Abstract

Fundo

biomarcadores urinários têm o potencial de melhorar a detecção precoce do câncer de bexiga. A maioria dos vários marcadores conhecidos, no entanto, só foram avaliadas em estudos com delineamento transversal. Para validação adequada um desenho longitudinal seria preferível. Utilizou-se o UroScreen estudo prospectivo para avaliar survivin, um potencial biomarcador que tem múltiplas funções na carcinogênese.

Métodos /Resultados

Survivin foi analisada em 5.716 amostras de urina de 1.540 trabalhadores da indústria química previamente expostas ao aromático aminas. Os trabalhadores participaram de um programa de vigilância com exames anuais entre 2003 e 2010. O RNA foi extraído de células urinárias e survivin foi determinada por PCR em Tempo Real. Durante o estudo, 19 tumores de bexiga foram detectados. Multivariada equação de estimação generalizada (GEE) modelos mostraram que a β-actina, o que representa um rendimento de RNA e qualidade, teve a maior influência sobre positividade survivina. Inflamação, hematúria e fumar não confundir os resultados. Survivin tinha uma sensibilidade de 21,1% para todos e 36,4% para os tumores de alto grau. A especificidade foi de 97,5%, o valor preditivo positivo (VPP) de 9,5%, eo valor preditivo negativo (VPN) de 99,0%.

Conclusões

Neste prospectivo e até agora o maior estudo sobre survivina, o marcador mostrou uma boa NPV e especificidade, mas baixa PPV e sensibilidade. Isto foi em parte devido ao baixo número de casos, o que limita a validade dos resultados. Compliance, qualidade de urina, os problemas com o ensaio, e estabilidade mRNA influenciou o desempenho da survivina. No entanto, a maioria dos problemas poderiam ser resolvidos com um ensaio mais confiável no futuro. Um achado importante é que survivin não foi influenciado pelos fatores de confusão como a inflamação e exibiu um número relativamente baixo de falsos positivos. Portanto, apesar da baixa sensibilidade, a survivina pode ainda ser considerado como um componente de um painel MultiMarker

citação:. Johnen G, K Gawrych, Bontrup H, Pesch B, D Taeger, Banek S, et al. (2012) Desempenho de mRNA de Survivina como um biomarcador para o cancro de bexiga na Prospective Study UroScreen. PLoS ONE 7 (4): e35363. doi: 10.1371 /journal.pone.0035363

editor: Olga Y. Gorlova, da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de janeiro de 2012; Aceito: 14 de março de 2012; Publicação: 16 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Johnen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

financiamento:. Fujirebio Diagnostics , Inc. (IDE; Malvern, PA; https://www.fdi.com) forneceu reagentes survivinas sem custos. Parte do estudo foi apoiado por uma bolsa (FB093 para AS) do Seguro alemã social Acidentes (DGUV; Sankt Augustin, Alemanha; https://www.dguv.de), pela Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; http: //www.abbottmolecular.com) que forneceu kits UroVysion e Matritech /Alere GmbH (Köln, Alemanha; https://www.alere.com) que forneceu kits NMP22 ELISA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: O autor é GL um funcionário da Currenta GmbH Co. OHG. Fe e Mn são funcionários da BASF SE. AS receberam kits de ensaio grátis de Abbott Laboratories e Matritech /Alere GmbH. AS também receberam bolsas de viagem de Matritech /Alere. GJ recebeu reagentes de ensaio livre de Fujirebio Diagnostics, Inc. Este não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre dados e materiais de compartilhamento. Os autores declaram não haver outros interesses concorrentes.

Introdução

O câncer de bexiga é um dos principais tipos de câncer em os EUA e na Europa. Na Alemanha, a incidência é de cerca de 29.000 casos por ano [1]. Devido à alta taxa de recorrência do tumor, perto monitoramento e uso repetido de terapias são necessárias. Como consequência, o cancro da bexiga é a doença de câncer mais caro [2]. Os tumores da bexiga urinária pode ser provocada pela exposição ocupacional a aminas aromáticas, mas o tabaco de fumar é considerado ser o maior contribuinte para o desenvolvimento destas doenças malignas [3].

