Abstract

heterogeneidade celular desempenha um papel fundamental em uma variedade de processos funcionais in vivo incluindo carcinogênese. No entanto, o nosso conhecimento sobre a diversidade e como as diferenças de célula-célula em células individuais se manifestam em alterações no nível populacional permanece muito limitada, principalmente devido à falta de ferramentas adequadas que permitam estudos ao nível de uma única célula. Nós apresentamos um estudo sobre mudanças na heterogeneidade celular no contexto da progressão da pré-malignas em resposta ao estresse hipóxico. Utilizando progressão pré-maligno de esófago de Barrett (BE) como um sistema modelo de doença foram estudados os mecanismos moleculares subjacentes a progressão de metaplásico para displásico fase (pré-cancerosa). Nós utilizados métodos que permitem medições de diferenças célula-a-célula em números de cópias de ADN mitocondrial, os níveis de um conjunto de genes mitocondriais e nucleares envolvidas nas vias de resposta a hipoxia, e o potencial de membrana mitocondrial de expressão recentemente desenvolvido. Em contraste com os estudos de células granel relatados anteriormente, o nosso estudo mostra diferenças significativas entre metaplásicas e displásicas ser células em ambos os valores médios e as distribuições de parâmetros de uma única célula de mtDNA copiar números, a função mitocondrial, e os níveis de expressão de ARNm de genes estudados. Com base na análise de dados de uma única célula, propomos que as mitocôndrias pode ser um dos fatores-chave na progressão da pré-malignas em BE

Citation:. Wang J, Shi X, Johnson RH, Kelbauskas L, Zhang W, Meldrum DR (2013) Análise de uma única célula revela manifestação precoce de Cancerous Fenótipo em células esofágicas pré-malignas. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10.1371 /journal.pone.0075365

editor: Nagendra Yadava, Escola UMASS-Amherst /Tufts University of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de junho de 2013; Aceito: 12 de agosto de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento veio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), Instituto National Human Genome Research (NHGRI), Centro de Excelência em Ciências Genomic (CEGS) e microescala Life Sciences Centro Grant No. 5 P50 HG002360 (DRM PI) http: //www.genome .gov /. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma esofágico (EAC) é um tipo de cancro altamente letal e acredita-se desenvolver a partir de células epiteliais esofágicas através de uma série de complexos, transformações passo a passo ao nível biomolecular [1] – [6]. Uma vez transformado, células EAC produzir níveis significativamente mais elevados de moléculas antioxidantes tornando-os resistentes a níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS) [2]. Embora estudos recentes tenham demonstrado que a sequência de transformação envolve o desenvolvimento de hiperplasia e metaplasia causada por inflamação crónica do epitélio escamoso esofágico, seguido por displasia multifocal, carcinoma

In situ

e, finalmente, invasivo EAC [1], [7], [8], o mecanismo molecular detalhada subjacente a esta transformação ainda precisa ser esclarecida

a hipóxia desempenha um papel fundamental no câncer [9] – [16].. Como em quase todos os tumores sólidos, abastecimento de oxigénio para as células cancerosas é muito comprometida devido ao crescimento celular descontrolado e desenvolvimento inadequado da microcirculação. A mitocôndria, a força motriz da célula e a principal fonte de trifosfato de adenosina (ATP) em células normais, é o lugar onde a fosforilação oxidativa (FOX) ocorre. As mitocôndrias foram também encontrados para desempenhar um papel importante na morte celular programada, ou apoptose, e a sua disfunção está associada com uma variedade de doenças. Por exemplo, as variações no DNA mitocondrial (mtDNA) Número de cópia tem sido associada não apenas com diferentes condições fisiológicas celulares mas também com diversas mudanças de microambientes internos e externos [17], [18]. Tem sido demonstrado que as mitocôndrias pode gerar um aumento dos níveis de ROS durante hipoxia [19], o que levou ao postulado que as mitocôndrias, o alvo principal para o dano oxidativo, pode funcionar como um sensor de oxigénio endógeno.

