Abstract

Fundo

A radioterapia é uma das principais estratégias terapêuticas no tratamento do câncer. O TPP1 proteína de ligação dos telómeros é um componente importante do complexo shelterin em telómeros de mamífero. Nossos relatórios anteriores mostraram que a expressão TPP1 foi elevada em células radioresistentes, mas os efeitos e mecanismos exactos de TPP1 sobre radiossensibilidade não é clara.

principais conclusões

Neste estudo, verificou-se que a expressão TPP1 elevada significativamente correlacionada com radiorresistência e mais longo o comprimento dos telômeros em linhas celulares de cancro colorrectal humanos. Além disso, TPP1 superexpressão mostrou alongou o comprimento dos telômeros e uma diminuição significativa da radiossensibilidade de raios-X. TPP1 radiorresistência mediada foi correlacionado com uma taxa de apoptose diminuiu após a exposição IR. Além disso, TPP1 superexpressão mostrou G2 prolongado /M detenção mediado por via de sinalização ATM /ATR-Chk1 após a exposição IR. Além disso, TPP1 superexpressão acelerou a cinética de reparação de danos no DNA total e disfunção dos telômeros induzida por radiação ionizante.

Conclusões

Nós demonstramos que as expressões elevados de TPP1 em células de câncer colorretal em humanos poderia proteger dos telômeros de DNA danos e conferir radiorresistência. Estes resultados sugeriram que TPP1 pode ser um alvo potencial na radioterapia do cancro colorectal

citação:. Yang G, Wang W, Hu G, X Yang, Zhong J, Li Z, et al. (2013) Telomere-Binding Protein TPP1 modula Telomere homeostase e que confere radiorresistência de células de câncer colorretal humano. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10.1371 /journal.pone.0081034

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2013; Aceito: 08 de outubro de 2013; Publicação: 19 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No.81071825), o Fundo de Doutorado do Ministério da Educação da China (No.20120141130010) e os Fundos investigação fundamental para as Universidades Central. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC), com mais de 1,2 milhões de novos casos e 608,700 mortes em 2008, é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer em muitos países [1]. A radioterapia é uma das principais estratégias terapêuticas no tratamento do cancro colo-rectal, com o controlo local eficaz, a protecção dos tecidos normais e menos efeitos sistémicos [2,3]. No entanto, muitos pacientes ainda experimentar recidiva ou metástase após o tratamento de radiação. A principal causa da falha de radioterapia é radiorresistência celular. Assim, a identificação de novos fatores que predizem radiorresistência é uma área de intensa pesquisa e pode ser de grande valor no tratamento de cancros.

Os telómeros são complexos DNA-proteína especializadas nas extremidades dos cromossomas eucarióticos compostos por um número variável de sequências repetidas em tandem TTAGGG e proteínas associadas [4]. Telômeros desempenham um papel crucial na garantia da estabilidade e integridade [5-8] genômica. Além disso, estudos têm esclarecido que a homeostase do telómero serve como um alvo potencial no tratamento do cancro, especialmente em radioterapia [9-12]. Nossa pesquisa anterior também indicou que houve uma correlação negativa significativa do comprimento dos telômeros e radiossensibilidade e comprimento dos telômeros pode ser usado como uma ferramenta promissora para prever a radiossensibilidade de carcinomas humanos [13].

Telómero homeostase é afectada por vários elementos, e um dos principais reguladores é shelterin. O complexo shelterin consiste de seis proteínas associadas a telómeros: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 e POT1 [8]. Interrupção no shelterin iria levar à disfunção dos telômeros e, potencialmente, cromossômica instabilidade [14]. TPP1 (também conhecido como TINT1 /PTOP /PIP1) é um membro de shelterin crítica e associa com outras proteínas de ligação a telómeros para formar o núcleo shelterin [8]. TPP1 heterodimerizes com POT1 e aumenta a sua afinidade com o telômero ssDNA [15,16]. O complexo POT1-TPP1 é capaz de recrutar e estimular a atividade da telomerase, regulando assim o comprimento dos telômeros através da interação TPP1-telomerase [17-19]. Estudos recentes demonstraram que TPP1 knockdown activa uma resposta a danos no ADN dependente de ATM marcado pela formação de focos induzidos por disfunção do telómero (TIFs) em telómeros [20]. Além disso, observou-se que a expressão TPP1 foi elevada em células radioresistentes e TPP1 pode envolver em radiorresistência câncer [21]. No entanto, os efeitos exatos e mecanismo de TPP1 sobre radiossensibilidade não é clara.

