Abstract

Pode obter a sua capacidade de invadir e metastizar por sofrer epitelial-a-mesenquimal de transição ( EMT). Explorando este mecanismo de plasticidade celular, as células malignas pode remodelar a sua citoesqueleto de actina e para baixo-regular proteínas necessárias para contatos célula-célula. Os mecanismos de reorganização do citoesqueleto, resultando em morfologia mesenquimal e aumento do potencial invasivo são mal compreendidos. Actina nucleação forminas têm sido implicados como jogadores-chave na EMT. Aqui, analisamos que forminas sejam alterados de carcinoma epidermóide EMT relacionados. FHOD1, um formin pouco estudada, apareceu a ser marcadamente regulada mediante EMT. Em tecidos humanos FHOD1 foi expresso principalmente nas células mesenquimais, com pouca expressão nos epitélios. No entanto, as amostras de células cancerígenas escamosas orais demonstrou upregulation FHOD1 consistente em células mesenchymally transformadas na borda invasivo. Esta regulação positiva foi confirmada em um modelo de carcinoma epidermóide de boca, onde a expressão FHOD1 foi marcadamente aumentada após a EMT em um PI3K sinalização forma dependente. Nas células EMT FHOD1 contribuiu para a morfologia fusiforme e mesenquimais F-actina organização. Além disso, os ensaios funcionais demonstraram que FHOD1 contribui para a migração celular e invasão. Finalmente, a depleção FHOD1 reduziu a capacidade das células cancerosas EMT para formar invadopodia e de degradar a matriz extracelular. Nossos resultados indicam que FHOD1 participa de alterações do citoesqueleto na EMT. Além disso, mostramos que FHOD1 regulação positiva ocorre durante a célula cancerosa EMT

in vivo

, o que indica que FHOD1 pode contribuir para a progressão do tumor

Citation:. Gardberg M, Kaipio K, Lehtinen L, Mikkonen P, Heuser VD, Talvinen K, et al. (2013) FHOD1, um regulada Formin em epitelial-mesenquimal Transição, participa na migração de células cancerosas e Invasão. PLoS ONE 8 (9): e74923. doi: 10.1371 /journal.pone.0074923

editor: Pontus Aspenstrom, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 07 de agosto de 2013; Publicação: 26 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gardberg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo financiamento da Academia da Finlândia, Finska Läkaresällskapet, Sigrid Juselius Foundation, K Albin Johansson Foundation, The Organizações Cancer finlandesa e da Universidade de Turku fundos de pesquisa do hospital. Maria Gardberg é um Ph.D. estudante apoiado pela Escola Nacional de Pós-Graduação de Investigação Clínica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O citoesqueleto de actina é uma estrutura altamente plástico com capacidade de remodelar rapidamente sobre muitas pistas extra e intracelulares. Em epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), células epiteliais dissociar as suas junções célula-célula, e remodelar o seu citoesqueleto, para formar uma célula em forma de fuso com fibras de stress abundantes. O facto de as células de EMT permite a ser móveis é utilizada por cancros epiteliais para conseguir capacidade de invasão. EMT pode ser induzida tanto por factores ambientais, tais como a hipoxia, e por moléculas de sinalização extracelulares, tais como TGF-β. Up-regulação dos fatores de transcrição EMT, incluindo Caracol, Lesma, ZEB1 e ZEB2, leva à definidora de EMT infra-regulação da caderina-E [1], [2]. Embora o aumento dramático da F-actina e de stress fibras e morfologia do tipo fibroblastos são todas as características de EMT, a actina nucleadores envolvida na remodelação do citoesqueleto este ter sido mal caracterizado. Actina

forminas são altamente conservadas de nucleação que são proteínas apresentar em todos os organismos eucarióticos. O 2 (FH2) de domínio formin homologia é o elemento decisivo na forminas. As regiões flanqueando variam consideravelmente entre as proteínas Formin individuais, provavelmente resultando em diferentes funções celulares e mecanismos reguladores. Forminas catalisar a nucleação de actina no final farpado de filamentos de actina. Durante o alongamento forminas dimerizadas ficar ligado ao filamento, protegendo-o assim das moléculas de corte [3]. A actividade de forminas é regulada por GTPases Rho, interruptores moleculares que remodelam o citoesqueleto em diferentes compartimentos celulares, controlando a montagem de fibras de stress, a formação de adesão focal e o modo de motilidade em células [4] cancerosas, [5].

