Abstract
Fundo
A morte celular programada 4 (PDCD4), originalmente identificado como a transformação neoplásica inibidor, foi atenuada em vários tipos de câncer. Nosso estudo anterior demonstrou uma regulação contínua de expressão PDCD4 na sequência de amostras de tecido ovariano normal limítrofe-malignas e uma correlação significativa de expressão PDCD4 com sobrevida livre de doença. O objetivo do estudo foi investigar a função e modulação da PDCD4 em células de cancro do ovário.
PRINCIPAIS CONCLUSÕES
Nós demonstramos que a proliferação de células significativamente inibido ectópica expressão PDCD4 através da indução de parada do ciclo celular no G
1 palco e up-regulação dos inibidores do ciclo celular de p27 e p21. A migração celular e invasão também foram inibidas por PDCD4. PDCD4 sobre-expressando células exibiram elevada fosfatase e homólogo tensina (PTEN) e inibiu a proteína quinase B (P-Akt). Além disso, a expressão de PDCD4 foi regulado para cima e foi exportada para o citoplasma sobre o tratamento de privação de soro, mas foi rapidamente esgotada através de degradação proteossómica no nível sérico de re-administração. O tratamento de um inibidor de fosfoinositido 3-cinase (PI3K) impediu a degradação de PDCD4, indicando o envolvimento da via PI3K-Akt na modulação da PDCD4.
Conclusão
PDCD4 pode desempenhar uma função crítica na detenção de progressão do ciclo celular no ponto de controlo chave, inibindo assim a proliferação de células, assim como suprimir a metástase tumoral. A via PI3K-Akt estava implícito de estar envolvido na regulação da degradação PDCD4 em células de cancro do ovário. Em resposta à condição de estresse, endógena PDCD4 foi capaz de transporte entre compartimentos celulares para desempenhar as funções desviadas
Citation:. Wei N, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) Função tumor supressora e modulação da morte celular programada 4 (PDCD4) no cancro do ovário. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10.1371 /journal.pone.0030311
editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido
Recebido: 12 de maio de 2011; Aceite: 13 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de janeiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Wei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa interna da Universidade de Programa de Financiamento Hong Kong Semente de Pesquisa básica [a KKLC], e por uma doação da Wong Verifique Ela Charitable Foundation [para HYSN]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
PDCD4 foi originalmente identificado como o inibidor da transformação neoplásicas no modelo da linha celular da epiderme do rato JB6 [1]. PDCD4 ratinhos transgénicos apresentaram menor incidência de tumores e frequência de conversão do papiloma-to-carcinoma [2]. relatórios posteriores têm implicado papel inibitório da PDCD4 na tradução da proteína através da inibição da eucariótica fator de iniciação 4A (elF4A) helicase, bem como interferindo com a associação de elF4A com eIF4G, resultando na falha de formação de complexo de iniciação da tradução [3], [4 ], [5]. Desde então, foram realizados vários estudos para investigar o papel do PDCD4 durante a tumorigénese. PDCD4 verificou-se ser capaz de regular a transcrição. A sobre-expressão de PDCD4 resultou na proliferação de células carcinóide suprimida através de reprimir a transcrição da quinase de promoção da mitose fator dependente de ciclina (CDK) 1 /cdc2 via a regulação de p21
WAF1 /Cip1 [6], [7]. PDCD4 inibiu a invasão de células do cancro do cólon por meio de supressão da proteína activada por mitogénio quinase-quinase-quinase-quinase 1 (MAP4K1), que conduz a transcrição AP-1 dependente suprimida [8]. O papel de PDCD4 na apoptose celular também tem sido investigada em estudos diferentes. PDCD4 foi sugerida para ser uma molécula pró-apoptóticas envolvidas em factor de crescimento transformante beta-1 (TGF-beta 1) induziu apoptose em carcinoma hepatocelular (HCC) [9]. PDCD4 expressão diminuída desregulada a resposta normal de DNA-danos, evitando assim que as células com DNA danificado de sofrer apoptose [10].
