Abstract
Fundo
associação epidemiológica de câncer de cabeça e pescoço com o tabaco sem fumaça (ST) enfatiza a precisa desvendar os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do câncer, e identificar agentes farmacologicamente seguros para a intervenção precoce e prevenção da recorrência da doença. Guggulsterone (GS), um biosseguro nutracêutico, inibe a via de PI3K /Akt, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento de carcinoma epidermóide. No entanto, o potencial do GS para suprimir ST e nicotina (principal componente da ST) induzida HNSCC permanece inexplorado. Trabalhamos com a hipótese GS pode revogar os efeitos da ST e nicotina sobre a apoptose em células de CECP, em parte pela ativação de PI3K /Akt e seus alvos a jusante, Bax e Bad.
Métodos e Resultados
os nossos resultados mostraram ST e tratamento com nicotina resultou na activação de PI3K, PDK1, Akt, e suas proteínas a jusante – Raf, GSK3β e PS6 enquanto GS induziram uma diminuição dependente do tempo na activação da via PI3K /Akt. ST e tratamento de nicotina também resultou na indução de Bad e Bax fosforilação, aumentou a associação de Bad com 14-3-3ζresulting em seu sequestro no citoplasma das células cancerígenas de cabeça e pescoço, bloqueando assim a sua função pró-apoptótica. Notavelmente, GS pré-tratamento inibiu a ativação induzida ST /nicotina de PI3K /Akt, e inibiu a fosforilação mediada Akt de Bax e Bad.
Conclusões
Em conclusão, o tratamento GS não só inibiu proliferação, mas também induziu apoptose mediante a anulação dos efeitos da ST /nicotina sobre PI3K /Akt nas células do câncer de cabeça e pescoço. Estes resultados fornecem uma base racional para a concepção de futuros estudos para avaliar o potencial quimiopreventivo do GS in /nicotina associada câncer de cabeça e pescoço ST
Citation:. Macha MA, Matta A, Chauhan SS, Siu KWM, Ralhan R (2011 ) Guggulsterone Metas do tabaco sem fumaça Induced PI3K /Akt em células de cabeça e pescoço. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10.1371 /journal.pone.0014728
editor: Madhuri Kango-Singh, da Universidade de Dayton, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Julho, 2010; Aceito: 14 de dezembro de 2010; Publicação: 24 de fevereiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Macha et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Muzafar A . Macha é um receptor de um Senior Research Fellowship do Conselho de Investigação Científica e industrial (CSIR), Nova Deli, Índia. Ajay Matta é o destinatário de uma MITACS Acelerar Fellowship, Ontário, Canadá. Ranju Ralhan agradece o apoio do José e Mildred Sonshine Centro de Cabeça e Doenças do pescoço, Alex e Simona Shnaider Laboratório de Oncologia Molecular, Temmy Latner /Dynacare, e do Departamento de Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Mount Sinai Hospital, Universidade de Toronto . K.W. Michael Siu reconhece financiamento do Instituto Ontário de Câncer Research (OICR), e apoio de infra-estrutura da Research Ontario e Desenvolvimento Challenge Fund e AB SCIEX. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) continua a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo com as taxas de sobrevivência de cinco anos de cerca de 50%, marcado por recorrência frequente ou formação de segundo tumor primário (10-25% do casos) [1], [2]. Em uma escala global, o uso de produtos do tabaco é o principal fator de risco, com o tabaco sem fumaça (ST) Consumo sendo ligada à alta incidência de HNSCC [3] – [5]. ST é usado em múltiplas formas ou seja naswar, Gutkha, khaini (uma mistura de ST com cal) e tem, ou com quid betel, foi classificada como carcinógeno humano pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) [6], [7] . A associação do tabagismo com CECP é bem conhecida, mas a ligação entre o uso ST e câncer de cabeça e pescoço é emergente. Em um relatório recente, Stepanov
et al.
