrização de feridas (in vitro zero) ensaio

T24 células cultivadas em poli-L-lisina foram co-transfectadas com o plasmídeo que codifica GFP. Eles foram então submetidos a

in vitro

ensaio zero com imagens capturadas às 0 e 16 horas após a incubação, utilizando microscópio de fluorescência. As células movidas a partir da borda do zero para o centro do zero (assinalados por linhas a tracejado amarelo).

análise Western blot

T24 células transfectadas foram colhidas rapidamente, rapidamente congelados em azoto líquido, e armazenada a -80 ° C. A proteína total foi extraída em tampão de lise [1% de Nonidet P-40, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 10 mM, NaF 1 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 0,1 mM, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e inibidor de protease completo cocktail comprimido (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha)] nas condições indicadas e centrifugou-se a 12.500

g

durante 15 min. 25 ug de proteínas por cada condições foram submetidos a corrida em gel de SDS-PAGE, as quais foram transferidas para membranas de nitrocelulose para análises de Western blot. Após bloqueamento com BSA a 10% /PBST durante 1 h, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos contra o

c-Met

, MMP2, MMP9 ou β-actina. As manchas foram visualizadas por quimioluminescência reforçada.

Análise computacional

Para estudar a associação entre o

c-MET

genes de rede e parâmetros clínicos em pacientes bca, foram examinados os perfis de expressão destes genes em pacientes BCa utilizando dados de microarray anteriormente obtidos (número de acesso GSE13507). dados de microarranjos estavam disponíveis para 165 pacientes. Os resultados clínicos, incluindo a sobrevivência livre de progressão (PFS), a sobrevida global (OS) e específico para o cancro de sobrevivência (CSS) foram obtidos a partir de registros médicos. A correlação entre a expressão gênica e evolução da doença foi examinada usando análise de regressão de riscos proporcionais de Cox. De Kaplan-Meier (KM) análise da curva de sobrevivência usando um subconjunto dos perfis de expressão de gene a partir de pacientes com “baixo” e “alto” expressão de cada gene foram utilizados para identificar os efeitos de

C-MET

a expressão do gene em rede BCa. A expressão 50

percentil (mediana) do gene foi usado como o valor manguito-off. O teste de log-rank foi realizada para avaliar a significância das diferenças entre duas curvas de sobrevivência.

Ethical declaração

O estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade Nacional de Chungbuk Ética. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado por escrito. coleta e análise de amostra foram aprovados pelo Conselho da Universidade Nacional de Chungbuk Institutional Review.

Resultados

As características clínicas e patológicas de pacientes BCa

A média de idade dos 165 pacientes em a coorte de estudo foi de 65,2 ± 12,0 anos, eo período médio de acompanhamento foi de 48,4 meses. Dos 165 pacientes, 62,4% (103/165) tinha NMIBC e 37,6% (62/165) teve de MIBC. A idade média dos 34 pacientes no grupo de controle normal foi de 54,0 ± 10,4 anos. As características de linha de base dos pacientes e controles são apresentados na Tabela 1.

Perda de

c-Met

suprime a proliferação de células BCa e invasão e aumenta a sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina

estudos anteriores sugerem que estromal HGF sinalização através do

c-MET

pathway aumenta invasão e metástase de células BCa [6, 11, 13]; portanto, procurou-se determinar os efeitos de

c-Met

silenciamento sobre a proliferação e invasão, e sobre a resposta apoptótica a cisplatina (um importante agente quimioterapêutico utilizado no tratamento de pacientes BCA). Descobrimos que as células do CBE no qual

c-MET

foi derrubado formados menos (e menores) colónias do que as células de controlo negativo, sugerindo uma redução na proliferação celular em agar mole (Fig 1A). O ensaio de invasão de células mostraram que as células BCa abrigar intacta

c-MET

eram mais invasivo do que aqueles em que

c-MET

foi derrubado.

c-Met

células T24 -silenced eram muito menos invasiva do que as células controlos (células não-transfectadas e células transfectadas com ARNsi de controlo) (Fig 1B). A seguir, examinou a consequência de

c-MET

perda na apoptose celular em um ensaio MTT.

c-MET

células knockdown mostrou aumento da sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina (Fig 1C).

