Abstract

Malformin C, um pentapéptido cíclico fúngica, tem sido afirmado ter potencial anti-câncer, mas nenhuma

in vivo

estudo estava disponível para substanciar esta propriedade. Portanto, realizamos

in vitro Comprar e

In vivo

experimentos para investigar seus efeitos e toxicidade anti-câncer. Nossos estudos mostraram Malformin C inibiu Colon 38 e HCT 116 crescimento celular dependente da dose, com um IC

50 de 0,27 ± 0.07μM e 0,18 ± 0.023μM respectivamente. Esta inibição foi explicada pelo efeito da Malformin C em G2 /M detenção. Além disso, observou-se expressão de fosfo-histona H2A.X, p53 sobre-regulada, caspase 3 clivada e LC3 após o tratamento Malformin C, enquanto que o ensaio de apoptose indicou um aumento da população de células apoptóticas e necróticas final.

In vivo

, o estudo anatomopatológico exibiu a toxicidade aguda de Malformin C a dose letal em ratinhos BDF1, pode ser causada por uma resposta inflamatória aguda e subtil, consistente com níveis elevados de IL-6 no ensaio de citocinas no plasma. Outros anti-tumor e toxicidade experiências provaram que 0,3 mg /kg injectado semanal foi a melhor dosagem terapêutica de Malformin C no cólon 38 ratinhos BDF1 xenoenxertado, ao passo que 0,1 mg /kg a cada dois dias não mostrou nenhum efeito com maior resistência, e 0,9 mg /kg por semana, quer, levou a toxicidade fatal em ratos velhos de sete semanas ou apresentada nenhuma vantagem sobre 0,3mg grupo /kg em ratos velhos de nove semanas. No geral, podemos concluir que Malformin C prende Colon 38 células em fase G2 /M e induz a várias formas de morte celular por necrose, apoptose e autofagia. Malformin C tem actividade potente de inibição do crescimento celular, mas o índice terapêutico é demasiado baixo para ser um medicamento anti-cancro

citação:. Wang J, Jiang Z, W Lam, Gullen EA, Yu Z, Wei Y, et ai. (2015) Estudo da Malformin C, um fúngica Fonte cíclica Pentapeptide, como uma droga anti-câncer. PLoS ONE 10 (11): e0140069. doi: 10.1371 /journal.pone.0140069

editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos

Recebido: 02 de maio de 2015; Aceito: 20 de setembro de 2015; Publicação: 05 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Yung-Chi Cheng é membro da Fundação Nacional do Cancer Research, EUA. Parte do seu salário é proveniente da subvenção NCI da CA-154295. A maior parte da sustentação da pesquisa é financiada por um fundo fiduciário para o laboratório de Yung-Chi Cheng na Universidade de Yale. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Malformins são um grupo de pentapéptidos cíclicos originalmente descoberto e isolado a partir do filtrado da cultura do fungo

Aspergillus niger

, e induz a malformações do feijoeiro e curvaturas de raízes de milho [1, 2] . Malformin também poderia ser obtido a partir do extrato de

Aspergillus tubingensis

[3]. Actualmente, três sub-grupos de Malformins são identificados, isto é, Malformin A, B Malformin [4], e Malformin C. À medida que o primeiro sub-grupo descoberto, Malformin A consiste principalmente de Malformin

1,

2, a

3 e a

4 [5, 6], em que Malformin a

1 é o mais bem estudado, e suas atividades biológicas têm sido relatadas, incluindo malformações de plantas, efeitos de antibióticos contra bactérias espécies [7], o aumento da atividade fibrinolítica [8, 9], e prevenção contra a reação pró-coagulante induzida por IL1 [10]. Malformin C é um membro relativamente novo e tóxica de Malformins [11] (Figura 1A). Ele mostrou actividade anti-bacteriana [12], bem como potentes propriedades anti-malária e antitrypanosomal [13]. Além disso, Malformin C inibe checkpoint G2 induzida por bleomicina em células Jurkat [14], e foi reivindicado ter potencial no tratamento do câncer. No entanto, nenhum

in vivo

estudo foi apresentado para fundamentar a sua propriedade anti-tumor. Portanto, realizamos uma série de preliminar

in vitro

in vivo

estudos para explorar os efeitos anti-câncer do Malformin C e seus

in vivo

toxicidade Comprar e.