Apesar de as propriedades supressoras de tumores acima mencionados, o papel de PDCD4 em progressão tumoral tem sido sugerida como sendo tipo específico de célula [11]. A sobre-expressão de PDCD4 não teve qualquer efeito em qualquer proliferação ou apoptose em células HEK293 [12], bem como em células de cancro do cólon RKO [8]. Estudos anteriores relataram a expressão PDCD4 empobrecido em cancro, em comparação com os tecidos normais [13], [14], [15], e PDCD4 foi alvo de degradação durante a promoção de tumor [16], no entanto, os mecanismos de modulação da PDCD4 não estava claro ainda.
as investigações sobre o papel da PDCD4 na carcinogênese do câncer de ovário foram bastante limitado. De acordo com as nossas descobertas anteriores, a perda de expressão PDCD4 foi encontrado nas amostras de tecido do ovário de fronteira e malignas, e associado com uma doença resultado adverso [17]. Para investigar o papel da PDCD4 no cancro do ovário, no presente estudo, nós examinamos as funções potenciais supressores de tumor de PDCD4 em células de cancro do ovário, eo mecanismo plausível que regula PDCD4.
Resultados
PDCD4 inibiu a proliferação de células de cancro do ovário e do ciclo celular progressão
Para investigar a função de PDCD4 no cancro do ovário, dois PDCD4 sobre-expressar clones estáveis 433-PDCD4c1 e 433-PDCD4c2, foram estabelecidos em OVCA433 de células de cancro do ovário. Um PDCD4 sobre-expressar clone estável SKOV3-PDCD4, foi criada em células de cancro do ovário SKOV3 (Figura 1A). O estabelecimento de PDCD4 sobre-expressar clones estáveis foi indicada pela banda adicional em comparação com as células parentais. pEGFP sobre-expressão de clones estáveis (433-VE e SKOV3-EV) também foram estabelecidos como o controlo do vector vazio e utilizado nas experiências seguintes. A quantificação das bandas de transferência de Western foi apresentado em dados S1.
(A) PDCD4 sobre-expressar clones estáveis 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2 e SKOV3-PDCD4, foram estabelecidos em células de cancro do ovário OVCA433 e SKOV3 . 433-EV e SKOV3-EV: GFP sobre-expressar clones estáveis vetor vazios para controle. (B) 433 PDCD4c1 e 433 PDCD4c2 exibiu taxa de proliferação mais lento significativo em comparação com o controlo (* p 0,01 e ** P 0,05, respectivamente) de acordo com XTT (painel da esquerda) e ensaio clonogénico (p 0,05) (painel da direita). (C) PDCD4 induzida paragem do ciclo celular na fase G1. Os dados representativos são a partir de uma das três experiências independentes. As percentagens de células que estavam em fase G1 para OVCA433 C1 e C2 foram de 84,6% (± 2,1%) e 80,9% (± 2,2%), respectivamente. Ambos eram significativamente mais elevados em comparação com o controlo (69,9% ± 3,1%) (p = 0,004 e P = 0,01, respectivamente). A percentagem de células que estavam em fase G1 para SKOV3-PDCD4 foi de 66,7% (± 1,8%), que foi significativamente maior em comparação com o controlo (37,5% ± 2%) (p = 0,008). (D) PDCD4 sobre-expressar clones estáveis, bem como clones estáveis de vector vazio de controlo foram mantidas em MEM com FBS a 10%, e, em seguida, colhidas para extracção de proteína. expressão de proteínas de um painel de reguladores do ciclo celular, incluindo p53, p21, p27, Cdc25A, cyclinA e ciclina foram analisados. A intensidade da banda foi determinada por varrimento de densitometria. A quantificação das bandas foi apresentada em dados S1. GAPDH foi incluída como controlo de carga interna. Três experimentos independentes foram realizadas.
A proliferação celular foi avaliada por XTT e ensaio clonogênica. De acordo com os resultados XTT, tanto uma das duas células OVCA433-PDCD4 exibiram significativamente mais lenta taxa de proliferação em comparação com o controlo (p 0,05 para OVCA433-PDCD4c1 e p 0,01 para OVCA433-PDCD4c2, respectivamente, Figura 1B, para a esquerda do painel). ensaio clonogénico também indicado resultados semelhantes: o número de colónias formadas por OVCA433-PDCD4c1 e C2 foram de 33% e 58% menor em comparação com o controlo (GFP apenas um controlo de vector vazio), respectivamente (p 0,05, Figura 1B, painel da direita).