Todos os experimentos foram realizados utilizando três

c-MET

linhas de células knockdown (si

c-MET

-1, si

c-MET

-2, e si

c-MET

-3) transfectadas com diferentes

MET

siRNAs e linhas de células de dois controles (Ctrl e NT). Ctrl, controle; NT, não transfectadas * p .. 0,05

Perda de

c-MET

inibe a migração celular de células BCa por downregulating MMP2 e MMP9

examinou a migração de células e de MMP2 e MMP9 de expressão em células BCa. Cicatrização de feridas ensaio (também chamado como no ensaio de zero in vitro) mostraram que

c-Met

-knockdown células migraram menos eficientemente do que as células de controlo (Fig 2A). Nós também descobrimos que derrubar

c-MET

subregulado a expressão de MMP2 e MMP9 em células BCA (Fig 2B).

(A)-cicatrização de feridas ensaio mostrando que knockdown de c-MET inhibitsthe migração de células T24. (B) A perda de

c-Met

regulada negativamente a expressão das metaloproteinases da matriz (MMP) -2 e MMP-9. Todos os experimentos foram realizados utilizando dois

c-MET

linhas de células knockdown (si

c-MET

-1 e Si

c-MET

-2) transfectadas com diferentes siRNAs MET e duas linhas de células Control (Ctrl e NT). Ctrl, controle; NT, não transfectadas.

A expressão de

c-MET

se correlaciona com OS no CINM pacientes

Para responder à questão de saber se

c-MET genes de rede

estão envolvidos na progressão BCa e agressividade, analisou-se a expressão de ARNm destes genes nos um microarray de ADN e os resultados comparados com as características da doença, tais como o grau do tumor (G), fase do tumor (T, N, M e ), o tamanho do tumor, recorrência, progressão, e CSS. Outras comparações foram então realizadas depois que os pacientes foram categorizados em grupos NMIBC e CINM. Os resultados revelaram que

c-MET

expressão de mRNA em pacientes CINM correlacionaram com o sistema operacional (p = 0,023; HR, 2.107; 95% intervalo de confiança (IC), 1,110-3,998) (Tabela 2). Estes dados foram confirmados por análise de GC curva de sobrevivência (figura 3). pacientes BCa com altos níveis de

c-MET

expressão mostrou pior sobrevida do que aqueles com baixa expressão (test-log rank, p = 0,020).

A expressão de

AXL

pode distinguir entre pacientes NMIBC e CINM e controles saudáveis ​​

a seguir, examinaram a associação clínica entre conhecidos

c-MET

parceiros,

AXL Comprar e

PDGFR

, e progressão BCa. Os resultados mostraram que

AXL

expressão claramente correlacionados com tanto NMIBC e CINM. tumores da bexiga (NMIBC e CINM) mostrou 0,471 vezes maior expressão de

AXL

mRNA de tecidos de controle.

AXL

expressão de mRNA por NMIBC (p 0,0001, a taxa de descoberta de falsas (FDR) 0,0001) e MIBC (p = 0,0001, FDR = 0,0006) foi significativamente maior do que nos controles normais (Tabela 3) .

AXL

expressão de mRNA no tecido NMIBC foi de aproximadamente 1.532 vezes maior do que no tecido CINM (Tabela 3).