(a) estrutura química de Malformin C. Malformin C é um membro de Malformins, um grupo de pentapéptidos cíclicos fúngicas. A sua fórmula química é C

23H

39o

5N

5S

2 com um peso molecular de 529,7. (B) a progressão do ciclo celular de cólon 38 células expostas a uma concentração crescente de Malformin C durante 24 horas. a progressão do ciclo (C) celular de cólon 38 células expostas a uma concentração crescente de Malformin C durante 48 horas. (D) A acumulação dependente da dose de G2-M cólon fase de 38 células tratadas por Malformin C em concentrações de 90 nM, 270 nM e 810 nM. Comparado com o grupo controle, o símbolo Δ representada

P Art 0,05, enquanto que * representada

P Art 0,01. (E) análise do ciclo celular de cólon 38 células tratadas com combinações de Malformin C e SN38. Todas as células foram expostas aos respectivos compostos indicados acima do gráfico durante 24 horas e a análise foi realizada em duplicado. Quando tratados com SN38, não foram observadas alterações significativas de progressão do ciclo celular sem ou com diferente dosagem de Malformin C.

Embora a incidência ea mortalidade do cólon e do reto cânceres têm diminuído nos últimos vinte anos, câncer colorretal (CRC) continua a ser o quarto cancro mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos [15]. A quimioterapia é utilizada para CRC em diferentes fases. O irinotecano (CPT-11, Camptosar) é uma droga quimioterapêutica que impede o DNA de desenrolamento por inibição da acção da topoisomerase I, e é utilizado para o tratamento de avançado ou metastásico CRC. Neste estudo, utilizou-se células de murino Colon 38, células HCT-116 e tumor de enxerto como o modelo para estudar o potencial de propriedades anti-cancro do Malformin C e escolheu CPT-11 como controlo para explorar o seu possível combinação e mecanismo subjacente.

materiais e Métodos

fúngica material

a cultura da

Aspergillus tubingensis

foi isolado a partir do solo de areia da praia de Patong de Phuket, ilha tailandesa (7,89 ° N , 98,29 ° E). O solo arenoso foi coletado de uma praia pública, e nenhuma permissão específica foi exigida para aquele local ou tal atividade. Confirmamos que os nossos estudos de campo não envolvem espécies ameaçadas ou protegidas. O isolado foi identificado por um dos autores (Prof. Yixuan Zhang) com base na análise da sequência da região do rDNA e a sua morfologia ITS. A estirpe foi atribuído a coleção cultura Adesão No. 6992 na China Geral microbiológica Cultura Coleção Center, Pequim. A estirpe fúngica foi cultivado em cunhas de agar de dextrose de batata (PDA), a 28 ° C durante 4 dias. Em seguida, os esporos slants foram inoculadas em 250 ml de frascos de Erlenmeyer, contendo cada um 40 ml de meio (1% de glucose, 1% de sacarose, 1% de peptona, 0,5% de farinha de amendoim, 0,3% de KH

2 PO?

4, 0,1% de NH

4Cl, 0,3% MgSO

4 · 7H

2O) e o pH final do meio foi ajustado para 6,5 ​​antes da esterilização. culturas em frascos foram incubados a 28 ° C num agitador rotativo a 160 rpm durante 48 horas para se obter o líquido de semente para a fermentação. A fermentação foi levada a cabo em Fernbach frascos de cultura (500 ml) cada uma contendo 80 ml de meios de comunicação (1% de glucose, 0,2% de ácido aspártico, 0,1% KH

2 PO?

4, 0,05% MgSO

4 · 7H

2O e oligoelementos) e o pH final de 6,0 antes da esterilização. Os oligoelementos por meios de fermentação 1L continha 0,1 mg MnSO

4, 0,1 mg ZnSO

4, 0,2 mg FeCl

3, 1 mg de vitamina B

1, 5 ug biotina. 8% (proporção em volume) de líquido de sementes foram plantadas em cada frasco de fermentação, em seguida, cultivadas a 28 ° C num agitador rotativo a 160 rpm durante 96 horas.