Como moduladores de organização celular, movimento e desenvolvimento, forminas são bons candidatos na busca de actina organizadores que permitem que as alterações do citoesqueleto profundas na EMT. No entanto, o papel de forminas em EMT não é conhecido em detalhe. Usando um modelo EMT oral, câncer de células escamosas (SCC), mostramos aqui que FHOD1, um formin principalmente mesenchymally expressa, é especificamente regulada durante a EMT. Em outros estudos, que mostram que FHOD1 é expressa também

in vivo

na frente invasiva do SCC e que é necessária para a manutenção da morfologia mesenquimais, a migração eficiente e invasão.

Materiais e Métodos linha de células

As linhas celulares

carcinoma de células escamosas oral (SCC) UT-SCC-43A foi derivado de um tumor gengival principal de um 75-year-old mulher caucasiana. O tumor foi encenado como T

4 N

1M

0, e foi histologicamente um grau 2 SCC [6]. UT-SCC-43B foi derivada de um tumor recorrente do mesmo paciente após a terapia de radiação e cirurgia. A linha celular 43A-SNA foi gerado por transfecção de células 43A com cADN de comprimento completo marcada com hemaglutinina de Snail de murino. As três linhas celulares foram estabelecidos anteriormente, e, anteriormente, foram encontrados para mostrar alterações no programa de diferenciação de células epiteliais através de diferentes mecanismos de supressão de E-caderina [7]. Antes da criação de ambas as linhas de células primárias UT-SCC-43A e UT-SCC-43B para a pesquisa, a aprovação do Comité Misto de Ética da Universidade de Turku e Turku University Hospital foi obtida, bem como o consentimento por escrito do doador [ ,,,0],7]. A linha imortalizada-telomerase microvascular humana de células do endotélio (TIME) e linha de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HMEC) foram um presente amável de MSc Johannes Keuschnigg (Universidade de Turku, Turku, Finlândia; linhas de células original dos ATCC). Outras linhas celulares foram adquiridos da ATCC e mantidos de acordo com as instruções do distribuidor.

dados de microarranjos transcriptomic e quantitativa em tempo real-PCR

A expressão gênica foi analisada utilizando o Illumina HumanHT-12 v4 Expressão BeadChip na Microarray finlandês e do Centro de Seqüenciamento, Centro de Turku de Biotecnologia. O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante e transformado em ADNc com o kit de síntese de cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os dados com base na matriz de linhas celulares foi carregado para ArrayExpress (número de acesso E-MTAB-1420).

TaqMan qRT-PCR foi realizada com um instrumento Applied Biosystems 7900HT (Finnish Microarray e Sequencing Centre). Sondas e iniciadores foram de Olig�ero, Helsinki, Finlândia. A quantificação foi efectuada com o software gestor RQ 1.2 usando o método ΔΔCT (Applied Biosystems). Três amostras replicadas foram estudados para a detecção da expressão de ARNm alvo e β-actina utilizada como um controle endógeno. As quantidades foram expressas como uma diferença n vezes relativamente à linha de células UT-SCC-43A. Os resultados são apresentados como médias ± DP. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student

t

-teste e Pearson coeficiente de correlação, salvo indicação em contrário. primers específicos de genes foram: DIAPH1 (forward 5′-cagtcaggggcagcattc-3 ‘, inverta 3′-cactgttcttggacaccttgg-5’), FHOD1 (forward 5’cctcagctgacacctccag-3 ‘, inverta 3′-cagcgcaacctgcttctc-5′), FHOD3 (forward 5’-ggccaggttggaaaggtc-3 ‘, 3′-inverter tctgctgccagtgactcttg-5′), FMNL3 (directo 5’-ccatcgaggacatcatcaca-3 ‘, 3′-inverter ccgagagggtctcagtgg-5’).