[8] identificou 23 hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) em ST, além de nitrosaminas e nicotina como relatado em estudos anteriores [7]. A nicotina melhora a proliferação, acelera o crescimento do tumor e inibe a apoptose em certos tipos de linhas de células de cancro humano e induz a angiogénese in vivo por activação sustentada das vias mitogénicas [9] – [11]. A nicotina tem sido relatada para inibir a apoptose induzida por opióides e o stress genotóxico induzida por etoposido, cisplatina, ou irradiação por UV em células de cancro do pulmão [12], [13]. Além disso, a nicotina activa a via PI3K /Akt e inibe as funções pró-apoptóticos de Bax e Bad através da fosforilação [14], [15]. Estas descobertas levaram-nos a investigar se a ST (khaini) induz PI3K /Akt ativação da via em células de câncer de cabeça e pescoço.
Além disso, a identificação de agentes quimiopreventivos farmacologicamente seguros que pode suprimir ST /nicotina PI3K induzida /Akt na HNSCC é provável que tenha o potencial de prevenir ST cabeça induzida e carcinogênese pescoço. Guggulsterone (GS), (4,17 (20) -pregnadien- 3,16-diona), um componente da planta medicinal indiana Ayurveda
Commiphora mukul
é um nutracêutico biosseguro com propriedades anti-neoplásicas [16] – [18]. GS tem sido relatado para induzir a apoptose, suprimir a proliferação, invasão, angiogénese, metástase e resistência aos medicamentos reverter, tornando-se um potencial agente anti-cancro complementar [19] – [24]. GS se liga ao receptor X farnesoid e tem sido demonstrado para modular a expressão de proteínas envolvidas na apoptose (IAP1, XIAP, Bfl-1 /A1, Bcl-2, cFLIP, survivina), a proliferação de células (ciclina D1, c-Myc), angiogénese e metástases (MMP-9, a COX-2, VEGF) [25]. Este esteróis exerce os seus efeitos biológicos através de regulamento de fatores de transcrição – o fator nuclear kappa B (NFkB), STAT-3 e alfa C /EBP, e receptores de esteróides – receptores de glicocorticóides e receptor de andrógeno. O nosso grupo e outros demonstrou recentemente atividade anticancerígena de GS em CECP e de células de mieloma linhas por inibição do NFkB e STAT3; estudos subsequentes relataram efeitos semelhantes em outras linhas de células de cancro e em modelos animais de cancro do cólon e pele [19], [24], [26].
Neste estudo, investigou-se a activação da via PI3K /Akt em células de câncer de cabeça e pescoço em tratamento com ST /nicotina e sua inativação por GS. Além disso, nós desafiamos a activação da Akt e seus alvos a jusante (PS6, GSK3β e Raf), por ST /nicotina em células de câncer de cabeça e pescoço (SCC4) por pré-tratamento com GS.
Resultados
Efeito do ST e nicotina ativar a via PI3K /Akt nas células do câncer de cabeça e pescoço
da dose e tempo cinética de ST e nicotina (componente viciante do tabaco) de tratamento em células de câncer de cabeça e pescoço (SCC4 e HSC2 ), foram determinadas pelo ensaio de MTT (Figura 1A e 1B). cinética similar foi observado em ambas as linhas celulares e os resultados para SCC4 células são mostradas na Figura 1. A exposição à ST e proliferação de células de nicotina aumentaram em ambos as linhas de células de cancro da cabeça e do pescoço de uma forma dependente da dose com uma dose óptima de 20 ug /ml para a ST e 10 uM de nicotina. Estas doses óptimas têm sido utilizados em todas as experiências subsequentes. Para investigar o efeito de ST ou nicotina no Akt em células CECP, ambas as células SCC4 e HSC2 foram tratadas com 20 ug /ml de ST ou com nicotina (10? M) durante intervalos de tempo diferentes ou mantido não tratado, e a activação de Akt (Akt na fosforilação de Ser-473 e Ser-309) foi determinada nos extractos de proteína por transferência de western. Tanto ST e nicotina aumentaram rapidamente Akt fosforilação sem afectar os níveis de Akt total em ambas as células e HSC2 SCC4 (Figura 2A e 2B, respectivamente). Estes estudos demonstram que a ST e nicotina activar Akt em doses que podem ser fisiologicamente relevante. Além disso, a análise de Western blot mostrou tanto ST e nicotina induziu um aumento dependente do tempo da fosforilação de ambas as cinases a montante, de PI3K e PDK1, bem como os alvos a jusante, raf, GSK3β, e PS6 em células SCC4 (Figura 2A e 2B ), que reflectida do rápido início do aumento da fosforilação de Akt. Descobertas similares foram observados em ambas as linhas celulares (SCC4 e HSC2) Por conseguinte, os dados para apenas SCC4 células foram mostrados aqui.