Extracção, isolamento e identificação de Malformin C

20L material de fermentação foi filtrada sob vácuo para remover o micélio, em seguida, extraída com álcool n-butílico, e o solvente orgânico foi evaporado até à secura sob vácuo para se obter um extracto em bruto. 5 g de extracto em bruto foi dissolvido em CH

3OH seguido por cromatografia em coluna de gel de sílica (CC) (10 x 100cm) utilizando CHCl

3-CH

3OH eluição gradiente (15: 1 → 10: 1 → 5: 1). A fracção (0,8 g), eluída com 15: 1 de CHCl

3-CH

3OH foi separada por cromatografia em coluna, e posterior purificação por RP-HPLC (Shimadzu LC-10A; Diamonsil C18 200 x 4,6 milímetros 5um; 1 mL /min, 80% de CH

3OH em H

2O para a eluição, comprimento de onda de detecção de UV a 215 nm, malformin C t

R 13.065min) para 99% de pureza. O composto puro foi identificado na base de extensa investigação espectroscópica incluindo HR-ESI-MS, RMN 1D e 2D-RMN. HR-ESI-MS Os espectros foram obtidos num espectrómetro de massa Bruker micro-Q-TOF. Os espectros de 1D e 2D-RMN foram medidos num espectrómetro Bruker ARX-300 espectrómetro (300 MHz para

1H, 75 MHz para

13C). O composto puro foi identificado como malformin C através de comparação dos dados com aqueles previamente relatados [16].

Drogas e linhas celulares

CPT, doxorrubicina, vincristina, Taxol, VP-16, oxaliplatina e DAPI foram adquiridos da Sigma. L-OddC foi fornecido pela Shire Pharmaceuticals, Inc. Murino linha de células de cólon 38 foi estabelecida antes [17] e obtido a partir de Dr. Giuseppe Pizzorno of Translational Science in Cancer Institute Nevada, EUA. adenocarcinoma de pulmão humano linha celular NCI-H1975 foi adquirido da National Cancer Institute e dada pelo Dr. Don Nguyen do departamento de patologia da Universidade de Yale. Humana CEM linfóide, carcinoma nasofaríngeo humano KB e HCT linhas celulares de cancro do cólon 116 foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC). linhas pancreáticas murinas celulares PanO2 câncer e KB-resistentes foram previamente estabelecido no laboratório e descrito anteriormente [18-22]. Cólon 38, as células NCI-H1975, CEM e KB foram cultivadas em meio RPMI 1640, as células PanO2 foram cultivadas em meio DMEM, e HCT 116 células em meio 5a de McCoy. As linhas celulares resistentes a KB foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 37nmol /L Doxorubicina para KB-MDR, 300nM CPT para KB300-CPT, 20 nM de vincristina para KBv20c, 20 � VP16 para KB20a-VP16 e 7 um VP16 para KB7d, e todas essas drogas foram retiradas dos meios de comunicação, uma vez as células foram semeadas para os experimentos. Todas as células foram cultivadas em meio suplementado com 10% de FBS, e mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

Crescimento celular Ensaio

As células foram semeadas a 1 × 10

4 /ml em placas de 48 poços. Após incubação durante a noite, Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM, KB, KB-MDR, KB300-CPT, KBv20c, as células KB20aVP16 e KB7d foram tratados com drogas durante 72 horas, 72 horas, 72 horas, 120 horas, 72 horas, 120 horas, 72 horas, 108 horas, 72 horas, 108 horas e 108 horas, respectivamente. As células foram fixadas e coradas com 0,5% azul em 50% de etanol durante 2 horas à temperatura ambiente (RT) de metileno, seguido por lavagem com água da torneira para remover o azul de metileno não absorvido. As placas foram secas ao ar durante a noite, solubilizado em 1% de Sarcosil e rodado durante 3 horas à temperatura ambiente ambiente. O crescimento celular foi quantificada com base na quantidade de azul de metileno adsorvido para interagir com proteínas celulares medidos com um espectrof otómetro (Molecular Devices) a 595 nm. Os valores foram a média e o valor do dia zero foi subtraída de cada valor médio incluindo o controlo não tratado. Os valores tratados com fármaco foram expressos como uma percentagem do controlo não tratado, e percentagens foram representados graficamente em função da concentração de droga para gerar um

valor de IC 50. Todas as experiências foram realizadas em poços em duplicado e foram repetidas pelo menos três vezes.