FHOD1 anticorpos

Um coelho FHOD1 anticorpo policlonal monoespecífico anti-humano foi produzido pelo programa Atlas proteína humana (HPA) [8], e está atualmente disponível ao público (HPA024468, Atlas Antibodies, Estocolmo, Suécia). Além disso caracterização de anticorpos é descrita na secção Resultados. Em algumas experiências, foi utilizado um outro anticorpo policlonal FHOD1 (Millipore, Bedford, MA, EUA). A reatividade dos dois anticorpos foi idêntico em western blot e colorações imunológicas.

Western blot e Northern de linhas de células humanas

As linhas celulares MDA-MB-231 (células de cancro da mama), WM164 (melanoma células), A431 (células de carcinoma de células escamosas), U138MG (células de glioblastoma), HUVEC (veia umbilical humana células endoteliais), HMEC (microvasculares dérmicas humanas células endoteliais), tempo, UT-SCC-43A, UT-SCC-43B e 43A -SNA foram colhidas e lisadas em tampão RIPA suplementado com inibidores de protease. Para cada ensaio, as amostras foram normalizados para a concentração de proteína e quantidades iguais de material em tampão de amostra de Laemmli foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para filtros de nitrocelulose. Para imunotransferência, o anticorpo anti-HPA FHOD1 foi incubada durante a noite a 1:2000 diluição em BSA /TBS /Tween a 0,1%, seguido por anticorpo secundário [conjugado com HRP suína anti-coelho (Dako, Glostrup, Dinamarca)]. As proteínas ligadas foram detectados por quimioluminescência aumentada. Em concorrência o péptido experimentar o anticorpo foi primeiro incubado com um excesso molar de 100 vezes de proteína de fusão GST-FHOD1 contendo os epitopos antigénicos de uma hora, ou com GST como controlo. carga de proteína foi controlada por imunotransf erência com um anticorpo α-tubulina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Epitelial transdifferentation /mesenquimais foi verificada por imunotransf erência com anticorpos anti-E-caderina e anticorpos anti-N-caderina (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

análise de transferência de Northern foi efectuada tal como descrito [9]. A sequência da sonda incluía a maior parte do epitopo de anticorpo (clone NCBI RNA RefSeq GenBank NM_013241.2, bases 1517-1810).

A inibição da MAPK /ERK e PI3K sinalização

UT- células SCC-43B foram plaqueadas em meio completo e cultivadas durante 24 horas antes do meio foi substituído por meio isento de soro e incubadas durante a noite. Em seguida, as células foram incubadas durante 4 dias em 10 uM MEK 1/2 U0126 inibidor (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) ou inibidor de PI3-quinase LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) em meio de soro para 1% e 10 U0126 meio de soro% de LY 294002. as células de controlo foram tratadas com o mesmo volume de veículo. Após a incubação, a eficácia da inibição da via de MAPK foi verificada por immunoblotting tal como descrito acima com 1:1000 diluições de anticorpos policlonais anti-fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (p-ERK 1/2) (Cell Signaling Technology) e ERK anti-2 (MAPK 2) anticorpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). inibição da via PI3K foi verificada por immunoblotting com anticorpo monoclonal anti-fosfo-Akt (Ser473) (p-Akt), monoclonal anti-Akt (pan) (ambos da Cell Signaling Technology).

Gene silenciamento

expressão FHOD1 transitoriamente foi derrubado em MDA-MB-231, células UT-SCC-43B HORA e usando

Smart

piscina siRNA (Dharmacon Research, Boulder, CA). Não segmentação Piscina de ARNip (Dharmacon) foi utilizada como um controlo. As células foram transfectadas com um Dharmafect (Dharmacon) de acordo com as instruções do fabricante. níveis FHOD1 foram examinados em lisados ​​de células 72 horas após a transfecção por immunoblotting.