A disponibilidade de tratamentos eficazes, o acesso ao órgão-alvo através da urina, ea relativamente boa sobrevida global faz com que o câncer de bexiga um candidato para programas de triagem em populações de alto risco [4]. Infelizmente, cistoscopia, que é o atual padrão ouro para detecção de cancro da bexiga, é um método invasivo e bastante doloroso. Em alguns países custos elevados podem também desempenhar um papel importante [4]. Estes fatos impede cistoscopia de ser usado na triagem de coortes. Em contraste, marcadores tumorais urinárias são ferramentas não-invasivas para detectar câncer de bexiga. marcadores típicos são proteínas, DNA, RNA, metabolitos ou características celulares, que têm a vantagem de que eles podem ser determinados em amostras de urina [5], [6]. Dos numerosos marcadores conhecidos, no entanto, apenas alguns foram testados em estudos ou estudos prospectivos e foram bem sucedidos a ser aprovado pela FDA. Consequentemente, mais estudos longitudinais são necessários para comprovar o valor desses marcadores para o rastreio do cancro e clínica de tomada de decisão [7].

Survivin é relativamente pequena proteína de 16,4 kDa codificada pelo gene

BIRC5

[8], [9]. Sua estrutura tridimensional foi resolvido e sugeriu uma função de adaptador ou de acoplamento [10], [11]. A ligação a uma série de outras macromoléculas foi de facto demonstrado survivina e emergiu como um nó central em várias redes celulares [9], [12] – [14]. Enquanto survivina pertence ao inibidor de apoptose família de genes (IAP) suas funções não são restritas a um papel regulador na apoptose. Outras funções são o controlo da divisão celular e segregação de cromossomas, a promoção da proliferação, resposta ao stress e a angiogénese, e que desempenha um papel na metástase [9], [15] – [19]. Desregulação da survivina, portanto, afeta quatro dos seis chamados “imagem de marca do câncer ‘no modelo de desenvolvimento de neoplasias descrito por Hanahan e Weinberg, sugerindo uma função central da survivina na carcinogênese e progressão do tumor [20].

os múltiplos papéis mecanicistas de survivin também se refletem na sua ocorrência generalizada em todas as etapas do desenvolvimento do tumor, embora com preferência para fases posteriores em vários tipos de câncer [21] – [25]. Survivina é sobre-expresso na maioria dos cancros humanos, mas raramente detectável em tecidos adultos saudáveis ​​[8], [26]. Ele tem, portanto, sido proposto como um potencial marcador de tumores e alvo para terapia de [8], [27]. Devido ao facto de que a detecção não invasiva em amostras de urina é possível, a survivina pode ser utilizado especificamente para o rastreio de tumores urogenitais. Vários estudos, a maioria de delineamento transversal e com um número relativamente limitado de casos, demonstraram que survivin é um candidato promissor para posterior validação em estudos longitudinais [28] – [34]. Shariat

et al.

Realizado um estudo prospectivo maior no cancro da bexiga recorrente que foi baseado na coloração imuno-histoquímica de amostras tumorais. Aqui, survivin melhorou a previsão de recorrência e sobrevivência em um subgrupo de pacientes [21]

No presente estudo, determinou-se survivina na coorte de rastreio prospectivo UroScreen [35] – [37]. Utilizando um mRNA- ensaio baseado a fim de validar a sua função como um marcador tumoral para detecção precoce de câncer de bexiga.