A expressão de

PDGFR

isoformas é significativamente alterada em BCa e alta expressão de

PDGFRL

prevê pobres sobrevivência

Para testar se

PDGFR

é útil como um classificador de diagnóstico, examinamos a expressão de três isoformas diferentes (ou seja, ,

PDGFRA

,

PDGFRB

, e

PDGFRL

). Descobrimos que a expressão de

PDGFR

isoformas poderia ser usado para distinguir amostras NMIBC CINM e de controlos normais. A expressão de

PDGFRA

mRNA claramente discriminados tumores da bexiga (NMIBC e CINM) de tecidos normais de controlo (p 0,0001, FDR 0,0001), com

expressão PDGFRA

em NMIBC e MIBC sendo cerca de 0.274 vezes mais elevada do que nos controlos. A expressão de

PDGFRB

também foi claramente diferente entre tumores e tecidos normais (p = 0,0001, FDR 0,0001).

expressão PDGFRB

em NMIBC foi significativamente maior do que nos controles normais (p 0,0001), mas não houve diferença significativa foi demonstrada entre CINM e controles normais (p = 0,0698). Da mesma forma,

PDGFRL

foi expresso diferencialmente em NMIBC e controlos normais, com um aumento modesto (0,804 vezes) (p 0,0001) no primeiro. Assim, é provável que

PDGFR

expressão é aumentada em todos os tipos de BCa. É digno de nota que a expressão de

PDGFR

isoformas em tecidos de pacientes NMIBC foi geralmente mais elevada do que em tecidos de pacientes CINM (Tabela 4).

Em seguida, para compreender a clínica relevância do aumento da

expressão PDGFR

em BCa, examinamos a correlação clínica entre

PDGFR

expressão isoforma ea progressão da doença. Descobrimos que

PDGFRL

expressão foi significativamente correlacionada com a progressão NMIBC (p = 0,046; HR, 3,675; 95% CI, 1,024-13,188) (Tabela 5). análise de sobrevivência KM mostrou que os pacientes NMIBC com alta expressão de

PDGFRL

mostrou PFS mais pobres do que aqueles com baixa expressão de

PDGFRL

(-log rank test, p = 0,032) (Fig 4).

os níveis de expressão de

c-MET

genes da rede é significativamente correlacionada com a progressão da doença em pacientes NMIBC e com oS no CINM pacientes

Para identificar a clínica importância da

c-MET

genes de rede, que examinaram a associação entre

c-MET

expressão do gene de rede (

c-MET

,

AXL

, e

PDGFR

) e BCa prognóstico. Expressão de

c-MET

genes da rede foi baseada em uma avaliação do escore de risco para cada paciente calculado combinando os níveis de todos os três genes de expressão. Descobrimos que a expressão de

c-MET

genes rede correlacionou com a progressão da doença em pacientes NMIBC (p = 0,023; HR, 4.386; 95% CI, 1,221-15,757) e com o OS em pacientes CINM (p = 0,038; HR, 1.976; 95% CI, 1,039-3,759) (Tabela 6). análise de sobrevivência KM mostrou que os pacientes NMIBC com alta expressão de

c-MET

genes rede mostrou PFS mais pobres (teste log-rank, p = 0,013) do que aqueles com baixa expressão. Da mesma forma, os pacientes CINM (test-log rank, p = 0,034), com alta expressão de genes de rede c-MET mostrou OS mais pobres do que aqueles com baixa expressão (Fig 5).

Discussão

os resultados do presente estudo sugerem que a perda de

c-MET o que faz células BCa menos invasiva e mais suscetível a cisplatina. Além disso, o padrão de expressão

genes de rede c-MET

permite a discriminação de tecidos BCa de tecidos normais de controlo e parece prever os resultados clínicos pobres numa população coreana paciente.

aberrante

c-Met

expressão ocorre em vários tipos de cancro e está associada com um prognóstico pobre [24]. Superexpressão de

c-MET

em BCA é associada com mau OS e sobrevida livre de metástases [5, 7, 10]. Yeh et al. informou que a sobre-expressão de

c-MET

está associado positivamente com invasão muscular e baixa sobrevida de longo prazo (p 0,001) [11]. Relatórios anteriores sugerem que

c-MET

expressão está intimamente associada com a agressividade do tumor e sobrevida do paciente [5, 7, 10, 11, 18]. Os resultados aqui apresentados estão de acordo com aqueles em estudos anteriores. Descobrimos que a sobre-expressão de

c-MET

foi significativamente associada com pior sobrevida, principalmente OS em pacientes CINM. Isto sugere que a inibição

c-MET

expressão pode desempenhar um papel importante na prevenção da progressão BCa e melhorar a sobrevida do paciente.