Um dos fatores mais importantes que determinam a resposta à droga e agressividade dos tumores é a grande heterogeneidade intratumoral. Estudos recentes têm demonstrado que mesmo as células de uma população clonal ou tecido aparentemente homogéneos exibem uma variabilidade substancial de características diferentes, que vão desde os níveis de expressão de genes com características fenotípicas [20] – [22]. já é amplamente aceito que a heterogeneidade mitocondrial, incluindo variações no mtDNA número de cópias, mutação do DNA /exaustão, expressão e regulação dos genes codificados pelo mtDNA, e os níveis de atividade, é um importante contribuinte para a complexidade mitocondrial e contribui para a heterogeneidade geral célula-célula [23] – [25]

a maioria das técnicas atuais bioanalíticos recolher dados utilizando milhares a milhões de células, inerentemente fornecendo resultados em média, em uma população de grandes células.. Tais abordagens de células massa poderia potencialmente perder informações importantes e valiosas quando se lida com sistemas altamente heterogêneos [26], como câncer [27]. Por conseguinte, o desenvolvimento e aplicação de técnicas capazes de realizar análises ao nível de uma única célula são críticos, não apenas para uma melhor compreensão de processos celulares essenciais, mas também para novas estratégias mais eficazes para a prevenção da doença, gestão e tratamento [28 ] – [31].

neste estudo utilizamos dois imortalizado Barrett humana do esôfago linhas de células epiteliais CP-A e CP-C que foram originalmente derivados de pacientes com esôfago de Barrett (BE) sem displasia e com displasia, respectivamente [32]. Embora ambos são células epiteliais não malignas, verificou-se que as células CP-C eram mais resistentes ao stress oxidativo induzido pelo ácido biliar (ácido quenodesoxicólico (CDCA)) que CP-A, o que sugere que, pelo menos no que diz respeito à resposta ácido, CP- células C comportar mais como linhas celulares de cancro do esófago, em comparação com as células CP-a [2]. Neste estudo, pretendemos elucidar possíveis mecanismos que conduzem à transformação maligna em BE, quantificando diferenças na forma como as células respondem ao estresse oxidativo causado pela hipóxia. Aplicou-se uma técnica baseada-qPCR desenvolvido no nosso laboratório para determinar o número de cópias do mtDNA e os níveis de expressão e mitocondrial genes nucleares em células individuais. Utilizando a análise de uma única célula que distingue as diferenças no mtDNA número, potencial de membrana mitocondrial, e resposta a hipoxia níveis de expressão do gene entre as células CP-C, que não podem ser previstos por análise de células grandes quantidades CP-A e copiar. A aplicação destes novos métodos, juntamente com uma única célula O

2 medições de consumo [33] – [35], permitiu a caracterização das diferenças de resposta a hipóxia sutis entre células CP-C CP-A e. Uma melhor compreensão das bases moleculares da EAC início e desenvolvimento irá facilitar esforços para definir potenciais alvos terapêuticos.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Tratamento hipóxia

esôfago de Barrett linhas de células epiteliais CP-a e FP-C foram obtidas de ATCC e cultivadas em Gibco® queratinócitos meio sem soro (SFM) meio de crescimento celular (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) a 5,0? g /L, BPE (extracto de pituitária de bovino) a 50 mg /L e solução de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 100/100 ug /ml numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C em ar humidif içado com 5 % de CO

2. Antes da experiências, as células foram cultivadas num 75 cm

2 balão a cerca de 80% de confluência. As células na fase G1 ordenados com FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) foram usadas em experiências qPCR no presente estudo. Para hipoxia, as células CP-A e FP-C a 80% de confluência foram incubadas no meio de queratinócitos SFM contendo 2% (v /v) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, OH) a 37 ° C durante 30 minutos, as quais é o tempo de tratamento Oxyrase óptima como determinado anteriormente [31]. As células foram, subsequentemente, tratadas com tripsina em 0,05% (v /v) de solução de tripsina contendo 2% (v /v) Oxyrase, a 37 ° C durante 9 min. A tripsinização foi bloqueada por adição de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Invitrogen) supplmented com 5% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen), contendo 2% (v /v) Oxyrase.