resultados

os participantes da coorte UroScreen eram trabalhadores químicos ativos ou aposentados com o ex-exposição a aminas aromáticas tal como descrito anteriormente [35] – [37]. Eles foram examinados entre setembro de 2003 e junho de 2010. As amostras de urina foram coletadas para o status de urina, citologia, a determinação da NMP22®, aberrações cromossómicas (UroVysion ™), e – se material suficiente estava disponível – para survivin [36], [37] . Para medições de survivina 5,716 amostras de urina pode ser obtida a partir de 1.540 participantes (Tabelas 1 e 2). A idade mediana da coorte foi de 62 anos (intervalo 27-90 anos). Das 1.540 pessoas, 18 desenvolveram tumores, incluindo uma pessoa que desenvolveu dois tumores durante o estudo, resultando em 19 tumores no total para a investigação de survivina. Por mais dois casos sem amostra de urina adequada estava disponível para a determinação de survivina. Dos 19 tumores, três eram papilomas, de alto grau de onze, e cinco tumores de baixo grau (Tabela 3). Citologia detectado oito tumores. O ensaio de survivina detectados quatro tumores, todos os quais foram de grau elevado. Três delas foram também detectadas por citologia e outros marcadores; um foi detectado por survivina e NMP22 única (Figura 1).

Um total de 19 tumores foram detectados em 18 casos. Survivina, citologia, NMP22, e UroVysion detectado 13 dos tumores. * Para dois tumores adicionais (número 1 e 12) nenhuma amostra foi disponíveis para a determinação de survivina.

A survivina marcador tumoral foi determinada por um ensaio baseado em mRNA que não estava disponível comercialmente. Durante os sete anos deste estudo longitudinal, acontecimentos imprevistos em relação à confiabilidade e disponibilidade de componentes do ensaio (kits de isolamento de RNA Qiagen e Invitek, reagentes survivinas de IED e IPA) nos levou a modificar o desenho do ensaio duas vezes, levando a três variantes de ensaio diferentes (Qiagen /IDE, Invitek /IDE, Invitek /IPA). Padronizamos copiar o survivin números e poderia demonstrar, por meio de um modelo multivariada generalizada equação estimativa (GEE) que as variantes de ensaio não confundir os resultados do teste ao implementar os números de cópias survivin padronizados (Tabela 4). Todos os outros resultados foram, por conseguinte, derivam dos valores normalizados.

preditores potencial de um resultado positivo survivina foram explorados como mostrado na Tabela 4. Os indicadores de infecção e de inflamação (leucócitos), hematúria, ou factores como idade, tabagismo, ou câncer de bexiga anterior não apresentou um efeito significativo sobre os níveis de survivina. A “concentração” (densidade específica) da amostra de urina, que se reflecte na concentração de creatinina urinária, tendeu para uma correlação inversa com survivin, mas essa influência não foi significativa. Como esperado, o cancro da bexiga observado durante UroScreen foi um preditor de testes survivinas positivos (OR 2,54, IC 95% 1,02-6,33). β-actina (ou 3,11, IC de 95% 2,51-3,85) foi um efeito modificador, indicando uma forte influência da quantidade e qualidade do ARNm recuperado sobre o desempenho de PCR. Um aumento de dez vezes no número de cópias de β-actina foi associada com um três vezes maior probabilidade de um teste positivo de survivina. Testamos se β-actina foi correlacionada com a densidade urinária por cálculo do coeficiente de correlação de Spearman. Houve uma associação significativa, mas um fraco nível do número de cópias beta-actina com creatinina urinária como um proxy da densidade urinária (r

s CI 0,17, 95% ,12-,23).

Os valores câncer preditivo para survivina estão listados na Tabela 5. os cálculos basearam-se nos resultados do teste obtidos em amostras de urina a partir da última sessão rodada antes do diagnóstico. Survivina atingiu uma sensibilidade de 21,1% para todas as entidades tumorais, 25,0% de todos os tumores, mas sem papilomas, e 36,4% para apenas tumores de grau elevado. Não se detectou qualquer um dos cinco tumores de baixo grau. A especificidade foi de 97,5% em todos os grupos (sub) (todos os tumores, tumores sem papilomas, de alta qualidade, e tumores de baixo grau). O valor preditivo positivo (VPP) alcançou 9,5% em todos os grupos, enquanto o valor preditivo negativo (VPN) variou entre 99,0 e 99,7%.

receiver operating characteristic (ROC) foram realizadas com survivin padronizado níveis, desde o último rastreamento rodada antes do diagnóstico e ajustados para log