para explorar os mecanismos subjacentes aos efeitos inibitórios da PDCD4 sobre a proliferação celular do cancro do ovário, avaliou-se o efeito de PDCD4 sobre a progressão do ciclo celular utilizando a análise de citometria de fluxo. Em OVCA433 controlo, da percentagem de células em fase G1 foi de 69,9% (± 3,1%). Comparativamente, a percentagem de células em fase G1 eram de 84,6% (± 2,1%) e 80,9% (± 2,2%) para OVCA433-PDCD4c1 e C2, respectivamente, ambas as quais eram significativamente mais elevados do que o controlo (p = 0,004 e P = 0,01, respectivamente). Houve um correspondente decréscimo da percentagem de células na fase S na OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) e C2 (15,7% ± 2%)), em comparação com o controlo (25,9% ± 2,1%, Figura 1C).
sobre-expressão de PDCD4 em SKOV3 também afectou a sua progressão do ciclo celular. Nas células SKOV3 de controlo, da percentagem de células em fase G1 foi de 37,5% (± 2%). Comparativamente, em células SKOV3-PDCD4, a percentagem de células em fase G1 foi de 66,7% (± 1,8%), que foi significativamente mais elevado do que o controlo (p = 0,008). Houve um correspondente decréscimo da percentagem de células na fase S em células SKOV3-PDCD4 (20,9% ± 2,5%) em comparação com o controlo (46,2% ± 1,9%).
A análise de citometria de fluxo indicou que mais -expression da paragem do ciclo celular induzida PDCD4 principalmente na fase G1; 1,2 (p = 0,01) e 1,8 (p 0,01) vezes aumento na percentagem de células em fase G1 em OVCA433-PDCD4 e SKOV3-PDCD4 células de cancro do ovário, respectivamente (P = 0,01).
Para identificar potenciais moléculas envolvidas nos efeitos inibidores acima de PDCD4 na progressão do ciclo celular, foram avaliadas as expressões de vários reguladores do ciclo celular, incluindo p21, p27, p53, cyclinA, ciclina, Cdc25A. Em OVCA433-PDCD4c1 e c2, a expressão da p53 mal foi modificado e p21 foi significativamente-se regulada, enquanto que em células SKOV3-pdcd4 p53, p21 não foi detectado. expressão P27 foi-se regulada em ambas as células OVCA433-PDCD4 e SKOV-PDCD4. Além disso, observou-se um aumento de expressão Cdc25A nos dois 433 PDCD4 sobre-expressar clones estáveis, e um aumento de expressão cyclinA em 433 PDCD4 c2, mas não em c1 (Figura 1D). No entanto, apenas um ligeiro decréscimo de Cdc25A foi observado em células SKOV-PDCD4 e nível cyclinA manteve-se a mesma em ambos clone e controle de vetores estável de células SKOV3. A quantificação das bandas de transferência de Western foi apresentado em dados S1.
PDCD4 inibiu a migração de células de câncer de ovário e invasão
Para explorar os possíveis efeitos da PDCD4 sobre a migração de células de cancro do ovário, duas abordagens diferentes foram aplicado. Em primeiro lugar, o ensaio de cicatrização de feridas foi utilizado para monitorizar o tempo requerido para o fechamento da ferida, de controlo e PDCD4 que sobre-expressam as células de cancro do ovário. Antes do ensaio, as células foram pré-tratadas com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA e divisão nuclear, para assegurar o fechamento da ferida foi exclusivamente devido a migração celular mas não a proliferação celular. Os resultados mostraram que mais de PDCD4-expressando células exibiram taxa de migração mais lenta. A ferida riscado em ambas as células de controlo foi fechada em 23 horas após a introdução da ferida, enquanto que uma diferença ainda foi observada no PDCD4 sobre-expressando células (Figura 2A).
(A), quer o controlo e PDCD4 sobre-expressam as células foram tratadas com mitomicina C (10 ug /ml) durante três horas antes da introdução da ferida. Fotos foram tiradas em pontos de tempo indicados (0, 5, 8 e 23 h). PDCD4 sobre-expressar clones estáveis exibiram mais lento processo de cura da ferida em comparação com o controlo. (B) células de cancro do ovário foram deixadas migrar através da membrana microporosa durante 9 horas no ensaio de migração Transwell. O número de células que migraram através de PDCD4 sobre-expressar clones estáveis foram significativamente menos em comparação com o controlo (* p 0,01 e ** P 0,05, respectivamente). (C) células do cancro do ovário foram autorizados a invadir através da ECMatrix durante 72 horas em transpoço ensaio de invasão. Os números de células invadidas por meio de PDCD4 sobre-expressar clones estáveis foram significativamente menos em comparação com o controlo (* p 0,05). As experiências foram realizadas em triplicado.