uma única célula de colheita

colheita de células Individual (aspiração e distribuição) foi realizada utilizando um micromanipulador desenvolvido pelo nosso grupo [36], [37] (Métodos S1).

projeto Primer e Seleção de gene alvo

fragmentos dentro da região hipervariável I (HVI) no mtDNA foram escolhidos para análise do número de cópias [38], [39]. O ADN total isolado a partir de amostras de areia (1 × 10

4 células) foi utilizado como molde para cópias de mtDNA de medição do número e quantificada utilizando um tempo real qPCR Sistema (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando iniciadores optimizada ( métodos S1). Para RT-qPCR análise de nível de expressão, quatro genes codificados mitocondrial (16S rRNA,

Coxi

,

COXIII, CYTBI Comprar e quatro genes nucleares (28s rRNA, VEGF, MT3, e PTGES) (iniciadores sequências como [31]) foram escolhidos (Métodos S1).

-única célula mtDNA Copiar Número Determinação

Após a colheita, tubos, cada um contendo uma célula suspensa em 6 mL de tampão de lise DNaST [26] foram imediatamente congeladas em gelo seco, e, em seguida, armazenada a -80 ° C até a análise por qPCR. Cada qPCR foi executado em um volume total de 10 �, contendo 2 ul de lisado de solução DNaST como um modelo. Para determinar o número de cópia do mtDNA, os produtos qPCR de amostras a granel foram purificados, quantificados e diluídos em série (número de cópias de 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) para uma série de reacções qPCR. os resultados foram utilizados para traçar uma curva padrão para cada gene. O valor de Ct de cada única célula foi então transferida para o número de cópia do mtDNA absoluta utilizando as curvas padrão

mitocondrial potencial de membrana

potencial de membrana mitocondrial (MMP) foi quantificado com análise por microscopia confocal utilizando o corante JC-1 potenciométrica (100 ng /mL) como fluororo e publicados protocolos de coloração obtidos. [40 ], [41] (Métodos S1).

-cell único Gene Expression Analysis

-única célula RT-qPCR foi realizado como descrito anteriormente [31], [42].

analisa Análise

dados

estatística, incluindo testes de significância, foram realizados utilizando o pacote de software OriginPro (v. 8, OriginLab, Northampton, MA). níveis de significância estatística foram calculados utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney-Wilcoxon bicaudal.

Resultados

método baseado em qPCR para mtDNA Copiar Número Adetermination em células individuais

Diversas regiões de ADN mitocondrial, tais como HVI, têm sido utilizados como alvos para a análise de número de cópias do mtDNA baseado em PCR em amostras granel antes [43]. Um par de iniciadores com o valor mais baixo Ct, controlo negativo distinta, picos agudos e distintas de produto de amplificação nas curvas de fusão, e o produto de amplificação correcta confirmada por sequenciação foi seleccionado para cada uma das regiões para análise posterior de uma única célula (Fig. S1 ,

HV1

). As diluições em série de fragmentos de DNA mitocondrial amplificados por PCR contendo a região HVI foi usado para fazer qPCR curvas padrão para o número de cópias do mtDNA. Com os pares de primers selecionados, a região HVI foi demonstrada para ter o melhor desempenho, com o

R

2 = 0,9925, para o número de cópias de ADN que varia de 10

2 a 10

6 ( Fig. S2).

RT-qPCR para análise da expressão genética em células individuais

recentemente, relataram sobre uma nova técnica que permite o isolamento, a purificação, e a transcrição do ARN total a partir de uma única inverter célula de mamífero, seguido por análise de RT-qPCR dos níveis de genes codificados-nucleares [31] expressão. Seguindo o mesmo procedimento, determinou-se em células individuais os níveis de vários genes seleccionados envolvidas em resposta hipoxia de expressão, incluindo as mitocôndrias codificado

COXI

,

COXIII

, e

CYTBI

[43] – [45], e o

VEGF

,

MT3

,

ANGPTL4

e

PTGES

genes codificados pelo DNA nuclear, com 16S rRNA e 28S rRNA foram usados ​​como controles internos [31], [38], [46] – [48].