As células foram tratadas com (A) ST (1-500 ug /ml), ( B) nicotina (1-100 uM) de 24-96 h. Figura retrata média de três experimentos feito de forma independente.
células SCC4 (2-3 × 10
6) foram tratados com (A) ST (20 ug /ml) ou (B) nicotina ( Prepararam-se 10 uM), para os intervalos de tempo indicados e extractos de células inteiras. extractos de célula inteira (60 ug de proteína) foram resolvidas em 10% SDS-PAGE, electrotransferidas para uma membrana de PVDF e não específica foi bloqueada com 5% de leite desnatado durante a noite de ligação. A expressão de proteínas foi determinada por sondagem com anticorpos específicos para fosfo-pAkt (thr-309), de pAkt (Ser-473). pGSKβ3, PRAF, pPDK1 e Akt usando o método de quimiluminescência reforçada. Western blot para α-tubulina foi feito para mostrar carga de proteína iguais.
activação Efeito da guggulsterone em ST e nicotina induzida da via PI3K /Akt
Ambos ST e estimulação nicotina induzida de Akt, portanto, nós investigamos o efeito de GS em ST e nicotina induziu activação de Akt. SCC4 células foram tratadas com GS (50 uM) durante intervalos de tempo diferentes e os seus extractos de proteína foram testados para a activação de Akt. Como mostrado na Figura 3A, GS inibiu a activação de Akt, a montante quinases PI3K, PDK1, bem como as proteínas a jusante, Raf, GSK3β, e PS6. A normalização dose de inibidor de PI3K /Akt, LY294002, foi levada a cabo por tratamento das células com diferentes concentrações SCC4 do inibidor (0,5-10? M) durante 1 h. Tal como mostrado na Figura 3B, LY294002 (10 uM) inibiu completamente a expressão de Akt activado; enquanto não se observou qualquer efeito sobre o total dos níveis de expressão de Akt. SCC4 células foram pré-tratadas com GS durante 4 h ou LY294002 (10 uM) durante 60 min, seguido de ST (20 ug /ml) durante 6 h ou nicotina (10? M) durante 4 h. Os resultados indicam que a GS, bem como LY294002 bloqueado ST e activação da via de Akt induzida por nicotina (Figura 3C), embora nenhum efeito foi observado sobre a expressão da Akt total e GSK3β nestes pontos de tempo.
células SCC4 ( 2-3 × 10
6) foram tratados com (GS) a (50 uM) para os intervalos de tempo indicados, e /ou (B) com o LY294002 em diferentes concentrações durante 1 h. (C) As células SCC4 (2-3 × 10
6) foram pré-tratadas com 50 um GS durante 4 h, ou com LY294002 (10 uM) durante 1 h e estimuladas com ST (20 ug /ml) durante 6 h , ou com nicotina (10? M) durante 4 h. Sessenta microgramas de proteínas a partir de extractos de células completas foram resolvidos em 10% SDS-PAGE, electrotransferidas para uma membrana de PVDF seguido de bloqueio com 5% durante a noite leite não gordo. a expressão da proteína foi determinada por sondagem com anticorpos específicos utilizando o método de quimiluminescência reforçada.
Guggulsterone e inibidor específico da PI3K LY294002 bloco ST e nicotina induzida Bad e Bax fosforilação
Ambos ST e nicotina potente estimulou a fosforilação da serina de Bad Bax e de uma forma dependente do tempo (Figura 4A e 4B), resultando na revogação da sua função pró-apoptótico. Para demonstrar um papel funcional de Akt como a ST fisiológico e nicotina activado Bax e Bad quinase, LY294002, um inibidor específico de PI3K que pode bloquear a via PI3K /Akt via de sinalização, foi usado. SCC4 células foram pré-tratadas com LY294002 (10 uM) durante 60 min ou 50 um GS durante 4 h seguida por ST (20 ug /ml) durante 6 h com ou nicotina (10? M) durante 4 h. GS, bem como LY294002 bloqueado ST e nicotina induzida Bax e Bad fosforilação (Figura 4A e 4B). Não se observou qualquer efeito na expressão de um total de Bad e Bax em todos esses momentos. Estes resultados sugerem que a inibição da ST e nicotina induzida Bax e Bad fosforilação por GS pode restaurar a função pró-apoptótica destas moléculas.