Para avaliar quantitativamente a taxa de migração celular, transpoço ensaio de migração foi aplicado. OVCA433-PDCD4c1 e C2 mostrou 35% e 63% menos de migração, respectivamente, do que a de células de controlo (p 0,01 Figura 2B). células SKOV3-PDCD4 mostraram 22% menos do que a migração das células de controlo (p 0,05, Figura 2B)
PDCD4 também tem efeito sobre a invasão de células do cancro do ovário demonstrado por ensaio de invasão Transwell.. OVCA433-PDCD4c1 e C2 mostrou 27% e 30% menos invasão comparado com o controlo (p 0,05 Figura 2C). SKOV3-PDCD4 mostraram 19% menos invasão comparado com o controlo (p 0,05, Figura 2C).
A modulação da PDCD4
PDCD4 foi relatado como um inibidor de tradução. Como a tradução da proteína pode ser estimulada por soro e inibida quando as células foram privadas na ausência de factores de crescimento, desse modo, que examinou os efeitos de soro sobre a abundância de PDCD4. Ambos OVCA433 e SKOV3 foram deixados em jejum em meio isento de soro durante 48 horas antes de soro foi re-admitido em intervalos de tempo indicados, incluindo 1 h, 2 h, 6 h e 24 h. Em ambas as células, PDCD4 foi elevada quando fome. No entanto, após a re-administração de soro, PDCD4 diminuiu gradualmente de uma forma dependente do tempo em células SKOV3 e desapareceu rapidamente dentro de 1 h em OVCA433 (Figura 3A). A quantificação das bandas de Western blotting foi apresentada em dados S2.
(A) OVCA433 e SKOV3 foram privadas de soro (SD) durante 48 horas antes de soro foi re-administrado durante 1 h, 2 h, 6 h e 24 h. Houve um aumento drástico de expressão da proteína PDCD4 mediante tratamento privação de soro. PDCD4 desapareceu rapidamente após soro foi re-administrado. P-Akt e p-ERK foram regulados negativamente quando o soro foi retirado e gradualmente retomado após soro foi adicionado de volta. Akt total de ERK e não foram afectados durante o tratamento. (B) PDCD4 foi elevada em células privadas de soro (SD) e esgotada quando o soro foi adicionado de volta (SA, a adição de soro) durante 2 e 4 horas. A administração de qualquer inibidor de proteassoma MG132 (S + MG132), ou inibidor de PI3K LY294002 (S + LY294002) impediu a depleção de PDCD4. DMSO foi também incluída como controlo (S + DMSO). O controlo negativo (-ve) indicado para as células cultivadas com meio contendo soro. (C) A expressão de PTEN, P-Akt e ERK-P foram alteradas em todos os clones estáveis sobre-expressão PDCD4, ao passo que as expressões de Akt total e ERK manteve-se inalterada. Três experimentos independentes foram realizados. A quantificação das bandas de transferência de Western foi apresentado em dados S2.
Para explorar os potenciais caminhos envolvidos na modulação da PDCD4 no tratamento acima, as expressões de PTEN, p-Akt e p-ERK ( quinase regulada por sinal extracelular) foram examinadas. PTEN foi elevada após o soro foi removido, e houve mais nenhuma alteração depois de re-adição do soro até até 24 h. Houve uma diminuição significativa da P-Akt quando o soro foi removido em ambas as células OVCA433 e SKOV3, seguido de retomada a 6 h após a adição de soro de re-em OVCA433. Em SKOV3, a recuperação de P-Akt estava tão rápido quanto 1 h. Uma ligeira diminuição de p-ERK foi observado em ambas as células na ausência de soro, e uma redução adicional também foi observado em ambas as células quando o soro foi readmitido durante 1 h. A expressão de p-ERK foi retomada após 2 horas da administração de soro e gradualmente alcançado ao nível original de 24 h. Nenhuma mudança profunda foi observada em ambos os Akt total ou ERK (Figura 3A).