10 (β-actina) e idade em aulas de 10 anos. Eles resultou na área sob a curva (AUC) de 0,74 (IC de 95% 0,61-0,86) para todas as entidades de tumor (Figura 2), 0,75 (IC de 95% 0,60-0,89) para todos os tumores, sem papilomas, CI 0,80 (95% 0,66 -0,94) para os tumores de alto grau, e 0,66 (95% CI 0,36-0,96) apenas para tumores de baixo grau. Para julgar o desempenho das variantes de ensaio, calculou-se curvas ROC ajustados para cada variante. As AUC resultantes foram de 0,70 (IC 95 0,34-1,00%) para Qiagen /IDE, 0,80 (IC 95% 0,54-1,00) para Invitek /IDE, e 0,79 (IC 95% 0,67-0,91) para a variante de ensaio Invitek /IPA.

a análise foi realizada para todas as entidades tumores. A área resultante sob a curva (AUC) foi de 0,74 com um IC 95% (intervalo de confiança) de 0,61-0,86.

As possíveis razões para os resultados dos testes negativos em casos estão compilados na Tabela 6. As últimas amostras dos casos 5 e 10 foram obtidos 26 e 18 meses antes do diagnóstico do tumor, respectivamente. Caso 8 mostrou um resultado positivo do teste de 14 meses antes do diagnóstico, mas a amostra no momento do diagnóstico foi negativo. Todos os outros resultados falso-negativos foram em casos de papilomas e tumores de baixo grau; 31% foram associadas com uma baixa densidade da urina recolhida indicado por baixo da creatinina ( 0,50 g /l), e outros 20% foram igualmente associadas com baixa integridade de ARN, tal como indicado pelos níveis de p-actina 2.500 cópias. Em comparação, 15% e 11% de todas as amostras verdadeiras negativo na última rodada de triagem foram associados com baixa de creatinina e de baixo β-actina, respectivamente.

Discussão

Enquanto numerosos potenciais marcadores têm sido descritos para a detecção precoce de câncer de bexiga, nenhum até agora têm sido implementadas em diretrizes clínicas para o rastreio ou acompanhamento clínico sobre a reincidência. Idealmente, os ensaios de marcador adequado para a prática clínica deve ser robusta e barata, assim como rápido e num formato fácil de usar, por exemplo, um teste de ponto-de-cuidados [38]. No entanto, antes de o formato de ensaio pode ser optimizado, o desempenho do marcador em si tem de ser avaliada. Para marcadores moleculares como survivina o desenvolvimento de ensaios estáveis ​​e simples pode ser promissor, se o seu desempenho com os ensaios disponíveis atualmente no rastreio do cancro da bexiga tem sido demonstrado ser comparável com ou melhor do que os testes aprovados. Em UroScreen, determinou-se survivina com um ensaio relativamente complexa, em que os resultados dos testes positivos não foram acompanhados com cistoscopia. Em geral, a survivina foi detectada em especial no cancro da bexiga de alto grau e o seu desempenho era comparável à dos outros marcadores testados. No entanto, mRNA integridade foi um modificador importante de resultados positivos, e, portanto, um teste mais robusto deve ser desenvolvido.

Para provar o valor de novos marcadores para a tomada de decisão clínica, seu desempenho tem de ser avaliado em longitudinal estudos e ensaios clínicos [7]. UroScreen foi um estudo prospectivo de coorte com mais de 1.500 trabalhadores da indústria química destinadas para avaliar NMP22, UroVysion e survivina como marcadores tumorais [36], [37]. Foi o primeiro estudo prospectivo que investigou o desempenho de survivin na detecção precoce do câncer de bexiga. Para 19 dos tumores de bexiga que foram detectados durante a realização do material de amostra suficiente estudo foi deixado para a determinação de survivina. A baixa incidência de cancro da bexiga em UroScreen assim como na população em geral é uma questão crítica para o rastreio [4] o cancro da bexiga. UroScreen foi estabelecida como uma extensão de um programa de vigilância já estabelecida no trabalhadores da indústria química [35]. Os cálculos de energia iniciais foram baseadas em antigos dados mostrando naquela época a incidência de tumores maior na população do estudo [39]. Atualmente, a incidência neste grupo de alto risco original tenha alcançado um nível mais próximo ao da população em geral devido à proibição de aminas aromáticas cancerígenas de uso nas décadas indústria química atrás. Além disso, é provável que o progresso tecnológico e medidas para melhorar a segurança no trabalho contribuiu para diminuir a incidência do cancro de bexiga nesta coorte de trabalhadores de duas grandes empresas químicas. Além disso, a idade média da coorte UroScreen em 2010 foi de 62 anos, enquanto a idade média para o câncer de bexiga por homens na Alemanha era 72 anos [1].