Para esclarecer melhor as funções de TPP1, investigamos o papel de TPP1 superexpressão de radiossensibilidade e homeostase dos telômeros em células de câncer colorretal em humanos neste estudo.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Tratamento

linhas celulares de cancro colorrectal Humanos (HCT116, SW480, LoVo, HT29 e DLD-1) foram adquiridos a partir do celular Bank of da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China. Todas as células utilizadas neste estudo foram cultivadas em 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%. células HCT116 foram transfectadas com pcDNA6-flag-hTPP1 (a simpática oferta do Dr. Joachim Lingner) [19] ou pcDNA6 vazio vector (Invitrogen) utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). células que sobre-expressam TPP1 foram seleccionados com 5 ug /ml de blasticidina (Sigma) durante 4 semanas. As linhas de células de transfecção estáveis ​​foram nomeados como HCT116-TPP1 e HCT116-Mock, respectivamente.

irradiação de raios-X foi realizada com um gerador de raios-X (Primus de alta energia da Siemens), emitindo a uma taxa de dose fixa de 2 Gy /min, a energia dos raios-X utilizados para irradiar células é 0 -10 Gy.

clonogênica Ensaio

As células foram semeadas em 6 bem-frascos de cultura de placas. Após 24 h, as células foram irradiadas com doses graduadas (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy), utilizando gerador de raios-X (Primus de alta Energy da Siemens), a uma taxa de dose de 2 Gy /min. As células foram então cultivadas numa incubadora contendo 5% de CO2 a 37 ° C durante 14 dias. Os passos e cálculos da fracção sobrevivente subsequentes foram realizados como previamente descrito [13] .Todos experiências foram feitas pelo menos três vezes.

Citometria de fluxo Análise de Ciclo Celular

Resumidamente, as células foram expostas a 6 Gy IR e, em seguida, incubadas durante os tempos indicados (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, e 42 h), em seguida, do ciclo celular análises foram realizadas como anteriormente descrito [21]. histogramas de ADN foram analisadas utilizando o software Modifit. As experiências foram realizadas em triplicado.

Análise de Citometria de Fluxo A apoptose de ensaio

A apoptose foi realizada utilizando um kit de detecção de apoptose FITC-annexinV (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi medida usando um citómetro de fluxo (Beckman Coulter, Brea, CA) e os dados foram analisados ​​com o software de busca celular. Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado.

Antibodies and Western Blot Análise

Western blot foi realizada tal como anteriormente relatado [21]. Seguindo os anticorpos são usados ​​neste estudo: TPP1 (Abcam), a ATR, fosfo-Ser345-Chk1 /Chk1 e ATM (Cell Signaling Technology). Um anticorpo β-actina (Santa Cruz) foi utilizado para normalizar as diferenças de carga entre as amostras.

A telomerase Ensaio de Actividade

A medição da actividade da telomerase foi realizada utilizando o kit de ELISA de TRAP de PCR (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. O método detalhado foi realizada como previamente descrito [22] .sample absorvância foi medida com um leitor de microplacas (Bio-Rad) no comprimento de onda de 450/690 nm.

Medição da Telómero Comprimento por Southern Blotting

determinação de fragmentos de restrição terminal foi realizada utilizando o kit Comprimento Ensaio TeloTAGGG Telomere (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. O comprimento médio do telómero (restrição terminal média fragmentos de comprimento, TRF) foi determinada utilizando o software de análise de imagem (Bio-Rad).