células SCC4 (2-3 × 10
6) foram tratados com ( a) ST (20 ug /ml) ou (B) a nicotina (10? M) para os intervalos de tempo indicados. células SCC4 foram pré-tratados com LY294002 (10 uM) durante 60 minutos, ou 50 um GS de 4 h, seguido de ST (20 ug /ml) durante 4 h, ou com nicotina (10? M) durante 4 h, e toda foram preparados extractos -cell. Sessenta proteínas microgramas de extractos de células completas foram resolvidos em 10% SDS-PAGE, electrotransferidas para uma membrana de PVDF seguida de bloqueamento com leite não gordo a 5% durante a noite. A expressão de proteínas foi determinada utilizando o método de quimioluminescência aumentada e sondados por anticorpos contra pBAD e PBAX. As manchas foram despojado e sondado para Bax e proteínas Bad.
Akt é co-localizada com Bax no citoplasma
Para avaliar um papel direto potencial de Akt como Bax quinase fisiológico, distribuição sub-celular de Akt e Bax foram avaliados por coloração por imunofluorescência. Bax foi principalmente co-localizada com Akt no citoplasma das células SCC4 (Figura 5A), sugerindo que a AKT tanto ST e nicotina activado tem o potencial para fosforilar directamente e inactivar Bax em células SCC4.
A fosforilação de Bad e Bax resultados na retenção dessas proteínas no citoplasma e falha em direcionar mitocôndrias
Nossos resultados demonstraram que ST e nicotina pode induzir Bax fosforilação (Ser-184) e Bad (ser-136), e fosforilação nesses locais resultou em inactivação da função pró-apoptótica de Bax e Bad. É bem conhecido que a actividade pró-apoptótica de Bax e Bad é dependente da sua citosólico ou localização mitocondrial. Para testar se a fosforilação de Bax e Maus efeitos sua localização subcelular, células SCC4 foram mantidos sem tratamento ou tratada com GS (50? M) durante 4 h, ST (20 ug /ml) durante 6 h e a nicotina (10? M) durante 4 h. fraccionamentos sub-celulares foram realizadas para isolar mitocôndrias e citosol, conforme descrito em materiais e métodos. Em células não tratadas SCC4, Bax maioria de Bad e foi encontrada no citosol, e apenas uma pequena quantidade destas proteínas, foi localizada nas mitocôndrias (Figura 5B). Em GS foram observadas células tratadas maioria destas proteínas na fracção mitocondrial. Em contraste, tanto em células ST e nicotina tratada, Bax e Bad foram predominantemente observados no citosol (Figura 5B).
Notavelmente, pré-tratamento das células com SCC4 GS (50? M) durante 4 h, seguido por ST (20 ug /ml) durante 6 h tratamento ou nicotina (10? M) durante 4 h, mostrou uma mudança na localização de Bad e Bax e maioria destas proteínas foram observados na fracção mitocondrial (Figura 5B). Para confirmar o grau de pureza das fracções subcelulares obtidos, succinato desidrogenase, uma proteína exclusiva para as mitocôndrias, foi avaliada por Western blotting. desidrogenase de succinato, foi detectada apenas na fracção mitocondrial e não no citosol (Figura 5B), confirmando a pureza das fracções mitocondriais e citosólicas. β-actina foi utilizado como o controlo, para assegurar carga igual de proteína em todas as pistas.