-única célula mtDNA Copiar Análise Número na CP-a e linhas de células CP-C

estudos anteriores baseados na análise de células em massa indicaram que a massa mitocondrial média não diferiu significativamente entre as células CP-C [2] CP-a e. Neste estudo, os resultados de análises de grandes quantidades de células inicial também mostraram uma ligeiramente mais elevadas, mas estatisticamente não significativos mtDNA médios número de cópias em células CP-C (~1,530 por célula) em comparação com CP-A (~1,392 por célula) (fig. S3). A análise de uma única célula com base em 99 células individuais de cada linha celular revelou diferenças estatisticamente significativas (p 0,002) em número de cópias do mtDNA entre as células CP-C CP-A e (Fig. 1A, B). 92 de 99 (92%) células CP-A mostrou mtDNA copiar números que variam entre 106-1,900 por célula com apenas 8 células (8%) contendo mais de 2.000 cópias por célula, enquanto que em 92 de 99 células CP-C mtDNA números de cópias variou entre 171-2,952 por célula, com 8 células com mais de 3.000 cópias por célula (Fig. 1A). Em média, as células CP-C tinha cerca de 43% mais do que o mtDNA células CP-A (1363 (CP-C) x 951 (CP-A); A Fig. 1B, Quadro 1). foram calculados parâmetros descritivos dos histogramas população mtDNA, incluindo assimetria (medida de simetria), curtose (medida de peakedness) eo fator de Fano (medida de dispersão). Ambos os valores de assimetria e de curtose foram estatisticamente significativamente menor em células CP-C em comparação com células CP-A, enquanto que o fator de Fano não foi significativamente diferente (Tabela 1).

A) Única célula mtDNA copiar distribuição de números em (CP-C) células metaplásicas (CP-a) e displásicas, B) cartas de caixa das duas distribuições mostrados no painel A. seguintes valores estão representados: praça aberta – média; linha contínua – média; superior e inferior da caixa de linhas – o

th 75 e 25

th percentis, respectivamente; superior e bigodes mais baixas – o

th 95 e 5

th percentis, respectivamente; X – Os valores mínimos e máximos da distribuição. O valor de p 0,002 foi calculado utilizando o teste de Mann-Whitney, o teste de significância estatística não paramétrica bicaudal (n = 99); mtDNA copiar números variam entre 150-1,900 C-D) de JC-1 micrografias de fluorescência de hipóxico CP-A (C) e as células hipóxicas CP-C (d); distribuições de células únicas do potencial de membrana mitocondrial relativa em CP-A (E) e as células CP-C (F). JC-1 a partir de sinais de cerca de 100 células por linha de células e condições foram analisados; G) representação estatística da distribuição MMP em ambos os tipos de células /condições.

Respostas

diferenciais à hipóxia entre as células CP-A e CP-C no nível de uma única célula

potencial de membrana mitocondrial difere significativamente entre as células CP-C CP-a e.

potencial de membrana mitocondrial (MMP) gerado pela cadeia de transporte electrónico mitocondrial reflete o estado funcional das mitocôndrias. Tem sido relacionada com a resposta fisiológica e a produção de ROS [49]. JC-1 tem sido amplamente usados ​​em estudos de apoptose mitocondrial para monitorar a saúde e a disfunção no contexto do cancro e de doenças neurodegenerativas [40], [41].

imagens de fluorescência utilizando JC-1 coloração revelou diferenças notáveis ​​entre CP -A e células CP-C (100 células de cada tipo), sob ambas as condições de controlo e de hipóxia (Fig. 1C, D). Sob condições de crescimento normóxicas (21% O