In vitro

análise mostrou que

c- MET

knockdown suprimiu a proliferação celular, invasão e migração, e reduziu a expressão de MMP2 e MMP9. Isto foi acompanhado por um aumento da sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina. MMP2 e MMP9 degradar as proteínas da matriz extracelular, facilitando assim a invasão de células e metástase [25, 26]. Estes resultados indicam que

c-MET

inibição é susceptível de reduzir a invasão e metástase do câncer e melhorar a sobrevivência de pacientes com câncer. Assim, uma compreensão mais focada sobre a importância do

c-MET

inibição é necessária se quisermos desenvolver inibidores que alvejam

c-MET

em vários tumores. Recentemente, vários

c-Met

-targeting drogas foram testadas em ensaios clínicos, e todos apresentam uma actividade promissora clínica com efeitos secundários aceitáveis ​​[27]. Por exemplo, tivantinib (também chamado ARQ197) e um inibidor duplo de

c-Met

/VEGFR2 (foretinib) foram estudados na Fase I e II de ensaios clínicos em pacientes com carcinoma de células renais papilares e carcinoma hepatocelular avançado, respectivamente [24]. Um romance inibidor multiquinase de

MET

,

VERFR1

,

AXL

,

TIE2

,

KIT

,

FLT3

e

RET

, chamado CABOZANTINIB (também conhecido como XL184), inibe o crescimento, metástase e angiogênese em câncer pancreático e glioblastoma, e reduz a resistência à gemcitabina. Em especial, os ensaios clínicos, no câncer de próstata metastático resistente à castração (mCRPC) pacientes relataram um efeito promissor na PFS, metástase óssea e dor [28]. No entanto, os tumores que mostram inicialmente uma boa resposta a inibidores de MET pode mais tarde desenvolver resistência [24]. Adquiriram resistência a inibidores de MET desenvolve através de vários mecanismos, incluindo alterações genéticas (por exemplo, secundária

EGFR T790M

mutação), amplificação MET, e as vias de sinalização activada [29]. Assim, múltiplos terapia-alvo combinação ou terapia co-alvo pode ser necessária para prevenir a resistência aos medicamentos e para alcançar resultados benéficos [24].

É importante examinar a interação entre

c-MET

e outros RTKs porque os parceiros crosstalk de

c-MET

pode ser biomarcadores importantes para a terapia co-alvo e ajudar a prevenir a resistência aos inibidores de MET individuais.

RON

,

AXL

e

PDGFR

ter um crosstalk com

c-MET

. Superexpressão de

AXL

e

PDGFR

está associada com a agressividade e prognóstico de uma série tumor [14-19]. Os resultados aqui apresentados são consistentes com estudos anteriores a este respeito; no entanto, houve algumas diferenças. Em contraste com o estudo por Yet et al, que avaliou a associação entre o

PDGFRA

e progressão BCa, examinamos todos os três

PDGFR

isoformas:.

PDGFRA,

PDGFRB

, e

PDGFRL

. No entanto, apenas

PDGFRL

foi associada com a progressão NMIBC. A maioria dos estudos que visam identificar uma correlação entre a progressão BCa e

PDGFR

examinou o

PDGFRA Comprar e

PDGFRB

isoformas. Portanto, o presente estudo é o primeiro a identificar uma associação significativa entre o

PDGFRL

expressão e prognóstico BCa. Além disso, No entanto, et ai. examinou apenas os papéis de

AXL

e

PDGFR

em casos avançados [11]. Aqui, mostramos que a expressão de

AXL

e

PDGFR

distinto NMIBC e MIBC de controles saudáveis. Em particular, a expressão de ambos os genes foi maior nos pacientes do que em pacientes NMIBC CINM. Assim,

AXL

e

PDGFRL

pode ser mais específico para NMIBC do CINM. Um grande validação é necessária para clarificar os papéis e efeitos da

PDGFR

isoformas no BCA (NMIBC e CINM) prognóstico.