Imunofluorescência

Após tratamento indicado, as células foram fixadas com formaldeído a 4% durante 15 min e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois bloqueou-se com solução de bloqueio, as células foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C e depois lavadas e incubadas com o anticorpo secundário. Os núcleos foram coradas com DAPI (Sigma) durante 5 min à temperatura ambiente. sinais de fluorescência foram feitas usando um microscópio confocal (Carl Zeiss LSM710).

Telomere ChIP ensaio e Dot Análise Blot

Telomere ChIP ensaio e Dot Análise Blot foram realizadas conforme relatado anteriormente [19]. Após precipitação com o anticorpo TRF2, o ADN foi purificado a partir de cromatina imunoprecipitada e transferidas para uma membrana Hybond-N (Amersham), e as sequências de repetição dos telómeros foram detectadas com um kit de ensaio de comprimento de telómeros TeloTAGGG (Roche Diagnostics). Uma sonda não específica (ALU) foi utilizado como controlo. Os sinais foram medidos usando software de análise de imagem (Bio-Rad).

Análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± SEM. teste t de Student foi utilizado para testar a significância estatística. P 0,05 foi considerado significativo. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Califórnia) software foi utilizado como uma ferramenta de análise estatística.

Resultados

Correlação entre TPP1 Protein Expression, O comprimento do telômero e intrínseca Radiosensibilidade

Em primeiro lugar, examinados TPP1 Protein Expression and telomere comprimentos de cinco células do cancro colo-rectal (Figura 1A e B). Tal como mostrado na Figura 1D, a expressão da proteína TPP1 foi significativamente correlacionado com o comprimento dos telómeros (R = 0,9783, P 0,05). Em seguida, a sobrevivência celular foi medida por um ensaio clonogénico e SF2 foi utilizada como um índice de radiossensibilidade intrínseca (Figura 1C). expressão TPP1 foi negativamente correlacionada com radiossensibilidade intrínseca (R = 0,9792, P 0,05, Figura 1E). Em resumo, as células radiorresistentes têm telómeros mais longos e maior produção de TPP1 do que em células radiossensíveis. Estes resultados indicaram que houve uma correlação significativa entre a expressão TPP1, o comprimento dos telômeros e radiossensibilidade intrínseca celular.

(A) a produção TPP1 foi detectada por transferência Western ..

comprimento (B) Telomere foi examinados por análise de mancha de Southern.

(C) de produção TPP1 Relativa, radiossensibilidade (SF2) e comprimento dos telômeros (TRF) em linhas celulares de cancro colorrectal humanos.

(D) Correlação entre a produção TPP1 e radiossensibilidade (SF2) em colorectal células cancerosas foi examinada.

(e) Correlação entre a produção TPP1 eo comprimento TRF em células de câncer colorretal foi examinada.

TPP1 superexpressão diminui a sensibilidade de células HCT116 à radiação

Para examinar a influência da TPP1 sobreexpressão em radiossensibilidade celular, HCT116-TPP1 e células HCT116-Mock foram estabelecidos (Figura 2A) e a sobrevivência celular foi medida por um ensaio clonogénico. células HCT116-TPP1 mostrou significativamente radiorresistência em comparação com células HCT116-Mock após a exposição IV (Figura 2B).

(A) Verificação de TPP1 superexpressão por western blot.

(B) células HCT116-Mock e-TPP1 foram irradiadas com raios-X e sobrevivência, em seguida celular foi determinada utilizando o ensaio clonogênica.

células HCT116-Mock e-TPP1 (C) foram irradiados com 6 Gy de raios-X e recuperados para os tempos indicados. ciclo celular foi analisada por FACS.

(D) a população de células em G2 /M fases ao longo do tempo em HCT116- Mock e -TPP1 células.