Tem sido demonstrado antes que a expressão survivin é maior e mais freqüente em tumores de alto grau ou fases posteriores do desenvolvimento de câncer [21], [23] – [25]. De acordo com esta observação, survivin não detectou casos com papiloma ou câncer de bexiga de baixo grau em UroScreen, ao passo que a sensibilidade era melhor para tumores de alto grau. Se isso pudesse ser confirmada, survivina pode ser um complemento útil para o acompanhamento de pacientes com tumores de crescimento mais rápido do que a detecção deve ser tão cedo quanto possível. Aqui, um painel de marcadores não-invasivo seria uma abordagem promissora para detectar recorrência mais cedo e reduzir o número de cistoscopias [40]. No entanto, marcadores moleculares individuais estão actualmente a falta de sensibilidade suficiente para substituir cistoscopia [38].

O baixo número de casos incidentes limitaram o poder do estudo para avaliar o desempenho dos marcadores tumorais e contribuiu para os seus VPPs baixos. estudos publicados anteriormente apresentaram especificidades entre 88% e 100% e sensibilidades entre 53% e 100% [28] – [30], [32] – [34]. Enquanto os nossos resultados mostraram uma especificidade semelhante (98%) a sensibilidade (21%) era marcadamente inferior nesta coorte. Em parte, isto pode ser devido a diferentes ensaios aplicados. A principal razão para as diferenças mais provável é, no entanto, o desenho do estudo da secção transversal dos outros estudos [41]. As principais deficiências são a falta de consideração da dimensão tempo, a fim de calcular os valores preditivos e um potencial viés de seleção porque os casos e controles foram recrutados em diferentes populações. O projeto longitudinal e, portanto, potencial do estudo UroScreen evita esse viés. Ele também representa uma configuração que está mais perto de prática clínica.

Observamos várias razões que podem ser responsáveis ​​para o fato de que os casos não foram detectados em nosso estudo de coorte. A falta de cumprimento em um estudo de despistagem voluntária é um típico problema que influencia a detecção precoce dos casos. Para a maioria dos participantes do estudo, as amostras não estavam disponíveis para cada ano consecutivo. Em vários casos, a diferença entre a colheita da amostra e o diagnóstico de tumor foi superior a doze meses, num caso de 26 meses. Pode-se esperar que um aumento dos níveis de marcadores é menos provável que com um intervalo de tempo crescente entre recolha e diagnóstico amostra. Outro problema foi que os participantes frequentemente anulado urina pouco antes que chegou para um compromisso e, portanto, a urina coletada no local era insuficiente em qualidade e /ou quantidade para alguns dos testes de marcador. Este tipo de urina foi tipicamente associado à baixa de creatinina, um baixo número de células sedimentadas e baixo β-actina.