Nós também descobrimos que

c-MET

gene rede (

c-MET

,

AXL

, e

PDGFR

) expressão foi intimamente associado com a progressão da doença em pacientes NMIBC e com pior sobrevida (especialmente OS) em pacientes CINM. Estes resultados sugerem que a inibição da

c-MET

via pode prevenir a progressão da doença em pacientes NMIBC e melhorar a sobrevida de pacientes CINM. Além disso, multi-combinação ou terapias co-alvo podem ser necessários para evitar a resistência aos medicamentos adquiridos. Yeh et al. demonstraram que 21,5% (14/65) dos pacientes co-expressando

c-MET

/

AXL

/

PDGFR

mostrou baixa sobrevida de longo prazo (p = 0,015) [11]. No entanto, eles só identificou uma correlação clínica entre a

c-MET

genes de rede em pacientes com BCa localmente avançado e metastático. Aqui, nós identificamos uma correlação clínica em pacientes com NMIBC ou CINM. Assim, o presente estudo sugere que a

c-MET

rede é um biomarcador promissor e alvo para drogas co-alvo; isso deve ser testado em ensaios clínicos envolvendo ambos os pacientes NMIBC e CINM.

Em conjunto, estes dados sugerem que (1)

c-MET

/

AXL

/

os níveis de PDGFR

pode ser utilizado para distinguir pacientes com cancro dos controlos normais e de distinguir NMIBC de MIBC; e (2) a expressão de

c-MET

genes rede está significativamente associado com as taxas de sobrevivência mais pobres para os pacientes BCa.

Identificar as redes de sinalização envolvidas podem fornecer informações que irá ajudar a nossa compreensão da mecanismos subjacentes a biologia do tumor e ajudar a prever a resistência aos medicamentos em potencial [30]. Acreditamos que

c-MET

expressão do gene de rede é um novo marcador de prognóstico para prever quais pacientes BCa têm um risco aumentado de desenvolver a doença agressiva. Estes genes pode ser um marcador útil para a terapia co-alvo, e espera-se que desempenham um papel importante na melhoria tanto da resposta ao tratamento e sobrevida dos pacientes BCa.

Informações de Apoio

Tabela S1. Dataset com recorrência, progressão e 5 genes em pacientes NMIBC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134552.s001

(PDF)

S2 Table. Conjunto de dados com a progressão, sobrevida global, sobrevida câncer específico e 5 genes em pacientes CINM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134552.s002

(PDF)

S3 Tabela. Dataset com recorrência, progressão e

C-MET

genes de rede em pacientes NMIBC

doi: 10.1371. /Journal.pone.0134552.s003

(PDF)

S4 Table. Conjunto de Dados com a progressão, sobrevida global, sobrevida específica por câncer, e

C-MET

genes de rede em pacientes CINM

doi: 10.1371. /Journal.pone.0134552.s004

(PDF)

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (No. NRF-2014R1A2A1A09006983) e pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da National Fundação de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2012R1A1A4A01008753). Além disso, este trabalho foi apoiado em parte pelo R01DK100974; U01 DK103260; U24 DK097154; NIH NCATS UCLA CTSI UL1TR000124; um Fundo de Descoberta Steven Spielberg no Prêmio de Desenvolvimento Prostate Cancer Research Carreira; um IMAGINE NO Award Programa de Pesquisa IC (JK). J. K. é um American Urological Association Research Foundation Scholar e Harvard Medical School Eleanor e Miles Shore Scholar.