In silico

análise transcriptomics

O banco de dados GeneSapiens foi utilizado para estudar a expressão de mRNA FHOD1 em todos os humanos tecidos normais [10]. As amostras incluídas nesta base de dados foram analisados ​​com a plataforma Affymetrix e devido a normalização e a qualidade dos dados originais verificações, os perfis de expressão de genes obtidos a partir de diferentes estudos podem ser combinadas para gerar uma visão geral do perfil de expressão em tecidos humanos.

imunohistoquímica

tecidos normais foram coletadas, fixadas e imunohistoquímica coradas como descrito [9]. A recolha de tecidos normais para este estudo foi aprovado pela Comissão Mista de Ética da Universidade de Turku e Turku University Hospital, bem como o consentimento por escrito dos doadores. As amostras de CEC oral incorporados 10 de parafina foram coletadas a partir do arquivo de tecido do Departamento de Patologia do Hospital Universitário de Turku com a aprovação da Comissão Mista de Ética da Universidade de Turku e Turku University Hospital. De acordo com a legislação finlandesa (Lei sobre a utilização de amostras de tecido para a investigação, [11, 20 §]), a permissão para utilizar amostras colhidas para fins de diagnóstico, é concedida pelas autoridades institucionais locais em situações, onde as informações do paciente não está incluído. Portanto, os pacientes não tenham sido consentido, mas a permissão foi concedida pelo comitê de ética local e o diretor médico do Hospital da Universidade de Turku. O anticorpo HPA FHOD1 foi utilizado a uma diluição 1:250. tecidos e tipos de células individuais foram avaliadas por conseguir a intensidade de coloração por classificação de 0 (sem coloração) a +++ (coloração forte).

Microscopia de imunofluorescência e quantificação de

F-actina

UT células SCC-43A e UT-SCC-43B foram cultivadas em lamelas revestidas com gelatina, e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 min. As células foram permeabilizadas com acetona fria durante 4 min. Depois de 30 min em 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS, as células foram incubadas durante 1 h com o anticorpo FHOD1 (1: 250), seguido por um anticorpo secundário, conjugado com Alexa 568-cabra anti-coelho (1:500 , Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). F-actina foi visualizado com Alexa 488-faloidina conjugada (Molecular Probes). Os meios de montagem para a coloração DAPI continham núcleos (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Invadopodia foram visualizadas por coloração de imunof luorescência com anti-1:200 cortactina (Millipore). As células plasmáticas foram identificados com anti-CD138 mAb (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EUA). Alexa Fluor 568 conjugado com anticorpo de cabra anti-rato foi utilizada como anticorpo secundário (Molecular Probes). As células foram fotografadas com microscopia de imunofluorescência ou de uma Zeiss LSM 510 Meta microscópio confocal (Carl Zeiss, 63 objectivo × Plano Apochromat, Göttingen, Alemanha). Imagem J 1.42q software (NIH, EUA) foi utilizado na análise de imagem. Quantificação de F-actina em células UT-SCC-43B foi feita por análise de coloração com faloidina Alexa 488-conjugado a partir de imagens confocais de 20 células de cada experimento. intensidades fluorescentes médios foram medidos a partir do citoplasma da célula. A importância do experimento foi calculada utilizando Estudantes amostras independentes

t

-teste.

cicatrização de feridas e ensaios de invasão

A migração de células UT-SCC-43B tratados com FHOD1 ou não segmentação siRNAs foi estudado em 24-well-placas revestidas com gelatina. Uma ferida foi criado por raspagem manualmente a monocamada de células com uma ponta de pipeta 10 ul. As células foram lavadas com PBS, e meio filtrado foi adicionado. Uma imagem de células que migram para dentro da ferida foi feita em intervalos de 10 min durante 24 h. software ImageJ foi usado para medir a área da ferida a intervalos de 1 h. As feridas foram analisados ​​por meio de análise de medidas repetidas de variância (rmANOVA). Tempo foi realizada como efeito repetido e grupo como efeito fixo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o sistema de SAS para Windows, Versão 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). O efeito de silenciamento FHOD1 na capacidade invasiva de células UT-SCC-43B foi estudada usando o sistema de imagem em tempo real IncuCyte (Essen BioScience, Ann Arbor, Michigan, EUA). As células UT-SCC-43B tratados com FHOD1 siRNA ou ARNsi de não codificação e células de controlo não tratadas foram plaqueadas em placas de 96 poços (placa ImageLock, Essen BioScience, MI) revestida com o Factor 50 ul 10% de redução do crescimento de Matrigel (BD Biosciences) depois que as células foram deixadas ligar-se o /n a + 37 ° C. A ferida foi riscado em cada (fabricante de Feridas, Essen BioScience) bem e o meio de crescimento foi removido. As células foram então cuidadosamente coberta com 50 uL de 25% de Matrigel em meio de crescimento normal e foram incubadas em 37 ° C durante 2-3 horas para permitir a gelificação, após o que 100 uL de meio de crescimento foi cuidadosamente adicionada a cada poço. A taxa de invasão (encerramento de feridas através da matriz) foi monitorizada a cada hora com o software de imagiologia Incucyte (Essen BioScience) durante 72 horas. eficiência invasão foi determinada como percentual da confluência ferida relativa em comparação com respectivo controle negativo (considerado como 100%).