2), as células CP-A mostrou relativamente baixo vermelho (590 nm) para verde (529 nm) fluorescência relação da intensidade com uma média de 2, enquanto que as células CP-C exibiu uma proporção média de 3,8 (Fig. 1E-G). Após a exposição à hipóxia por 30 min (ver Métodos), as células de ambos os tipos mostraram redução rácios de intensidade de fluorescência vermelho /verde, com média de 0,6 e 1,5 para as células CP-C CP-A e, respectivamente (Fig. 1G). Os dados estatísticos descritivos são resumidos na Tabela 2.

heterogeneidade mitocondrial dentro e entre os diferentes tipos de células foi relatado anteriormente, revelando grandes variações na MMP entre células do mesmo tipo dentro de um prato de cultura única [23] . No nosso estudo, a análise dos dados de MMP unicelulares revelou estatisticamente valores de curtose significativamente mais elevados em células normóxicas CP-C, em comparação com as células CP-A normóxicas, ao passo que a assimetria foi comparável. Sob condições hipóxicas observou-se uma tendência oposta, com as células CP-A com valores significativamente mais elevados de curtose de células CP-C, enquanto que os valores de assimetria não foram significativamente diferentes. Estes dados indicam respostas diferentes à hipoxia entre as duas linhas de células e implica que os dois tipos de células reagir a hipoxia de forma diferente, não só em termos da média de MMP, mas também no que diz respeito à sua distribuição entre as células individuais. Os valores de distribuição curtose MMP sugerem maior heterogeneidade MMP da mitocôndria no displásicos (CP-C) do que metaplásico (CP-A) ser células.

Análise da expressão do gene mitocondrial em células individuais.

Três genes codificados mitocôndrias,

COXI

,

COXIII

e

CYTBI

, foram selecionados para análise de expressão devido ao seu papel significativo na função mitocondrial e envolvimento em resposta a hipoxia [44], [45]. Em primeiro lugar, foram comparados os níveis de expressão relativa de genes entre estas condições de normóxia e de hipóxia em amostras de células em massa usando rRNA 16S mitocondriais como uma referência interna. Todos os três genes mitocondriais mostrou um padrão de resposta à hipóxia muito semelhante: um aumento de se observou 1,5-2,6 vezes com grande variabilidade em ambas as células CP-A e CP-C (Fig S4A, B).

Para gene. análise da expressão ao nível de uma única célula, com um total de 24 células de cada tipo de célula e condições (normóxia e hipóxia) foram isolados. Os resultados mostraram um elevado grau de variabilidade célula-a-célula nos níveis de todos os quatro genes mitocondriais de expressão em células de ambos os tipos (Fig. 2-4). Por exemplo, os valores Ct do 16S rRNA em células CP-A variou de 20 a 26 (chegando a 30 em um caso), ea gama nas células CP-C foi entre 20 e 25. Os valores Ct de

COXI

,

COXIII

e

CYTBI

em ambas as linhas celulares foram entre 20 e 35, com valores médios de Ct de 22.4~27.9, 26.8~28.2 e 28.3~30.2, respectivamente (Fig. 2, 3 ). Uma redução significativa no valor Ct do gene 16S rRNA (

p Art 0,05, n = 24) foi observada em-A CP único células de hipóxia, enquanto apenas ligeiro, mas estatisticamente significativa mudança foi detectada em CP- hipóxica células C (

p Art 0,05, n = 24) (Fig. 3,

16s rRNA

). Do mesmo modo, uma diminuição significativa no valor de Ct para

COXI

(

P

0,001, n = 24) foi observada em CP-A, mas não em células CP-C em condições hipóxicas como em comparação com a normoxia (Fig. 2, 3,

COXI

). Desde baixos valores Ct significa mRNA maiores copiar números, 16s rRNA e

Coxi

níveis de mRNA em células CP-A foram significativamente up-regulada por hipóxia, indicando que ambos os genes em células CP-A responder à hipóxia. Curiosamente, quando o Ct médio

valores Coxi

foram normalizados contra o nível de 16s expressão rRNA Ct

16S

, um passo padrão para cálculo dos níveis de mRNA relativos a granel amostras de células, a redução da

COXI

valores Ct em resposta à hipoxia não foi significativa, o que é consistente com o nível de volume os resultados da análise de expressão gênica deste estudo (Fig. S4). Em contraste, um aumento significativo valor Ct foi detectado em