Ensaio clonogénico

cólon 38 e células HCT 116 foram plaqueadas a 2,4 x 10

5 /poço em seis bem placas, respectivamente, e tratados com oxaliplatina Malformin C ou durante 24 horas. As células do dia seguinte foram colhidas e semeadas em novas placas de seis poços a 300 /cavidade com meio de cultura fresco. As colónias foram coradas com azul de metileno após 11 dias e, em seguida contados. Os resultados incluídos os meios e S.D. obtido a partir de três experiências independentes.

Análise do Ciclo Celular

38 do cólon e células HCT 116 foram semeadas separadamente em placas de seis poços a 3 x 10

5 células por poço, e incubou-se durante 48 horas. Várias concentrações de Malformin C ou oxaliplatina foram adicionados ao meio de cultura e incubou-se durante mais 24 horas. As células foram então colhidas usando pancreatina e 10 ug /mL DNase1, 37 ° C, 5 minutos e lavadas duas vezes com PBS frio. Um total de 1×10

6 células para cada amostra foram aliquotadas, ressuspensas em 500 ul de PBS e fixadas por adição de 500 ul PFA a 4%. Após 30 minutos de incubação em gelo, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS frio. Antes da análise as células foram ressuspensas em 150 ul 1 ug /ml de DAPI em PBS durante 30 minutos, depois filtrou-se para remover agregados. A análise foi levada a cabo numa BD Biosciences LSRII e analisados ​​utilizando o software FlowJo (ár).

Ensaio de Apoptose

precoce eventos apoptóticos foram determinadas utilizando um kit de Ensaio de Apoptose Vybrant # 2 (Molecular Probes , V13241) de acordo com as instruções do fabricante, e o método descrito anteriormente [23]. células de cólon 38 foram tratadas com diferentes concentrações de Malformin C e CPT durante 24 horas. As células tratadas com 3,7% de formaldeído durante 15 minutos, foram utilizadas como células de controlo positivo. A análise foi realizada em um BD Biosciences LSRII e analisados ​​utilizando software FlowJo (Árvore Star).

microscopia confocal

células

Colon 38 foram tratadas com diferentes concentrações de Malformin C por três campos de tempo diferentes, incluindo tratamento de 24 horas, o tratamento de 48 horas, e tratamento de 24 horas seguido de retirada Malformin C e outro de incubação de 24 horas. Todas as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS e depois permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS. 3% de albumina de soro bovino em PBS foi usado para bloquear a ligação não específica. As células foram então expostas a anticorpo monoclonal anti-p53, monoclonal anti-caspase 3 clivada, ou anti-LC3 monoclonal (1: 200; Cell Signaling Technology), à TA durante 1 hora, lavou-se com 0,2% de Tween 20 em PBS e seguido por isothiocyanate- fluoresceína IgG anti-coelho conjugado a 1: 400 de diluição. actina citoplasmática foi contra-coradas com 0.25μg /phalloidin rodamina ml (Invitrogen). As células foram então seladas em reagente antifade (Invitrogen). Micrografia confocal foram digitalizados por um microscópio confocal de varredura a laser (LSM 510; Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

Western Blot

Colon 38 células e HCT 116 (5 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas como indicado nas legendas das figuras. As células foram lisadas em 2 x tampão de amostra SDS (26.7mM pH 6,8 de Tris-HCl, 1% de SDS, 25% glicerol, 0.36M β-mercaptoetanol e 0,05% de azul de bromofenol) e submetida a ultrassons durante 10 segundos para cortar o ADN. Os extractos de células completas foram então a electroforese através de 15% ou 8% de gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad). Elas foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com solução de bloqueio (TBS, 0,1% Tween 20, e 3% de leite desnatado), seguido por um anticorpo específico para fosfo-Histona H2A.X (Ser139) (1: 2000, de coelho monoclonal mAb ; Cell Signaling Technology, # 9718), H2A.X total (1: 2000, de coelho monoclonal mAb; Cell Signaling Technology, # 7631), caspase 3 (D2R6Y) (1: 1000, de coelho monoclonal mAb; Cell Signaling Technology, # 14220 ), e LC3A (D50G8) (1: 1000, de coelho monoclonal mAb; Cell Signaling Technology, # 4599) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram, então, incubadas com IgG de rábano silvestre conjugado com peroxidase anti-coelho (1: 2000; Sigma) à temperatura ambiente durante 2 horas, e os sinais foram visualizados por quimioluminescência aumentada (Perkin-Elmer Life Science). A fosfo-histona H2A.X e borrões totais H2A.X foram sondado com anticorpos para p-actina. (1: 2000; Sigma, A5316)