TPP1 superexpressão em Câncer HCT116 células Faz prolongada G2 /M de detenção após a exposição IR

Como se mostra na Figura 2C, a sobre-expressão TPP1 não teve nenhum efeito significativo na distribuição de ciclo celular na ausência de danos no ADN. Após a exposição a radiação, observamos que a G2 /M prisão chegou a um pico em 18 h após a exposição IR tanto em HCT116-Mock e -TPP1 células. Mais importante ainda, a cinética da resposta das linhas celulares foi diferente. Em células HCT116-Mock, o G2 /M pico diminuiu gradualmente a partir de 18h após a radiação ionizante e voltou aos níveis normais em cerca de 42 h. No entanto, a G2 /M, pico em células HCT116-TPP1 não diminuir, mas ainda mantido a um nível elevado até 30-36 h após a IR. Estes resultados sugerem que G2 TPP1 superexpressão em células HCT116 prolongada /M detenção após a exposição IR.

G2 induzida por TPP1 /M Prolongamento Arrest é mediada por ATM /ATR-Chk1 Pathway

Para identificar o mecanismos moleculares de G2 prolongada /M parada após exposição IV em células que sobre-expressam TPP1, medimos a produção de ATM, ATR e Chk1. Descobrimos que as expressões de ATM e ATR foram ambos elevados em células HCT116-TPP1 (Figura 3A). Então, nós investigamos as ativações de Chk1, um importante substrato da ATR e ATM. Descobrimos que os níveis de fosforilação de Chk1 em Ser345 foram maiores até 36 horas após a exposição IR em células HCT116-TPP1. Em contraste, os níveis em células HCT116-Mock tinha voltado aos níveis normais em cerca de 30 horas após a exposição ao IV (Figura 3B). Estes resultados indicam que G2 prolongado /M detenção pela TPP1 superexpressão é provavelmente devido à ATM /ATR-Chk1 via de sinalização.

(A) análise de Western blot revelou que TPP1 superexpressão aumentou a expressão de ATM e ATR.

(B) células HCT116-Mock e-TPP1 foram irradiadas com 6 Gy de raios-X e incubaram-se durante tempos indicados. Western blot foram pré-formada para detectar a expressão de Chk1 e p-Ser

345-Chk1.

TPP1 superexpressão inibe a apoptose induzida por radiação ionizante

Foram avaliados os efeitos da TPP1 na apoptose induzida por radiação utilizando análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4, verificou-se que não havia nenhuma diferença significativa entre as células HCT116-TPP1 (5,72 ± 0,15% para 5,55 ± 0,12%, p 0,05) HCT116-Mock e, mas TPP1 sobreexpressão pode atenuar a radiação (5Gy) induzida níveis de apoptose, a partir de 26,89% ± 0,75 em células de controlo para 17,47 ± 0,45% das células HCT116-TPP1 (p 0,05). Estes dados indicaram que o aumento da radiorresistência TPP1 por sobre-expressão pode ser devido a um decréscimo na apoptose induzida pela radiação.

células HCT116-Mock e-TPP1 foram irradiados com 5 Gy de raios-X e incubaram-se durante 24 h. A percentagem de células apoptóticas foi medida por citometria de fluxo.

(A) Os resultados representativos de grupos diffrerent são mostrados.

(B) Os dados apresentados são médias ± SEM de três experiências independentes.

*, P 0,05.

TPP1 superexpressão Aumenta Telomere Comprimento em Células HCT116

Para investigar mais o papel de TPP1 no controle comprimento dos telômeros, as células HCT116-TPP1 e -Mock foram cultivadas por 20 PD e comprimento dos telómeros foi medida por Southern blotting. Nós apresentado que o comprimento médio dos telómeros de células HCT116-TPP1 foram gradualmente aumentado do que nas células de controlo (Figura 5A). Estes resultados sugerem que a sobre-expressão TPP1 poderia aumentar o comprimento dos telómeros nas células HCT116.