CYTBI

(

p

= 0,03, n = 24) em células CP-C mas não em células CP-A (

p

= 0,43, N = 24) (Fig. 2, 3,

CYTB1

), o que sugeriu uma regulação pela hipóxia deste gene codificado para as mitocôndrias em células CP-C. É interessante notar que os níveis de expressão de 16S rRNA em células normóxicas CP-C são mais elevados do que em células normóxicas CP-A (C

t (CPC) = 22,73 vs. C

t (CPA) = 23,66 , p 0,006), e se aproxima dos níveis em células CP-a hipóxia (C

t (CPA) = 22.09). No entanto, o nosso estudo mostrou também que o número médio de cópias do mtDNA por célula são maiores nas células CP-C (Fig. 1B, Quadro 1). Portanto, para fazer uma comparação directa entre as duas linhas de células possível, foram calculadas as diferenças relativas nos níveis de expressão de genes e normalizou-los contra os mtDNA média copiar números usando a seguinte equação: onde mtDNA é o número de cópias do DNA mitocondrial média por célula. Ao calcular r

norma podemos determinar as diferenças relativas nos níveis de expressão do gene entre os dois tipos de células por molécula de mtDNA. Este parâmetro também pode ser interpretada como uma medida da “actividade mtDNA” porque representa a relação entre os níveis de expressão génica relativos e número de cópias do DNA mitocondrial. Utilizando esta expressão descobrimos que sob condições de normóxia 16S rRNA é expressa 33% maior por molécula mtDNA em células CP-C do que em células CP-A. Um resultado semelhante é válido para

COXI

(28% maior no CP-C do que a CP-A) e

COXIII

(32%), enquanto

CYTBI

exposições 2.45- dobrar menor expressão por molécula mtDNA na CP-C em comparação com células CP-a. Além disso, observamos diferenças marcantes na distribuição de expressão gênica parâmetros de assimetria e curtose-entre as respostas de hipoxia em células CP-C (Fig. 4) CP-A e. Embora nenhuma tendência clara nos assimetria de distribuição ou de curtose é óbvio, em resposta à hipoxia em células CP-A (Fig. 4A, C, E, G), as células CP-C exibem um aumento nítido e estatisticamente significativo em ambos assimetria e curtose da distribuições de

COXI

,

COXIII

e

CYTBI

expressão gênica (Fig. 4F, H). Por outro lado, excepto para

PTGES

, os genes nucleares estudados não apresentaram diferenças significativas nos parâmetros de distribuição em células CP-C (Fig. 4B, D). É importante notar que os valores médios de

COXI

e

COXIII

níveis de expressão em células normóxicas e hipóxicas CP-C não eram significativamente diferentes ao nível de grandes quantidades (Fig. S4). Esta descoberta demonstra novamente a utilidade de uma única célula de análises para obter acesso a informações disponíveis de outra forma.

Os histogramas de níveis de expressão genética no controle (

bares vazios

) e tratados com hipóxia (30 minutos ,

barras sólidas

) células CP-A e CP-C. Os histogramas de distribuição foram gerados usando o mesmo tamanho bin.

Os diagramas de caixa de níveis de expressão genética de uma única célula e

p

-Valores associada com as diferenças entre normóxica e condições de hipóxia em as duas linhas celulares. O gráfico de caixa mostra os seguintes valores estatísticos: Abra quadrados – médios, linha sólida – mediana, linhas superior e inferior de caixa – o 75º e 25º percentis, respectivamente, bigodes superiores e inferiores – o 95º e 5º percentis, respectivamente, x – máxima e mínima valores.

Comparação de assimetria de distribuição (a, B, e, F) os valores das distribuições do nível de uma única célula de transcrição do gene entre normóxia e condições hipóxicas e curtose (C, D, G, H) . Uma clara tendência de aumento tanto assimetria e curtose de distribuições de expressão de genes para as mitocôndrias-codificados pode ser visto em células CP-C, em resposta à hipoxia, mas está ausente nas células CP-A. Entre os genes nucleares estudadas apenas o gene PTGES mostrou alterações significativas nos parâmetros de assimetria e curtose em células CP-C.