Medição da degradação da matriz extracelular e invadopodia quantificação

Para analisar a influência da FHOD1 knockdown na matriz extracelular (ECM) degradação e invadopodia formação de células UT-SCC-43B, as células foram tratadas com não codificante siRNA e FHOD1 siRNA como acima descrito e plaqueadas em 8 poços lâminas de vidro pré-revestidas com gelatina Cy3 rotulados de acordo com a instruções do fabricante (QCM gelatina Invadopodia Assay (vermelho), Millipore). Após 24 h de incubação a 37 ° C as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas para a microscopia de imunofluorescência com anticorpos anti-cortactina ou faloidina. A degradação ECM era visível como focos escuro desprovido de fluorescência. As imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência Olympus BX60 (Olympus Microscópios, Essex, UK). cavidades de degradação produzidos por células foram fotografadas e áreas de reabsorção por célula (px) foram medidos com o software ImageJ. Para cada grupo, a degradação média de 100 células de oito poços foi comparada. Para avaliar a formação invadopodia, as células foram verificados para saliências comet- ou anel-como ricas em actina com coloração cortactina positiva na superfície ventral. A percentagem de células que contêm invadopodia foi contado a partir de 10 campos diferentes em cada grupo. As diferenças entre os grupos foram testadas para significância por ANOVA (Tukey post hoc) em ambos os experimentos.

Resultados

regulação transcricional do forminas durante EMT associado a um cancro

Foram utilizados três modelos linhas de células para avaliar alterações na expressão formin durante EMT associado a um cancro. UT-SCC-43A é uma linha de células orais SCC do tumor primário e UT-SCC-43B é uma linha a partir do mesmo tumor recorrente após cirurgia e radioterapia. O tumor foi submetido a uma recorrentes EMT espontânea, como demonstrado por vários marcadores [7]. A terceira linha de células, 43A-SNA, foi criada por transfecção de células UT-SCC-43A com Snail para induzir EMT.

Análise de Transcriptoma revelou que as linhas de células mesenquimais UT-SCC-43B e 43A-SNA tem 35 -regulada genes (logFC ≥2, p≤0.001) e 153 genes regulados negativamente (logFC ≤ -2, p≤0.001) em comum (Figura 1 a; listas de genes apresentados na Tabela S1). Em UT-SCC43B e 43A-SNA, estabelecidos EMT-marcadores, tais como N-caderina, vimentina e colágenos estavam sobre-regulada (Figura 1 B), enquanto marcadores epiteliais como a E-caderina, queratinas, integrinas e lamininas foram simultaneamente down- regulada indicando que as alterações transcriptomic são consistentes com EMT.

a) Microarray profiling transcriptomic da UT-SCC-43A, UT-SCC-43B e 43A células-SNA. Transcrições significativamente alteradas em células UT-SCC-43B, em comparação com células UT-SCC-43A está indicado pelo círculo azul e transcritos em células alteradas 43A-SNA em comparação com a UT-SCC-43A está indicado pelo círculo verde. O número de genes alterados em ambas as comparações é mostrado na zona de sobreposição. O número de genes supra-regulados é mostrado nos genes de cima e de baixo-regulados na parte inferior. B) alterações nos níveis de mRNA para epitelial seleccionado (top) e mesenquimais genes (em baixo). genes descritos codificam proteínas seguinte: CDH1 = E-caderina, CLDN3 = Claudin 3, CLDN 7 = Claudin 7, KRT5 = queratina 5, KRT6B = queratina 6b, CDH2 = N-caderina, VIM = Vimentin. C) os níveis de mRNA para forminas com alterações significativas em ambas as células UT-SCC-43B e 43A-SNA que foram posteriormente confirmados por RT-PCR. D) os níveis de mRNA para forminas confirmados por RT-PCR.