Os estudos em animais

Um total de trinta e quatro ± 0,5 ratos semanas de idade do sexo feminino BDF1 (Charles River Laboratories) foram utilizados para o primeiro experimento, ratos vinte e cinco 6 ± 0,5 semanas de idade para o segundo experimento, e seis ratos 6 ± 0,5 semanas de idade para o estudo patológico. Todos os ratos foram alojados durante duas semanas antes do experimento para ajustar ao ambiente no Centro de Yale Animal, patógenos específicos (SPF), 23 ± 2 ° C, 12:12 luz e ciclo escuro, 5 por gaiola. 2 × 10

6 cólon murino 38 células foram transplantadas subcutaneamente em cada ratinho para a experiência. Nós monitorados diariamente o peso do animal, perda de mobilidade, diminuição da temperatura corporal e movimento ou postura anormal, falta de atividade aliciamento, desidratação, como julgado por um tempo tenda 2-3 segundos e /ou se o mouse perdeu corporal superior a 15% peso, seria removido a partir do estudo. Qualquer animal que parecia muito doente que estava frio ao toque, curvado, não podia se mover, comer ou beber normalmente a partir do tratamento foi sacrificado com 30% de isoflurano (mistura de 30% v /v isoflurano e 70% de propilenoglicol) inalação e do colo do útero luxação. Após 10 a 14 dias, os ratos com tamanhos dos tumores de 150-300 mm

3 foram selecionados em uma piscina, em seguida, distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos, com 5 ratos em cada grupo. Malformin C foi dissolvido em 10 mM de DMSO e a concentração final de DMSO era inferior a 0,05% da solução Malformin C utilizado para o tratamento. Diferentes concentrações de malformin C esterilizado (0,1 mg /kg, 0,3mg /kg, 0,9mg /kg, 1,8mg /kg, 2,6 mg /kg) e esterilizado PBS foram administrados intraperitonealmente (ip) na manhã do Dia 1. depois de todo o tratamento, as amostras de sangue foram recolhidas de acordo com anestesia com 30% de inalação de isoflurano, e, em seguida, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical. amostras de tecido de tumor foram recolhidos depois os ratinhos foram mortos confirmados e congelada em -70 ° C para estudo posterior. Para o estudo patológico de toxicidade aguda do Malformin C, nós distribuídos aleatoriamente seis ratinhos em grupo PBS e /kg grupo 1,8 mg Malformin C. As drogas foram injectadas por via i.p. e todos os pacientes foram monitorados a cada 15 minutos para 6 horas até que os ratos do grupo C Malformin estavam perto da morte. Em seguida, os ratinhos foram eutanizados, as amostras de sangue foram tomadas para a química, a parte do baço e do peritoneu foram cultivadas para bacteriologia, e o resto de tecidos examinados foram fixados em formalina, embebidos em parafina, seccionados e para estudos histopatológicos. Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com um protocolo Comité Cuidado e Uso aprovado Yale University Institutional Animal (IACUC) (2013-07784). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Todas as seções do presente relatório aderir aos CHEGAM directrizes para a comunicação de pesquisa animal.