(a) média TRF comprimentos em diferentes DPs foram detectados por transferência de Southern. PD, de duplicação da população. A posição de SM (kb) está indicada à esquerda.

(B) TRAP ensaio de ELISA por PCR foi utilizada na análise da actividade da telomerase em diferentes PD.

(C) análise de transferência de Western revelou que TPP1 superexpressão não teve influência significativa sobre a expressão da hTERT.

(D) ensaios Telomere-chip foram realizados utilizando um anticorpo TRF2 para examinar o DNA telomérico obrigado a pelo TRF2. Entrada, sobrenadante antes da imunoprecipitação; PPT, complexo imunoprecipitado proteína-ADN. Específico (telomérico) e sondas inespecíficos (ALU) foram utilizados.

DNA telomérica no chip (%) = sinais de DNA telomérico de sinais ppt /DNA telomérico de entrada * 100%.

TPP1 superexpressão não tem impacto telomerase atividade

Para investigar se os telômeros alongados em células HCT116-TPP1 foram resultado do aumento da atividade da telomerase, os níveis de atividade da telomerase e proteína hTERT nas células HCT116-TPP1 foram comparados com HCT116-Mock células. Não houve aumento detectável nos níveis de proteína hTERT ou da actividade da telomerase em células HCT116-TPP1 em comparação com células falsamente ou células parentais (Figura 5B e C). Este resultado indica que telômero alongamento por TPP1 não é devido a um aumento global da actividade da telomerase.

TPP1 superexpressão acelerou a cinética de reparação de dano ao DNA induzido pela IR

Nós usamos ensaio TIF para estabelecer se a cinética TPP1 superexpressão de reparação impacto de danos no DNA em telômeros. ensaio telomere-chip revelaram que a sobreexpressão TPP1 não teve impacto sobre a associação entre TRF2 e telómeros (Figura 5D), de modo TIFs foram monitorizados por co-localização de TRF2 e γ-H2AX neste estudo (Figura 6A). Observou-se significativamente mais baixos de frequências espontâneas TIFs nas células HCT116-TPP1 em comparação com as células de controlo (p 0,05), as células (Figura 6B) .Em seguida, HCT116-TPP1 -Mock e foram expostos a 1 Gy IR e coradas para identificar o TIF focos em 0.5, 6 e 12 h após a exposição ao IV. A nossa pesquisa sugeriu que as células sobre-expressão TPP1 foram capazes de reparar TIFs mais eficientemente do que as células de controlo. Por exemplo, as frequências de TIFs induzidas IR foram semelhantes em HCT116-TPP1 e células HCT116-Mock 0,5 h após a IV, indicando que TPP1 não reduziu o número de TIFs induzida por IR. Em seguida, as células TPP1 superexpressão tinha aproximadamente 0,53 TIFs /celulares 12 horas após IR, enquanto as células simuladas tinha 1,04 TIFs /celulares 12 horas após IR (Figura 6C). Assim, as células HCT116-TPP1 mostrou maior capacidade para reparar danos na telômeros. O ensaio de TIF focos identificados γ-H2AX em telómeros, bem como focos H2AX total de γ-no núcleo. Em seguida, quantificada a formação de um total de focos γ-H2AX, um marcador para a LAP, para investigar o mecanismo subjacente para a radiorresistência. Similar com os resultados do ensaio TIFs, a taxa do total de reparo do DNA de fita dupla ruptura foi acelerada pela TPP1 superexpressão. Estes dados indicam que a superexpressão TPP1 pode acelerar a velocidade de reparação do ADN após a exposição à radiação.

HCT116-Mock e -TPP1 foram expostas a 1 Gy IR e incubou-se a pontos de tempo indicados .. Os resultados baseiam-se em três experiências independentes com, em média, 100 núcleos celulares analisados ​​por experiência por ponto. As barras representam a média ± SEM de 3 experiências independentes.

(A) Imagens representativas para TIFs são mostrados.