Dos 13 membros da família Formin incluído na matriz (DAAM1, DAAM2, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, FHOD1, FHOD3, FMN1, FMN2, FMNL1, FMNL2, FMNL3, INF2), dois eram consistentemente sobre-regulada e quatro foram regulados negativamente durante a EMT. A sobre-regulação mais significativa foi observada com FHOD1, que foi aumentada de 2,3 vezes em UT-SCC-43B e 3,2 vezes na 43A-SNA quando comparado com a UT-SCC-43A (Figura 1 C). As diferenças de transcrição significativas foram ainda verificadas por qRT-PCR, que demonstrou a regulação positiva de forminas FHOD1 e FMNL3 e regulação negativa da FHOD3 e DIAPH1 em ambas as células UT-SCC-43B e 43A-SNA (Figura 1 D).

caracterização de FHOD1 humano e seu padrão de expressão

Como FHOD1 foi o formin mais up-regulada na EMT, decidimos estudar mais esta proteína pouco caracterizados. O perfil de expressão FHOD1 humana não é conhecido, em grande parte devido à falta de anticorpos adequados. Nós levou vantagem de um anticorpo FHOD1 levantada pelo projeto Atlas proteína humana. Na transferência de Western, o anticorpo reagiu com várias linhas endoteliais e de células de cancro humanas. Uma única banda de 145 kDa, que é ligeiramente maior do que o predito 127 kDa, foi detectada em todas as linhas celulares testadas (Figura S1 A). Uma faixa semelhante também foi visto com outro anticorpo FHOD1. A ampla reactividade está de acordo com resultados anteriores demonstrando a expressão FHOD1 na maioria das linhas celulares imortalizadas [11].

Para testar adicionalmente a especificidade do anticorpo de HPA, a reactividade foi bloqueada com o fragmento de GST ou GST-antigénico FHOD1 . Como FHOD1 é considerado para ser um formin endotelial [12], utilizou-se lisados ​​a partir de três linhas de células endoteliais: HMEC, HORA e HUVEC. A incubação com a GST-FHOD1-péptido aboliu praticamente a detecção das bandas de 145 kDa em todas as linhas celulares (Figura S1 B), enquanto que a incubação com GST não tem qualquer efeito. Finalmente, confirmou-se a especificidade por transfecção de células MDA-MB-231 com pequeno (Si) ou ARN FHOD1 interferir com o controlo não-segmentação siARN. Após o tratamento FHOD1 siRNA, a reactividade do anticorpo foi significativamente reduzida enquanto que a reactividade em células transfectadas com ARNsi de controlo não foi afectada (Figura S1 C).

O transcrito FHOD1 em linhas celulares foi analisada por Northern blotting. A análise revelou um único transcrito de 4,0 kb em todas as cinco linhas celulares, combinando o resultado da análise de Western blot (Figura S1 D).

Para investigar sistematicamente que os tecidos e tipos de células expressam FHOD1, coloração imuno-histoquímica usando o HPA FHOD1 anticorpo foi realizada em 26 tecidos humanos diferentes. Em praticamente todas as amostras de células endoteliais capilares eram imunorreactivos, embora com intensidade de coloração variável. A coloração mais intensa FHOD1 foi visto nos pequenos vasos sanguíneos do baço (Figura 2 A), do endométrio (Figura 2 B), ovário (Figura 2 C) e em vasos peritoneais abaixo do mesotélio. Na maioria dos tipos de tecidos e células, as células do parênquima demonstrou pouca ou nenhuma reactividade FHOD1. Por exemplo, no cérebro, nem células nervosas nem células gliais FHOD1 expressos (Figura 2 D). As células endoteliais capilares cerebrais em, por outro lado, expressa FHOD1. Um pequeno subconjunto de linfócitos nos gânglios linfáticos (Figura 2E), o baço, a medula óssea (Figura 2 M) e na mucosa intestinal (Figura 2 L) coradas intensamente. No pulmão, a expressão moderada foi observada nos macrófagos alveolares (Figura 2 H). Os resultados da análise imuno-histoquímica estão apresentados na Tabela 1. coloração subsequente com marcadores específicos do subtipo de linfócitos revelaram que o subconjunto de linfócitos que expressam FHOD1 consistiu de CD138-positivo células plasmáticas (Figuras 2 I e J).