Em termos de confusão, survivin foi menos influenciada do que NMP22 e UroVysion por status urina [36], [37]. De acordo com o GEE modelo, creatinina e leucócitos não influenciaram os resultados do teste para survivina. Tal como infecções da bexiga são frequentemente observadas em idosos, é importante que os processos inflamatórios não influenciam um teste de tumor. Esta é uma vantagem do ensaio de survivina, em especial, sobre NMP22, que é conhecido por ser frequentemente falsos positivos quando os participantes sofrer de infecções. Foi reflectida na menor número de resultados falso-positivos do ensaio de survivina em comparação com o ensaio de NMP22 [37]. Apesar da sensibilidade limitada a especificidade relativamente elevada pode permitir que a survivina ser adicionados a um painel de marcadores. É importante notar que os testes positivos survivinas não resultou em uma recomendação para cistoscopia. Como resultado, existe uma possibilidade de que alguns tumores poderia ter permanecido sem ser detectado e que subestimado o desempenho de survivina. Isso prejudica a comparação com o desempenho dos testes aprovados pela FDA, isto é, NMP22 e UroVysion. O ensaio de survivina foi positiva para um caso (4b) que não foi detectado por citologia ou UroVysion. Survivina também foi positiva para o caso do número 8, o qual não foi detectado por os ensaios baseados em células de 14 meses antes do diagnóstico. Ambos os casos foram adicionalmente testados positivamente pela NMP22. No entanto, mais casos seria necessário para provar o ponto que os marcadores com base em expressão como survivin pode complementar a ensaios UroVysion e citologia à base de células.

Uma questão específica com a quantificação da survivina foi a dificuldade para manter a qualidade de um ensaio experimental, ainda ao longo de um período de vários anos. Isso pode ser um problema específico do projeto de estudos prospectivos de coorte, em comparação com estudos transversais. Problemas devido às mudanças do kit de isolamento de RNA originais e a interrupção da produção de reagentes de ensaio pelo fornecedor inicial resultou em três variantes de ensaio que levaram a diferentes valores de corte para positividade survivina. As descontinuidades impediu a determinação de um corte global otimizado para o conjunto de dados completo. Normalizamos os números de cópias e implementado o ensaio para o modelo de GEE como potencial fator de confusão, a fim de testar se a confusão residual poderia ser encontrado com os dados survivinas padronizados. O ensaio não influenciou os resultados dos ensaios, β-actina acabou por ser um modificador significativa dos resultados do teste. Parece possível que a especificidade de survivina foi reduzido se mais das amostras de urina foram maiores concentrada. No entanto, a concentração de β-actina não era simplesmente uma função de densidade de urina devido a correlação com a creatinina era fraca, o que indica que outros factores, como a integridade do mRNA pode ter contribuído para o desempenho de β-actina nas reacções de PCR.

Além destes factores metodológicos imprevistas que influenciaram o ensaio, o formato de ARNm amplamente utilizado para detectar survivina também contribuiu para o desempenho global do ensaio. A integridade de ARN avaliada por cópias de β-actina foi avaliada como a mais forte influência sobre os resultados do teste. A lógica por trás da utilização de um ensaio baseado em ARNm de survivina foi para ser capaz de detectar os sinais, mesmo fracas de survivina que estão presentes em pequeno número de células uroteliais esfoliadas. PCR e de RT-PCR são métodos elegantes e bem estabelecidas para amplificar e quantificar muito pequenas quantidades de ácidos nucleicos. No entanto, a baixa estabilidade de ARNm em geral, mesmo com a adição de inibidores de RNase, limita a aplicabilidade de tais ensaios para as amostras recolhidas fora das condições controladas de um ambiente de laboratório. Há melhores inibidores RNase disponíveis hoje em dia que até mesmo dispensar a necessidade de amostra de congelamento [42]. Mas a adição destes conservantes para a amostra tem de ser imediata. Uma maneira possível para evitar atrasos seria um tubo de recolha especial, semelhantes aos utilizados para a recolha de sangue, que já contém o conservante. Outro problema inerente ao ensaio de survivina que foi usado o não-linearidade provocada pelos dois passos de amplificação à base de PCR que limitaram a precisão da quantificação e estratégias para a normalização. Mesmo aplicando β-actina, que serviu como um controlo interno, para a correcção não era sempre suficiente para compensar as grandes variações no teor de mRNA nas amostras, provavelmente devido ao passo de pré-amplificação adicionais do ensaio de survivina. Por essa razão, para ambientes clínicos sob condições reais, as moléculas mais estáveis ​​como as proteínas podem ser alvos melhores. Enquanto uma amplificação por PCR como de proteínas não é possível, ensaios baseados em ELISA podem atingir muito bons sensibilidades e estão agora disponíveis para survivina em melhor qualidade do que no início do estudo UroScreen.