Expressão

diferencial de genes de resposta à hipóxia nuclear.

Temos demonstrado que os níveis de expressão do gene determinados a partir da análise de uma única célula não eram sempre consistentes com os obtidos através de análise de células grandes quantidades. Observou-se a expressão diferencial de dois genes nucleares em resposta a hipoxia entre grandes quantidades CP-A e amostras de CP-C. Em contraste com as células CP-A, em que

MT3 foi regulada ~ 7 vezes e

VEGF não mostrou nenhuma mudança, as células CP-C apresentaram um aumento de ~ 5 vezes na

VEGF

expressão enquanto

MT3

não mostrou nenhuma mudança significativa (Fig. S4A, B). Ao nível de uma única célula, notamos que mesmo

28s

rRNA, que é comumente utilizado como referência interna em estudos de células granel, mostrou significativo aumento da regulação na CP-A (

p Art 0,05, n = 36), mas não em CP-C (

P

= 0,05, n = 36), as células em condições de hipoxia (Fig. 5,

28s

). Devido aos diferentes níveis de expressão de

28s

rRNA, foram utilizados valores de genes de resposta a hipoxia em vez de delta tradicional Ct (normalizado contra um gene housekeeping) Ct matérias para análise posterior.

Os histogramas de Os níveis de expressão de genes no controle (

bares vazios

) e tratados com hipóxia (30 minutos,

barras sólidas

) células. Os histogramas de distribuição foram gerados usando o mesmo tamanho bin.

Apesar de

28s

expressão rRNA foi detectado em todas as células individuais no estudo, transcrições dos três outros genes codificados nucleares não foram sempre detectada em células CP-a a partir de ambos os grupos de controlo e de hipoxia, mais provavelmente, devido à sua fraca abundância. Por exemplo, de 36 células individuais,

MT3

transcrições foram detectados em 33 controle e 34 células individuais de hipóxia,

PTGES

em 29 e 36, e

VEGF

em 16 e 24. nas células individuais CP-C, no entanto, excepto para

VEGF

(33 de 36), transcritos a partir de todos os genes foram detectados em todas as 36 células individuais. Com base em valores Ct-primas, dois genes de resposta a hipóxia

MT3

(

p Art 0,001, n = 33, 35 em grupos de hipóxia controle e, respectivamente) e

PTGES

(

P

10

-4, n = 27, 36) tinha níveis significativamente aumentados de expressão em células CP-A (Fig 5, 6.). Curiosamente, em hipóxica células CP-C única

PTGES

mostrou um aumento da regulação significativa (

p Art 0,001, n = 36, 36), enquanto os outros dois,

VEGF

e

MT3

, não (Fig. 5, 6). Diferencial

VEGF

expressão do gene sob hipóxia não foi observado em ambos os CP-A ou CP-C em níveis de uma única célula. Em contraste com os genes mitocondriais estudados, não observamos como muitas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros de assimetria e curtose da distribuição de expressão gênica de células individuais (Fig. 4A-D) entre normóxica e as células hipóxicas de ambos os tipos. A distribuição da

PTGES

gene exibiram aumentos estatisticamente significativos em ambos os valores de assimetria e curtose em hipóxica versus células norm�icas CP-C. As formas de distribuição dos níveis de expressão de outros três genes não revelaram alterações estatisticamente significativas em resposta à hipóxia. Em células CP-A apenas o

MT3

gene mostrou uma significativamente aumentada curtose em resposta à hipóxia. Todos os outros genes não apresentaram alterações significativas nos parâmetros de distribuição expressão de uma única célula

A caixa de gráfico mostra seguintes valores estatísticos:. Abrir quadrados – médios, linha sólida – mediana, linhas de caixa superior e inferior – o 75º e 25º bigodes percentis, respectivamente, superior e inferior – o 95º e 5º percentis, respectivamente, x -. os valores máximos e mínimos