(B) A frequência de focos positivo espontânea γ-H2AX e TIFs em HCT116-Mock e -TPP1 células.

(C) cinética de reparação de IR TIF induzida em HCT116-Mock e -TPP1 células colorretal. TIFs médias por célula em diferentes momentos após a exposição IR foram quantificados.

(D) cinética de reparação de IR danos no DNA induzidos em HCT116-Mock e -TPP1 células colorretal. Averageγ-H2AX focos positivo por células em diferentes pontos de tempo após a exposição de IV foram quantificados.

Discussão

Nós demonstramos pela primeira vez, a nosso conhecimento, que TPP1 superexpressão está associada com radiorresistência em células de cancro colorrectal neste trabalho.

TPP1 desempenha um papel crucial na regulação do comprimento dos telômeros e DNA danos resposta. Neste estudo, demonstramos que a expressão TPP1 foi estreitamente relacionado com o comprimento dos telômeros e radiossensibilidade em células de cancro colorrectal. Além disso, verificou-se que a sobre-expressão ectópica de TPP1 levou a radiorresistência e alongamento dos telômeros em células HCT116. pesquisas anteriores verificou-se que houve uma correlação negativa significativa entre o comprimento dos telômeros e radiossensibilidade [10,11,13]. Nosso estudo indicou que TPP1 envolvido em radiorresistência através da regulação do comprimento dos telômeros. Os telómeros desempenhar um papel fundamental na manutenção da integridade do cromossoma e a estabilidade, e comprimento dos telómeros está associado com reduzido risco aumentado de cancro [23]. Os níveis de proteína POT1 estão associados com o comprimento dos telômeros em câncer gástrico [24,25]. TPP1 heterodimerizes com POT1 mas não há resultados sobre a correlação entre os níveis TPP1 e comprimento dos telômeros em amostras de câncer. Nós pensamos que a correlação entre os níveis TPP1 e comprimento dos telômeros em amostras de cancro colorrectal é de grande importância. Na verdade, no nosso estudo, nós tentamos fazer este trabalho usando amostras de parafina, mas descobriu que tecidos cancerosos frescos são mais adequados para o experimento de transferência de Southern. Em nosso estudo seguinte, iremos recolher mais amostras de tecido de cancro fresco e verificar a relação entre TPP1 e comprimento dos telômeros em câncer colorretal usando tecidos de câncer frescos.

Nós descobrimos que TPP1 superexpressão prolongada G2 induzida por radiação /M prisão depois IR exposição. Células presas em fase G2 /M permitir mais tempo para reparar os danos, assim, conferir radiorresistência. Ativação de postos de controle regula a detenção do ciclo celular em resposta a danos no DNA. ataxia telangiectasia (AT) mutado (ATM) e ATM e (ATR) proteínas quinases relacionadas com RAD3 são importantes do ponto de verificação a montante cinases de DNA danos resposta [26]. Nós revelou que TPP1 superexpressão elevou as expressões de ambos ATM e proteína ATR. Estudos anteriores demonstraram que o aumento dos níveis de proteína ATM correlacionada com radiorresistência intrínseca em tumores GBM [27]. Kim e seus colegas descobriram que a ATR superexpressão levou a G2 M detenção prolongada e /radiorresistência em células HCT116 [28]. Muitos estudos demonstraram também que a inibição da actividade de ATM ou ATR podia resultar no aumento da radiossensibilidade [29,30]. Chk1 é um substrato importante da ATM e ATR. Além disso, Chk1 é um alvo eficaz para radiossensibilização de células cancerosas humanas [31,32]. A fosforilação de Chk1 em S345 é considerado como um indicador de activação de Chk1. Neste trabalho, descobrimos que Chk1 fosforilação foi elevado e sustentado até momentos posteriores após a exposição IR em células TPP1-sobre-expressam em comparação com as células simuladas. Nosso estudo pode indicar que prolongada detenção G2 por TPP1 é provavelmente devido a maiores níveis de sinal via ATM /ATR-Chk1.