Até à data, é UroScreen o maior estudo prospectivo para avaliar survivin para a detecção precoce do cancro da bexiga em uma coorte de participantes assintomáticos. Apesar do baixo número de casos incidentes, informações valiosas tenha sido adquirida no desempenho do ensaio à base de mRNA da survivina, desafios técnicos, a influência de fatores de confusão, e os valores preditivos de câncer. Um ensaio mais robusto beneficiariam grandemente o marcador e a sua utilização na prática clínica. Survivina podem ter o potencial para melhorar a detecção, especialmente de tumores de grau elevado; a sua sensibilidade, no entanto, baseia-se em apenas quatro tumores (de 19) que foram detectados com três variantes de ensaio diferentes. A alta especificidade implica que survivin pode ser considerado para servir como parte de um painel MultiMarker para complementar outros marcadores, mas mais uma validação em um estudo prospectivo com mais casos se justifica. Testando survivina dentro de uma coorte de pacientes com alto risco de tumores recorrentes seria uma abordagem promissora.

Materiais e Métodos

População do estudo e diagnóstico de tumores

Os participantes foram recrutados do (Organisationsdienst für nachgehende Untersuchungen) coorte ODIN no quadro de um programa de vigilância do seguro obrigatório de acidentes da indústria química, que oferece exames anuais de trabalhadores ativos e aposentados que tenham sido expostos a aminas aromáticas. De setembro de 2003 a junho de 2010 1.609 trabalhadores do sexo masculino em dois locais grandes químicos na Alemanha (subcoorte A: BASF, Ludwigshafen; subcoorte B: Bayer, em Leverkusen) participaram do estudo UroScreen. 1.540 daqueles forneceu material de amostra suficiente para medições survivinas. Foi aplicado um questionário para documentar tabagismo e doenças relevantes. Todos os participantes assinaram termo de consentimento. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Tübingen (No. 1 /2003V).

Como os outros testes de tumor (citologia, NMP22®, UroVysion ™) aplicados em UroScreen foram aprovados em contraste com survivin , que tinha prioridade mais baixa quando o material da amostra foi limitada. Por conseguinte, apenas 5716 amostras de urina dos 7091 estavam disponíveis para as medições de survivina. Características da coorte estão resumidos nas Tabelas 1-2 e estão descritos em mais pormenor noutro local (Pesch et ai., Apresentado e [37]). os resultados dos testes positivos para citologia, NMP22® ou UroVysion ™ resultou em uma recomendação para um exame cystoscopic, enquanto resultados positivos para o ensaio não aprovada survivina não

.

Em novembro de 2011, 21 tumores em 20 pessoas foram detectados por cistoscopia e confirmado pela patologia de referência. Para 18 dos casos (19 tumores) amostras de urina estavam disponíveis para a determinação de survivina. Um caso teve dois tumores (4a e 4b na Tabela 3). Os achados histopatológicos de todos os 21 tumores e parâmetros das amostras de urina correspondentes (última sessão rodada antes do diagnóstico de um tumor) estão representados na Tabela 3 e na [37].

coleta de urina

As amostras de urina foram coletadas no local, as fábricas de produtos químicos em Ludwigshafen e Leverkusen. Para a determinação de survivina, amostras de 40-50 ml espontaneamente anulado urina foram centrifugados num rotor de balde oscilante em 500 × g durante 10 minutos a 10 ° C. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e os sedimentos celulares foram misturadas com 500 ul de solução de lise R (Invitek, Berlim, Alemanha), que contém os inibidores de RNase. Finalmente, a amostra de células foi congelada a -20 ° C e enviadas para o laboratório em Bochum onde foram armazenados até que o isolamento de ARN. Manipulação de amostras para determinação da condição de urina e outros marcadores é descrito abaixo.