tecidos humanos normais embebidos em parafina foram coradas com anticorpo FHOD1. A) No baço, as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos mostram imunorreatividade intensa FHOD1. B) estroma endometrial e glândulas expressam pouco FHOD1. As células endoteliais em paredes dos vasos sanguíneos são fortemente coradas (setas). C) No ovário, os oócitos (O) e células do folículo (asterisco) expressam pouco FHOD1. D) No cérebro, nem neurônios nem células gliais mostrar coloração FHOD1. As células endoteliais em vasos capilares hora (setas) mancha fracamente. E) No linfonodo, a maioria dos linfócitos manchar fracamente. células marcadas fortemente ocasionais têm a morfologia das células do plasma (setas abertas). F) Na medula óssea, as células estimuladoras da eritropoiese não expressam FHOD1. células mielopoiéticas e megacariócitos (M) mancha fracamente. pequenas células ocasionais que expressam FHOD1 fortemente (setas abertas) são células plasmáticas. G) Na mucosa do cólon, células epiteliais mostram um fraco nível de coloração FHOD1. células estromais de plasma (setas abertas) expressar FHOD1 fortemente. H) epitélio alveolar nas manchas pulmonares fracamente para FHOD1, enquanto os macrófagos alveolares (MP) mostram coloração FHOD1 moderado. I, J) A coloração por imunofluorescência dupla de células inflamatórias FHOD1-positivos demonstra que as mesmas células expressam CD138 (pontas de seta). A morfologia celular e CD138 indicar que são células de plasma. Em A-H barra de escala = 100 mm.

Nós concluímos que FHOD1 é expressa em muitos tecidos, mas em tipos de células única restritas. É de notar que todos os tipos de células que coram fortemente são de origem mesenquimal. Combina com o

in silico

perfil mRNA obtido a partir de uma pesquisa de banco de dados GeneSapiens [10] (Figura S2). A expressão ubíqua FHOD1 baixo em todos os tecidos normais pode ser atribuído à expressão nas células endoteliais. expressão mais elevado pode ser visto em tecidos onde as células parenquimatosas também coradas em imuno-histoquímica,

i.

músculo esquelético, da mama e do ovário. Embora o nível de ARNm em amostras de tecido mesoteliais é relativamente elevada, células mesoteliais não coraram com o anticorpo FHOD1. Os níveis elevados de ARNm são, provavelmente, devido ao endotélio abundante nos capilares abaixo do mesotélio. Nesses vasos, coloração imuno-histoquímica FHOD1 era forte.

EMT leva a dependente da via FHOD1 regulação positiva e morfológicas alterações PI3K

Embora os resultados de imuno-histoquímica e em

silico

mRNA perfil sugerida FHOD1 expressão mínima em tipos de células epiteliais, os nossos resultados e transcriptômica GeneSapiens bioinformática levantamento de carcinomas (não mostrados) indicaram níveis moderados de ARNm em certos cancros. Por exemplo, o valor normalizado expressão significativo de adenocarcinoma de pulmão era de 850, em comparação com 400 no sistema respiratório, e o valor de SCC oral foi de 800, em comparação com 100 em pele normal (valores para a mucosa oral não estavam disponíveis). Para investigar se a regulação positiva de FHOD1 ocorre em CEC oral clínica, escolhemos aleatoriamente dez espécimes CEC oral para análise imuno-histoquímica. Como EMT é pensado para ocorrer

in vivo

na borda invasiva de cancros epiteliais, não poderia ser utilizado microarrays de tecido. Não foi encontrada nenhuma reactividade no epitélio escamoso estratificado não neoplásico da mucosa oral em qualquer um dos casos, enquanto moderada a forte coloração FHOD1 foi consistentemente observado nas células SCC invasivas com uma morfologia em forma de fuso mesenquimais (Figura 3 A). Curiosamente, FHOD1 imunorreactividade foi leve ou ausente nas áreas bem diferenciadas de cancro invasivo, indicando que a maior parte do tumor que consiste em áreas celulares com diferenciação epitelial expressa pouco FHOD1.