Muitos estudos têm mostrado que a homeostase do telômero serve como um alvo potencial no tratamento do câncer, especialmente em radioterapia . homeostase dos telómeros podem ser mantidas por telomerase, bem como as suas proteínas associadas (denominados como shelterin). o comprimento dos telômeros, a atividade da telomerase e disfunção dos telômeros são os principais marcadores da homeostase do telômero. Em primeiro lugar, a análise do comprimento de telómeros mostrou significativo alongamento dos telómeros nas células HCT116-TPP1 em comparação com células de controlo, indicando que TPP1 pode actuar como um regulador positivo do comprimento dos telómeros. No entanto, observou-se que a expressão de TPP1 teve nenhum efeito sobre o comprimento dos telómeros nas células de fibrossarcoma HTC75 humanos [16]. A diferença entre estes resultados podem ser devidos à distinta escolhido em linhas celulares. Curiosamente, não houve nenhum aumento detectável na actividade de telomerase, ou os níveis de proteína em células HCT116 hTERT-TPP1 em comparação com células de controlo. Este resultado indica que o alongamento de telómeros por TPP1 não é devido a uma mudança global da actividade de telomerase, mas pode ser devido à translocação nuclear de hTERT ou localizada a activação da telomerase na telomere.

co-localização dos telómeros e activada marcadores de DDR (como 53BP1 andγ-H2AX), assim chamados focos induzida por disfunção dos telômeros (TIF), é uma marca típica da disfunção dos telômeros. TIFs implica DDR dos telômeros não niveladas [33] estudos .Recent demonstrou que TPP1 envolve em resposta DNA danos e supressão de expressão TPP1 em fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs) ou células cancerosas humanas poderia iniciar disfunção dos telômeros [19,20]. Neste estudo, descobrimos que TPP1 superexpressão inibiu as TIFs espontâneas em células HCT116 colorretal. Então TPP1 pode proteger a estrutura dos telômeros e manter a função do telômero normal.

Nós descobrimos que TPP1 superexpressão acelerou a cinética de reparação de ruptura total DNA dupla vertente induzida pela exposição IR. Mais importante ainda, TIF de ensaio revelaram que a taxa de reparação de danos no ADN em telómeros seguinte radiação também foi acelerada pela TPP1 superexpressão. Telomere homeostase tinham sido identificados para servir como um alvo potencial na radioterapia. Estudos revelaram que a inibição da telomerase pode resultar em disfunção dos telômeros e, portanto, aumento da radiossensibilidade [22,34]. Também foi confirmado que a ruptura de shelterin pode resultar em disfunção do telómero [14,20]. David Soler e colegas mostraram que os telómeros disfuncionais em células epiteliais humanas eram susceptíveis de interferir com a reparação eficiente de LAP induzida por radiação e, em seguida, levou ao aumento da radiossensibilidade [35]. Nosso estudo demonstrou que TPP1 podem participar na homeostase dos telômeros e poderia proteger telômero da radiação em células de câncer colorretal em humanos.

Em conclusão, este estudo revela que os níveis elevados TPP1 proteger dos telômeros de danos ao DNA e conferem radiorresistência no cancro colorectal humano células. Além disso, podemos fornecer provas da correlação entre TPP1expression, o comprimento dos telômeros e radiossensibilidade intrínseco. Além disso, este estudo tem avançado a compreensão da relação entre a homeostasia de telómeros e radiossensibilização. Estes resultados sugerem que os níveis de TPP1 pode ser um indicador útil da capacidade de resposta à terapia de radiação. Em resumo, o nosso estudo, pela primeira vez indica que TPP1 pode ser um alvo potencial na radioterapia do cancro colorectal. Além disso, TPP1 inibição inibição TPP1 pode fornecer um adjuvante funcional em terapia de radiação, uma possibilidade que estamos investigando.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Suíça)) por sua amável do plasmídeo pcDNA6-flag-hTPP1.