SCC4 células (5 × 10
3) foram plaqueadas em lamelas e incubadas com um anticorpo de ratinho contra o Bax humano e um anticorpo de coelho contra anticorpos humanos AKT. Alexa flour®594 -conjugated anti-coelho (vermelho) e conjugado-isotiocianato de fluoresceína (verde) os anticorpos secundários anti-murganho foram usados para visualizar Akt (vermelho) e os padrões de localização de Bax (verde), utilizando um microscópio de fluorescência. Painel (i) DAPI núcleos na cor azul manchado; (Ii) a expressão citoplasmática de Bax; (Iii) expressão citoplasmática de proteínas Akt; e (iv) fundiu fotomicrografia (II) e (III) que mostra a co-localização de Bax e Akt. (B) A fosforilação da Bax em (Ser-184) e Bad (Ser-136) resulta em retenção de Bax e Bad em citosol. SCC4 células foram mantidas sem tratamento ou tratada com 50 um GS durante 4 h, ST (20 ug /ml) durante 6 h, 10 uM de nicotina durante 4 h. SCC4 células foram pré-tratadas com 50 um GS de 4 h, seguido por ST durante 6 h ou com nicotina durante 4 h. Citoplasmáticos (C) e mitocondrial (H) Os extractos foram preparados como descrito em Materiais e Métodos e separadas em 10% SDS-PAGE. As proteínas foram então electro-transferidas em uma membrana de PVDF seguida de bloqueamento com leite a 5% sem gordura durante a noite. As manchas foram incubadas com anticorpos específicos contra Bax e Bad. A expressão de proteínas foi determinada utilizando o método de quimioluminescência aumentada. A pureza das fracções subcelulares obtidos foi determinada utilizando Western blot da proteína mitocondrial, succinato desidrogenase. β-actina foi usado como um controle de carga.
ST e nicotina induziu a fosforilação Bad aumenta a interação com 14-3-3ζ
Bad fosforilação (ser-136) promove a sua translocação de mitocôndrias no citoplasma e interação com a proteína 14-3-3 andaime. Para avaliar se o ST ou nicotina afectar associação de Bad, células SCC4 foram tratados com ST (20 ug /ml) ou nicotina (10? M) durante intervalos de tempo diferentes. Co-imunoprecipitação de 14-3-3ζ Bad e mostrou um aumento dependente do tempo em pBAD ligado nos imunocomplexos (IP) do 14-3-3ζ indicando associação entre 14-3-3ζ e pBAD (Figura 6A e 6B), no tratamento com ST e nicotina, respectivamente. Foram observados resultados semelhantes em ensaios de imunoprecipitação reversa, Western blotting foi realizado para 14-3-3ζ em imunocomplexos obtidos utilizando anticorpo específico pBAD, confirmando a interacção de 14-3-3ζ com pBAD (Figura 6A e 6B). Estes resultados sugerem ST e nicotina induziu a fosforilação de Bad resultou no sequestro de Bad no citoplasma, funcionalmente bloqueando a sua função pró-apoptótico.
SCC4 foram tratados com (A) ST (20 ug /ml) ou (B) com nicotina (10? M) durante intervalos de tempo diferentes e ensaios de imunoprecipitação foram efectuados utilizando lisados de células inteiras e analisados por transferência de western como descrito em Materiais e Métodos. 14-3-3ζ foi imunoprecipitado utilizando um anticorpo específico da proteína de pBAD e ligado co-precipitado com 14-3-3ζ foi determinada por análise de Western blot. ensaios de imunoprecipitação reversa foram realizadas em que pBAD foi imunoprecipitada, seguido por análise de transferência de Western de 14-3-3ζ usando um anticorpo específico contra esta proteína. (C) A Figura mostra o modelo hipotético para a inibição da ST /nicotina activação induzida de PI3K /Akt por GS. Nossos resultados mostraram tratamento com ST e /ou a nicotina ativa Akt (fosforilada no Ser-473 e Ser-309), resultando em fosforilação de seus alvos a jusante Raf, GSK3β e PS6, enquanto o tratamento GS inibe a ativação da Akt. Curiosamente, o pré-tratamento de células cancerígenas de cabeça e pescoço com GS inibe a activação da Akt e seus alvos a jusante (Raf, GSK3β e PS6) sobre a exposição a ST /nicotina. GS pré-tratamento também libera Bad da ação inibidora do 14-3-3ζ, ativando via intrínseca da apoptose. Assim, nossos resultados demonstraram GS como um potencial agente terapêutico para a carcinogênese de cabeça e pescoço induzida ST.