Plasma ensaio de citocina

O ensaio de citocinas plasma foi realizada seguindo o manual de instruções do BD Citometria Bead Array (CBA) mouse manual de instruções de Th1 /Th2 Kit de citocinas. O rato padrões de citocinas Th1 /Th2 foram reconstituídas em diluente de ensaio e diluídas em série até à concentração de 0-5000pg /ml. Uma quantidade de 10 ul de cada suspensão de esferas de captura de citocina rato teste foi misturado, e 50 ul de diluições padrão ou contas de teste misturado foram transferidas para tubos de ensaio. Após a adição de 50 uL de reagente de detecção de PE, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, as amostras foram lavadas, e 300 ul de tampão de lavagem foi adicionado a cada tubo. Todas as amostras foram analisadas usando BD FACS sistema Array.

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​por um ou dois análise de variância (ANOVA) (GraphPad Prism 5), teste t de Student (Microsoft Office Excel), e análise de correlação (GraphPad Prism 5). A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando

P

. 0,05

Resultados

A inibição do crescimento e clonogenicidade de Malformin C contra diferentes linhas celulares de cancro

foram examinados os efeitos de Malformin C sobre a inibição do crescimento de diferentes linhas celulares de cancro. Todas as células foram expostas a concentrações crescentes de Malformin C e L-OddC. O

valor de IC 50 foi definido como a concentração de droga que inibiu o crescimento celular em 50%. L-OddC, também conhecido como troxacitabina, é um análogo da L-nucleósido com actividade contra o cancro [24-27] e foi utilizado como um controlo positivo no estudo. Malformin C inibiu Colon 38, HCT 116, células PanO2, NCI-H1975, CEM e KB de uma forma dependente da dose com um IC

50 de 0,27 ± 0,07 mM, 0,18 ± 0,02 mM, 0,29 ± 0,05 mM, 0,16 ± 0,04 jiM, 0,030 ± 0,008 uM e 0,18 ± 0,05 pM, respectivamente (Tabela S1). Malformin C teve diferentes efeitos de inibição entre diferentes linhas celulares de cancro (

P

0,01, ANOVA de uma via), e o Malformin C foi mais potente do que a L-OddC para inibição de crescimento de Colon 38, HCT 116 e PanO2 (

P Art 0,01, teste t). Por isso, selecionamos Colon 38 e HCT 116 para o seguinte estudo. As acções de Malformin C sobre a capacidade de formação de colónias do cólon HCT116 e 38 foram, em seguida, determinada como a percentagem do número de colónias visíveis do grupo tratado com a droga em relação ao grupo de controlo sem tratamento por ensaio clonogénico. Colon 38 e HCT 116 células exibiram uma perda dependente da dose da capacidade de formação de colónias após exposição a Malformin C com um LC

50 valor de 0,6 ± 0,07 ^ M e de 0,7 ± 0,09 uM, respectivamente, o qual foi definido como a concentração de droga que inibiram a formação de colónias em 50%. A proporção de LC

50 a IC

50 foi de aproximadamente 2: 1 no cólon 38 células e 4: 1 em células HCT 116, e este resultado indica que os efeitos do Malformin C sobre a inibição do crescimento de Colon 38 e HCT 116 foram parcialmente irreversível.

Efeitos de Malformin C em linhas de células resistentes à droga anticâncer

Os perfis de resistência cruzada de Malformin C, em comparação com outras drogas anti-câncer convencionais, foram estudadas empregando KB a linha de células e um número de linhas de células bem caracterizadas KB resistentes a drogas (Tabela 1). Malformin C demonstrou uma resistência a 233 vezes para as células KB-MDR que sobre-expressos P-gp humano 170 proteína, quando comparadas com as células KB (

P

0,0001). Também foi 4,4 vezes mais resistente ao KBv20c células (

P

0,001) e 2,8 vezes mais sensível para as células CPT-KB300 (

P

0,05) em comparação com as células KB ( Mesa 2). De modo a confirmar ainda mais a resistência do Malformin C até as células KB-MDR, verapamil (VRP), um antagonista de canal de cálcio de proteína P-gp 170, foi usado para inverter a resistência a múltiplas drogas [28]. Uma concentração não tóxica de VRP (5 uM) foi administrado em células resistentes kb em adição ao Malformin C, Taxol e Doxarubicin durante 72 horas. Com a VRP, o IC

50 de Malformin C durante KB-MDR significativamente tinha diminuído, a partir de 233-vezes a quatro vezes da das células de KB (Tabela 3). Estes dados mostram que as células KB-MDR foram altamente resistentes a Malformin C eo efeito fármaco-resistente foi revertida pela VRP.