A) Em condições normais ou não neoplásico estratificada epitélio escamoso, não pode ser detectado FHOD1 (topo). Em carcinomas de células escamosas invasivos, moderada a forte imunorreatividade FHOD1 é visto em células fusiformes na frente invasiva que por razões morfológicas foram submetidos a EMT (parte inferior; detalhes em baixo-relevo). Na maior parte do tumor, o qual consiste de células com uma morfologia epitelial, apenas a imunorreactividade fraca está presente. Barra de escala: 200? m. B) Análise de Western blot de linhas celulares mostram que o epitélio linha de células SCC UT-SCC-43A não expressa detectável FHOD1, enquanto que tanto a linha de células EMT espontânea a linha de células EMT-induzida Snail 43A-SNA UT-SCC-43B e expressar FHOD1. UT-SCC-43A expressa o marcador E-caderina epitelial, mas não N-caderina, enquanto UT-SCC43-B e 43A-SNA expressam N-caderina, mas não caderina-E. C) organização F-actina de UT-SCC-43A (painel superior) é tipicamente epitelial, com filamentos submembraneous celulares distintas e fibras de stress escassos. UT-SCC-43B mostra características de organização mesenquimais (painel do meio). contatos célula-célula são poucos, as células são alongadas e contêm fibras lamellopodia, filopódios e estresse. O inserto (painel inferior) mostra que uma fracção de FHOD1 co-localiza com fibras de stress em células UT-SCC-43B (pontas de seta). Os núcleos são corados com DAPI (azul). D) FHOD1 regulação positiva em células UT-SCC-43B é dependente da sinalização PI3K. O tratamento com MEK 1/2 U0126 inibidor reduz a fosforilação de ERK 1/2, mas não influencia a expressão FHOD1. Em contraste, a inibição de PI3K por LY294992 reduz acentuadamente expressão FHOD1. A redução do p-Akt indica que o caminho é eficientemente inibida.

Em seguida, estudamos se a expressão FHOD1 foi associada com alterações morfológicas e funcionais em EMT. Das três linhas de células SCC orais, detectável FHOD1 foi visto em UT-SCC-43B e 43A-SNA mas não em UT-SCC-43A, indicando que também ao nível da proteína, FHOD1 sobre-regulação ocorre no EMT tanto no espontânea e Snail induzida modelo (Figura 3 B). Como esperado, a UT-SCC-43A expressa a caderina-E, mas não N-caderina, enquanto UT-SCC-43B e 43A-SNA expressa N-caderina, mas não caderina-E (Figura 3 B).

A linhas celulares também mostraram características morfológicas distintas e organização do citoesqueleto de actina. As células UT-SCC-43A tinha um fenótipo epitelial típica, como se formaram camadas de células com contactos célula-a-célula e fibras de stress escassos (Figura 3 C, painel superior). UT-SCC-43B, por outro lado, consistiu em células ligeiramente alongadas com muitos filopodia e fibras de stress abundantes (Figura 3 C, painel do meio). A distribuição de FHOD1 foi em parte pontuar e citoplasmática, mas também claramente localizada salientar fibras (Figura 3 C, painel inferior).

Em SCC oral, vias de sinalização comumente ativados em EMT incluem o fosfatidilinositol-s- quinase (PI3K) e vias de cinase Mitogen-activated protein (MAPK /ERK 1/2) [13]. Para investigar se a regulação positiva FHOD1 era dependente da activação de qualquer uma destas vias de sinalização, as células foram tratadas com PI3K e MEK1 /2 inibidores. A inibição de MEK1 /2 não influenciou a expressão FHOD1, embora a via foi eficientemente inibida. Em contraste, a inibição da PI3K reduzida substancialmente expressão FHOD1 (Figura 3 D). Essa descoberta indica que a expressão FHOD1 na UT-SCC-43B é dependente da sinalização PI3K.

FHOD1 knockdown reprime morfologia mesenquimal, migração e invasão em células UT-SCC-43B

O significado funcional