Discussão

o achado de níveis significativamente elevados de mtDNA em CP -C comparação com as células CP-a (Fig. 1, Tabela 1) é importante, uma vez que carrega o potencial relevância funcional. Curiosamente, ambos aumentada e diminuída quantidades de mtDNA foram relatados em diferentes tipos de células de tumores sólidos humanos. Por exemplo, níveis reduzidos de mtDNA foram encontrados em células de carcinoma da próstata e associada com o fenótipo invasivo [50], uma regulação negativa da biogénese mitocondrial foi correlacionado com cancro invasivo da mama [51] e progressão do cancro do ovário [52]. Pelo contrário, quantidades elevadas de mtDNA foram relatados na próstata [53], [54], cabeça e pescoço, gliomas pancreáticas [55], e correlacionou-se positivamente com o estágio clínico-patológico no cancro colorectal [56], Shapovalov et al . mostraram níveis aumentados de mtDNA e diminuiu as taxas de respiração em células de osteossarcoma agressivas, em comparação com os osteoblastos e células de osteossarcoma benignos [57]. Além disso, o aumento dos níveis de mtDNA têm sido associados com o risco de desenvolver cancro da mama [58] enquanto que aumentos no mtDNA copiar números têm sido relatados na progressão do normal de pré-maligno de progressão maligna no endométrio [59], carcinogénese de cancros da cabeça e pescoço [60] e na progressão do carcinoma de células escamosas do esôfago [61]. Enquanto o papel funcional do aumento dos níveis de mtDNA em pré-malignas a progressão maligna continua a ser elucidado, a regulação positiva da biogênese mitocondrial foi sugerido para servir como um mecanismo compensatório para a função mitocondrial prejudicada devido aos danos mtDNA em lesões pré-malignas [60], [61]. Assim, é possível que as células epiteliais do esôfago displásicas upregulate biogênese mitocondrial para aumentar a disponibilidade global do modelo para a transcrição, que por sua vez deve aumentar o valor líquido de mRNA mitocondrial e os níveis de proteína correspondentes para manter a função mitocondrial. Notamos que somente a análise do nível de uma única célula revelou que os níveis de mtDNA entre as células CP-C CP-A e são significativamente diferentes, enquanto que a análise de nível de volume não apresentou diferença significativa (Fig. S3). Os valores de assimetria e peakedness mais elevados observados de mtDNA de distribuição de conteúdo em células CP-A são indicativo de um maior grau de desvio da distribuição normal CP-A em comparação com as células CP-C. Enquanto relevância funcional deste achado ainda a ser elucidado, o resultado em si é interessante, pois indica as diferenças de nível de população entre os dois estágios em ser pré-malignas. É possível que devido à pressão selectiva conferida pela bílis e refluxo ácido no esófago, um ou vários subclones na população mais heterogénea de metaplásico células (CP-a) são seleccionados para resultando num menos heterogénea, mais perto do perfil de distribuição normal do conteúdo mtDNA na fase displásicos (células CP-C) mais avançados, de BE. Estudos sobre heteroplasmy do DNA mitocondrial ao nível de uma única célula teria de ser conduzido para fornecer uma visão mais detalhada sobre este achado. No entanto, a descoberta de níveis de mtDNA elevados em displásico ser células indica que a progressão ser pré-maligno é semelhante a outros tipos de progressão (CICAc e cancro da cabeça e pescoço) e que pode ser utilizada como um biomarcador para a detecção precoce de displasia em diferentes tipos de tecidos.

O potencial de membrana mitocondrial (MMP) medições revelaram valores relativos marcadamente mais elevados em normóxica CP-C (1,86 ± 0,41) comparada com CP-A (0,80 ± 0,17), as células (Fig. 1, Quadro 2 ). Quando o número normalizado contra o mtDNA copiar, os valores médios de MMP relativos são cerca de 37% maior no CP-C do que em células CP-A. Este resultado mostra que, em média, por molécula de mtDNA as células displásicas manter os valores de MMP mais elevadas do que as células metaplásicas.