Malformin C causada G2 /M detenção em Colon 38 linha de células

Os impactos da Malformin C na distribuição de fases do ciclo celular de células do cólon 38 e HCT 116 foram examinados e uma concentração de 90nm, 270nm, 810nm de Malformin C foi administrada, respectivamente, para 24 horas e 48 horas. Tal como ilustrado na figura 1, a percentagem de fase G2-M gradualmente ainda aumentou significativamente no cólon 38 células tratadas com 270nm e 810nm Malformin C em ambos 24 horas (Figura 1B e 1D) e 48 horas (Fig 1C e 1D) Experiências . Por outro lado, a percentagem de diminuição da fase G1 em células expostas a 810nm Malformin C. Estes resultados implicaram que Malformin C induziu uma paragem em G2-M dependente da dose em células de cólon 38. No entanto, não houve alterações dependentes do tempo de progressão do ciclo celular foram observadas em Colon 38 células (Fig 1D, S1 Fig), e não do ciclo celular mudanças no padrão foram encontrados em células HCT 116 (S2 FIG). Além disso, foram examinados os efeitos de Malformin C sobre a progressão do ciclo celular de células de cólon 38 expostas a SN38 durante 24 horas. Todas as células foram tratadas com uma dose crescente de Malformin C (0 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM) em adição a qualquer fármaco ou 9nM SN38, respectivamente. O irinotecano (CPT-11) é um análogo de camptotecina, um inibidor da topoisomerase I. No interior do corpo, que é convertido para o metabólito activo SN38 (7-etil-10-hidroxi-camptotecina) por carboxyesterases hepáticas e intestinais, e SN38 tem uma potência muito mais elevada

In vitro

causando danos no ADN grave que leva para G2-M prisão em células cancerosas. Neste estudo, novamente confirmado que, quando tratadas com 300 nM Malformin C sozinha, a percentagem do cólon fase G2-M 38 células aumentou significativamente em comparação com o controlo (Figura 1E). Além disso, SN38 induziu a paragem G2-M no cólon 38 células e serviu como um controlo positivo. Não houve diferença significativa do padrão de progressão entre cólon 38 células tratadas com SN38 sozinha e os tratados com Malformin C além de SN38 (Figura 1E).

acção irreversível de Malformin C em causar a morte de células de cancro

a indução da proteína p53 supressora de tumor é um evento chave para as células em resposta a danos no ADN [29]. A maioria dos agentes quimioterapêuticos para o tratamento do cancro por meio de trabalho danos no DNA, resultando em morte celular por apoptose, necrose ou autophapy [30]. Para a apoptose, as vias intrínsecas e extrínsecas tanto levar a

caspase 3

activação que, eventualmente, induz a apoptose, e, por conseguinte, caspase 3 pode ser usada para avaliar o processo de apoptose [31]. Para autofagia, detecção de microtubular-associada cadeia leve da proteína 3 (LC3) é amplamente utilizado para monitorizar a autofagia e processos relacionados com o autophagy, incluindo a morte celular autophagic [32]. Neste estudo, p53, caspase 3 clivada e LC3 foram analisados ​​aplicando microscópio confocal. Todas as 38 células do cólon para confocal foram tratados com Malformin C nas concentrações de 0 uM, 0,27 uM e 0,54 uM, durante 24 horas, 24 horas, seguido de remoção Malformin C e uma outra cultura de 24 horas por meios de mudança, e 48 horas, respectivamente ( Fig 2A). A expressão e localização de p53 foi demonstrada em micrografias de imunofluorescência, que a expressão de p53 foi induzida no núcleo depois de exposta a 0,54 uM Malformin C durante 24 horas, independentemente se as células foram cultivadas durante mais 24 horas ou não (Fig 2B-2D). Quando tratados durante 48 horas, embora não p53 foi demonstrada em células, o número de células foi significativamente reduzida, o que indica as células que expressam a p53 foram provavelmente mortos de danos no ADN (Figura 2E). Além disso, as expressões de caspase clivada 3 e LC3 foram maiores em Malformin C cólon tratada 38 células, em especial, na concentração de 0,54