Discussão
O tabaco em várias formas é um dos principais fatores etiológicos para o desenvolvimento e a progressão do carcinoma epidermóide. expressão aberrante de genes envolvidos no crescimento celular, sobrevivência, angiogénese, invasão e metástase em ST associada a carcinogénese cabeça e pescoço foi avaliado pelo nosso grupo e outros [27] – [31]. Neste estudo, foi demonstrado activação de Akt em células CECP tratados com ST /nicotina, evidenciadas pela fosforilação sustentada de Akt na serina 473 e treonina 308, bem como os seus substratos a jusante (PS6, GSK3β, PRAF), num tempo-dependente maneira. Tanto ST e nicotina também induziu a fosforilação da quinase a montante PDK1 (Ser241), e a subunidade p85 de outra quinase a montante, de PI3K em células SCC4. Estas observações são suportadas por relatórios anteriores que mostram a activação da via PI3K /Akt nos neurónios corticais cultivados, bronquial humano normal e células epiteliais das vias aéreas pequenas em resposta ao tratamento com nicotina [11], [32] – [34]. Além disso, mostrámos tanto ST e nicotina activado Akt, Bad induzida (Ser136) e Bax fosforilação (Ser184) resultando na retenção citoplasmática destas proteínas. No entanto, o tratamento com LY294002, um inibidor de PI3K /Akt, potentemente inibida ST e nicotina induziu a fosforilação de Bad (Ser-136) e Bax (Ser-184), resultando em relocalization mitocondrial destas proteínas, reforçando ainda mais a nossa observação de que a ST e nicotina induzida a fosforilação de Bad (Ser-136) e Bax (Ser-184) por activação da via PI3K /Akt. fosforilação Curiosamente, ambos ST e nicotina induzida de Bad (Ser-136) em células SCC4 aumentou a sua associação com 14-3-3ζ como revelado por ensaios de co-IP. Isto resulta no sequestro de Bad no citoplasma, inibindo, assim, a via intrínseca da apoptose. Relatórios anteriores demonstraram fosforilação de ambos Ser112 ou Ser136 facilita a formação de um complexo entre Bad e 14-3-3s no citosol, impedindo a sua interacção com Bcl-2 /Bcl-XL na mitocôndria [35], [36].
recentemente, demonstramos superexpressão de PI sintase, PI3-K e ciclina D1 em células tratadas ST de lesões orais e câncer oral [37]. Além disso, analisando amostras clínicas de lesões leucoplásicas orais sem displasia, com displasia e carcinoma epidermóide de boca (epidermóide estudados), que forneceu a primeira evidência de aumento da expressão de PI Sintase em estágios iniciais de pré-câncer bucal e câncer e sua correlação com desdiferenciação do tumor e do tabaco consumo [37]. Aqui em nós estendemos estes resultados para demonstrar GS poderia inibir a indução de PI3K /Akt por ST e nicotina.
Assim, inibindo a indução da actividade Akt por componentes do tabaco ST pode ser uma abordagem valiosa para mitigar os efeitos da tabaco nos consumidores em risco para o desenvolvimento de CECP, e /ou em HNSCC pacientes que continuam a fumar ou usar produtos ST. A este respeito, observou-se que GS suprimiu a fosforilação de Akt (Ser473 e Thr308), PDK1 (Ser241) e a subunidade p85 de PI3K, que conduz a uma diminuição da fosforilação de GSK3β, PRAF, PS6, os alvos a jusante de Akt. Notavelmente, o nosso estudo revelou que a GS não só inibiu o PI3K constitutiva /Akt, mas a sua pré-tratamento revogada tanto ST e nicotina induziu a ativação de PI3K /Akt. ST e nicotina anulou os efeitos pró-apoptóticos de Bax /Bad por fosforilação e sequestro no citoplasma, no entanto GS pré-tratamento inibiu o efeito de ST e nicotina, visando Bax e Bad para a mitocôndria, induzindo a apoptose. No entanto, o efeito da GS não é específico e limitado a apenas as células cancerígenas de cabeça e pescoço. Nós e outros autores mostraram que os efeitos anti-cancro de GS em uma variedade de tipos de células de cancro nomeadamente, da cabeça e pescoço; leucemia, mieloma múltiplo, do pulmão, melanoma, do ovário, intestino derivada de adenocarcinoma, colo-rectal, do cólon, pele, próstata, esófago, e da mama [19], [21] – [24], [38] – [43]
.
em conclusão, nosso estudo demonstrou que tanto ST e nicotina promover a sobrevivência de células cancerosas de cabeça e pescoço humanos SCC4, por inactivação as funções pró-apoptóticos de Bax e Bad através da sua fosforilação e sequestrando essas proteínas no citoplasma. GS não só inibe constitutivamente activa de PI3K /Akt, mas também inibe a ST e nicotina induz a activação desta via e promove sinais de apoptose nestas células (Figura 6C). Assim, GS pode ser explorado como um agente quimiopreventivo para a carcinogênese de cabeça e pescoço induzida ST.