status de urina e avaliação de hematúria

Em todas as amostras o status de urina foi determinada na urina fresca (antes da centrifugação), como descrito anteriormente [36]. creatinina urinária foi determinada com o teste do CREA Plus® (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Os eritrócitos, a hemoglobina (HB), leucócitos, albumina e outros parâmetros foram determinadas com 10 tiras Combur Test® (Roche). Além disso, os eritrócitos e os leucócitos também foram determinadas semi-quantitativamente em sedimento urinário. As determinações de creatinina estavam disponíveis para subcoorte A apenas (4806 amostras). Para 4546 amostras dos mesmos, informações completas sobre todos os parâmetros (eritrócitos, leucócitos, etc.) estava disponível.

NMP22®, UroVysion ™ e citologia

proteína de matriz nuclear 22 (NMP22) foi determinada quantitativamente com o kit de ELISA NMP22® (Matritech /Alere GmbH, Colónia, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. O valor de corte para os resultados positivos foi ajustado para 10 unidades /mL. instabilidade cromossômica em células uroteliais sedimentados foi avaliada usando o UroVysion ™ cancro de bexiga Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). O teste foi considerado positivo se pelo menos quatro núcleos tinham três sinais de dois ou três cromossomas (3, 7, e 17), ou pelo menos 12 núcleos apresentaram um sinal para o locus de 9p21. citologia urinária foi realizada como descrito anteriormente [36], [43].

ensaios

Isolamento de ARN e survivina

Quantificação de survivina foi baseado em PCR em tempo real com ARNm isolado a partir de células esfoliadas em uroteliais urina. Para a determinação de survivina foram empregues três variantes do ensaio baseado em ARNm. As variações foram uma consequência de mudanças por parte dos fabricantes do kit de isolamento de RNA e os reagentes de RT-PCR, respectivamente. Inicialmente, o protocolo e os reagentes para o ensaio de survivina foram fornecidos por Fujirebio Diagnostics, Inc. (IED, Malvern, PA). O protocolo IED recomendado o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) para isolamento de ARN. Este kit, no entanto, não está optimizado para a muito pequena quantidade de ARN que é geralmente recuperado do baixo número de células obtidas 40-50 ml de urina, conduzindo a rendimentos baixos na maior parte. Uma pequena mudança em um dos componentes do kit em 2005 levou a uma queda adicional no rendimento de ARN. Por esse motivo, ele foi substituído por um kit de isolamento alternativo (InviTrap® rotação celular RNA Mini Kit) que produziu melhores e mais consistentes rendimentos.

Em 2007, o IED interrompido a produção de reagentes para a PCR em Tempo Real ensaio. Isto levou outra mudança no procedimento de ensaio em 2008. Porque nenhuma outra fonte estava disponível, tivemos que projetar e produzir alguns dos componentes de ensaio a nós mesmos (a seguir chamado “ensaio IPA”). Pequenas diferenças nos iniciadores e sondas do ensaio de PCR em tempo real de forma consistente levou a números de cópias mais elevados de survivina em comparação com o ensaio de IED originais. As três variantes de ensaio são os seguintes:

Variante 1 (Qiagen kit de ensaio /IED)

Esta variante foi utilizado a partir de setembro de 2003 até outubro de 2005. isolamento do RNA foi realizada com RNeasy Mini Kit (Qiagen ) de acordo com o protocolo do fabricante. A transcrição reversa do mRNA, a pré-amplificação e quantitativa PCR em tempo real foram efectuadas como descrito por Kenney et ai., excepto que os volumes de reacção de cada passo foram cortadas ao meio para 25 ul de [33]. Primers, reagentes e controles positivos foram fornecidos pela FDI sem nenhum custo. Em contraste com o ensaio de publicada, em vez de um sistema de detecção de sequência ABI Prism foi utilizado um sistema LightCycler II (Roche). Para ser capaz de usar os capilares do sistema LightCycler foi necessário adicionar albumina de soro de bovino (BSA, Applichem, Darmstadt, Alemanha) para a reacção TaqMan, com uma concentração final de 0,16 ug /uL.