Materiais e Métodos
Anticorpos e reagentes
z-Guggulsterone (GS), 3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), iodeto de propídio (PI) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). anticorpo monoclonal contra Bax (sc-7480); anticorpo policlonal de coelho contra 14-3-3ζ (sc-1019), anticorpo p85 pPI3K (Tyr-508, SC-12929R) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. anticorpo monoclonal de coelho contra fosfo-Akt (Ser 473, cat-9271), fosfo-Akt (Thr 308, cat-9275), Akt (cat-9272), fosfo-GSK-3β (Ser 9, gato-9336), fosfo -Raf (Ser 259, cat-9421), fosfo-PDK1 (Ser 241, cat-3061), inibidor de PI3-quinase LY294002 (cat-9901) foram todos comprados a partir de Cell Signaling Technology. Para os estudos de co-localização, de cabra anti-coelho Alexa Fluor® 594 (N ° Cat A-11012) foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). De cabra anti-ratinho FITC (N ° Cat. F2012) foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO). grânulos de proteína A-Sepharose foram obtidas de GE Healthcare (Biosciences, Uppsala, Suécia).
cultura celular
linhas celulares de cabeça e pescoço humano de carcinoma escamoso, SCC4 foi obtida da American Type Culture Collection ( ATCC) e HSC2 (JCRB0622) foi obtido a partir de Ciências da Saúde Research Resources Bank (HSRRB), Japão [44], [45]. Ambas as linhas celulares de cancro de cabeça e pescoço são conhecidos por abrigar p53 mutante. SCC4 células têm um ponto de mutação no codão 51 CCC para células de CTP e HSC2 tem uma mutação no intrão 6 [44], [45]. células HSC-2 Harbor mutado PIK3CA (H1047R) [46]. Ambas as linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço (SCC4 e HSC2) foram cultivadas em culturas em monocamada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Sigma), 1 mM L-glutamina, 1X piruvato de sódio, 1X vitaminas, meio essencial 1 mM mínimo (MEM), 100 ug /ml de estreptomicina e 100 U /ml de penicilina, numa incubadora humidificada (5% de dióxido de carbono, 95% de ar) a 37 ° C como descrito anteriormente [47].
Preparação de tabaco sem fumaça Extract (ST)
marca comumente utilizada de tabaco curado (Khaini) foi comprado do mercado local. 25 g de tabaco foi finamente pulverizado e homogeneizada em 225 ml de água destilada. A mistura foi agitada num agitador magnético durante duas horas e, em seguida, deixada repousar durante 24 horas a 37 ° C. Em seguida, o sobrenadante foi recolhido após centrifugação a 5000 g durante 20 minutos. O extracto foi esterilizado por passagem através de um filtro de 0,22 um e armazenado a 4 ° C até utilização. A concentração final de tabaco no extrato aquoso foi estimada em 2,7 g% [48].
Ensaio de citotoxicidade
células cabeça e pescoço (5 × 10
3 /poço) foram plaqueadas numa placa de 96 poços durante 24 h. As células foram incubadas em triplicado na presença de meio contendo ST /nicotina ou 0,02% de DMSO, que serviu como um controlo de veículo em um volume final de 100 ul por 24-96 horas a 37 ° C. A morte celular foi medida pela adição de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) a 37 ° C durante 3-4 h. Os cristais de formazan foram dissolvidos em 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) e densidade óptica (OD) foi medida no comprimento de onda de 570 nm. A morte celular percentual foi calculado individualmente para cada dose da seguinte forma:. (OD
Controle-OD
tratada /OD
controlo) × 100, como descrito anteriormente [49]
Western blot e Co-imunoprecipitação (IP-Co) ensaio
Co-imunoprecipitação (IP) Co-ensaios e WB foram efectuadas tal como descrito por nós anteriormente [39]. Os lisados celulares totais foram preparados a partir de GS (50? M) ou nicotina (10? M) as células SCC4 tratados e a concentração de proteína foi determinada utilizando o reagente de Bradford (Sigma) e quantidades iguais de proteínas (50 ^ g /pista) foi resolvido em 12% de sódio dodecil sulfato (SDS) de gel de poliacrilamida. As proteínas foram então electro-transferidas para polyvinylidenedifluoride (PVDF) da membrana. Após o bloqueio com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), as manchas foram incubadas com anticorpos específicos, conforme o protocolo recomendado pelo fabricante, a 4 ° C durante a noite. abundância de proteína α-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, CA) serviu como um controlo para a carga de proteína em cada pista. As membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (Dako Cytomation,, Glostrup, Dinamarca), diluída a uma diluição adequada em BSA a 1%, durante 2 h à temperatura ambiente. Depois de cada passo, as manchas foram lavadas três vezes com Tween (0,1%) – solução salina de tampão Tris (TTBS). As bandas de proteína foram detectadas pelo método de quimioluminescência aumentada (ECL, Santa Cruz Biotechnology, CA) em filme de XO-MAT. ensaios de co-IP foram realizadas como descrito anteriormente
Sub-celular fracionamento:. Isolamento de citoplasma e mitocôndrias
células câncer de cabeça e pescoço (2 × 10
7) foram tratados, colhidas e lavadas uma vez com PBS frio 1X e ressuspensas em tampão isotónico mitocondrial (manitol 210 mM, sacarose 70 mM, EGTA 1 mM, Hepes 10 mM, pH 7,5, BSA a 0,1%) contendo mistura de inibidores de protease. As células ressuspensas foram homogeneizadas com um homogeneizador Polytron a funcionar durante quatro rajadas de 10 s cada um a uma configuração de 5 e, em seguida, centrifugada a 2000 g durante 3 min para sedimentar os núcleos e as células intactas. O sobrenadante foi centrifugado a 13000 g durante 10 min para sedimentar as mitocôndrias, como descrito [50]. O sobrenadante foi ainda centrifugado a 15000 g para sedimentar as membranas de luz. O sobrenadante resultante continha as fracções citosólicas. As mitocôndrias foram lavadas duas vezes com tampão de mitocondrial, ressuspenso com 1% de Nonidet P-40 tampão de lise, agitados durante 60 min, e em seguida centrifugou-se a 13000 g durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante contendo as proteínas mitocondriais foi recolhido. Proteína (100 ug) de cada fracção foi submetido a 12% de SDS-PAGE e analisados por análise de Western blot utilizando anticorpo anti-citocromo c. A pureza das fracções foi confirmada por avaliação localização de proteínas específicas da fracção incluindo succinato desidrogenase das mitocôndrias.
estudos de co-localização de Akt e Bax em células cancerosas por via oral, utilizando microscopia confocal de varrimento a laser
células cabeça e pescoço, e SCC4 HSC2, foram cultivadas em lamelas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% a 37 ° C e processado para microscopia de varrimento a laser confocal, como descrito por nós anteriormente [51]. As células foram lavadas em PBS de Dulbecco (DPBS), fixadas em metanol durante 5 minutos à temperatura de -20 ° C e incubados com anticorpos primários específicos, monoclonal de ratinho anti-Bax e anticorpo monoclonal de coelho anti-Akt, incubada como um cocktail, a 4 ° C durante a noite . Depois de enxaguar em tampão fosfato saline- 0,1% de Tween (PBST, 1X) as lamelas foram incubadas com anti-ratinho conjugado com FITC /anti-coelho Alexa flour®594 anticorpo secundário conjugado durante 45 minutos a 37 ° C no escuro. As lamelas foram lavadas e contra-coradas com DAPI durante 30 seg. Um anticorpo de ratinho contra o Bax humano, um anticorpo de coelho contra Akt humana, e fluoresceína anti-ratinho conjugado com isotiocianato de (verde) ou anticorpos secundários foram utilizados de modo que as células poderiam ser coradas simultaneamente sem reacção cruzada rodamina conjugada com anti-coelho (vermelho) . Em controlos negativos, os anticorpos primários foram substituídos por IgG de rato não imune do mesmo isotipo para assegurar a especificidade (resultados não apresentados). Em seguida, as lâminas foram lavadas e montadas em meio de montagem de fluorescência e examinadas por microscopia confocal de varrimento laser Lieca TCS SP2 (CLSM).