Para confirmar o potencial envolvimento de PI3K-Akt e MEK-ERK percursos na regulação da PDCD4, inibidor de PI3K LY294002 específico, e inibidor MEK U0126 foram introduzidas para as células fome juntos com soro e incubadas durante 2 h e 4 h após o tratamento jejum de 48 horas. Quando P-Akt estava especificamente regulada negativamente sobre o tratamento de LY294002, a depleção de PDCD4 foi impedido (Figura 3B). No entanto, a administração de U0126 não exibiu qualquer efeito sobre a prevenção da degradação PDCD4 (Figura S1). Além disso, quando o inibidor de proteassoma MG132 foi introduzida para as células em jejum, a depleção de PDCD4 foi também impedida (Figura 3B). Não se observou qualquer efeito em células de controlo de DMSO. Os nossos resultados indicaram que a depleção de PDCD4 após a re-adição de soro nas células de cancro do ovário foi devido à degradação mediada por proteassoma. A quantificação das bandas de transferência de Western foi apresentado em dados S2.
No PDCD4 sobre-expressando células ovarianas, PTEN foi-se regulamentada, e P-Akt e p-ERK foi significativamente baixo regulada, enquanto que Akt total e ERK não foram afetados (Figura 3C). A quantificação das bandas de transferência de Western foi apresentado em dados S2.
translocação intracelular de PDCD4
Nosso estudo imuno-histoquímica anterior mostrou um padrão diferencial de localização celular da PDCD4 entre células ovarianas normais e malignas [17] , sugerindo que PDCD4 pode translocar a partir do núcleo para o citoplasma, durante o desenvolvimento do cancro do ovário. Outro estudo também demonstrou a translocação intracelular de PDCD4 sob algumas condições de estresse [18]. Em seguida, investigou a localização PDCD4 endógeno em células de cancro do ovário. Duas linhas celulares de cancro do ovário, OV2008 e C13, tem alto nível da PDCD4 endógena, que estava localizado exclusivamente no núcleo sob condições de cultura normais (Figura 4) expressão. Após o tratamento privação de soro durante 48 horas, a PDCD4 endógena foi encontrado para ser translocados do núcleo para o citoplasma (Figura 4).
endógena PDCD4 em ambas as células de cancro do ovário OV2008 e C13 foi localizado exclusivamente no núcleo quando cultivadas em meio com soro. Mais localização citoplasmática de PDCD4 foi observada em tratamento privação de soro. Endógena PDCD4 foi detectado por coloração de imunofluorescência utilizando anticorpos primários e anticorpos secundários PDCD4 anti-coelho de cabra marcado com FITC. A coloração DAPI indicado de localização nuclear. translocação representante foi indicado por setas.
Discussão
Uma série de estudos têm relatado os efeitos inibitórios da PDCD4 na tradução de proteínas [19], [20], e AP-1 dependente transactivação [12], [21]. Estudos sobre a função do PDCD4 no ciclo celular têm gerado resultados inconsistentes. Em células de cancro da mama, PDCD4 causou um aumento na população G0 para G1 fase sem afectar as outras fases do ciclo celular, sugerindo um papel potencial na apoptose [22]. Em células de cancro glioma, PDCD4 retardada transição do ciclo celular da fase G1 para S [23]. Outro grupo relatou que PDCD4 células em ambas as sub-G1 e G2 fase-S induzidas, indicando os seus efeitos sobre ambos apoptose celular e interrupção do ciclo [24]. No entanto, em células cancerígenas do cólon, PDCD4 não alterou a progressão do ciclo celular ou induzir a apoptose [8]. No estudo atual, expressão PDCD4 ectópica induzida paragem do ciclo celular na fase G1 e, consequentemente, suprimiu a proliferação de células de cancro do ovário.
Nós avaliamos a expressão de um painel de reguladores do ciclo celular que desempenham papéis importantes em transição G1-S em PDCD4 sobre-expressando células. PDCD4 induziu a expressão de p27 e p21, mas não a expressão de ciclina E. Os resultados foram consistentes com os resultados que knockdown de PDCD4 em células AML resultaram na regulação para baixo de p27 [25]; e a indução de p21 e p27 por PDCD4 [26]. Foram sugeridos os efeitos celulares de PDCD4 ser diferente em modelos celulares com ou sem expressão da p53 [10], [27]. Duas linhas de células de ovário selecionados neste estudo têm o estatuto de p53 diferencial, OVCA433 rolamento tipo selvagem p53 e p53 SKOV3 sendo nulo. Ambas as linhas celulares tinham elevadas expressões p27 sobre a superexpressão de PDCD4, e a sobre-regulação de p21 não foi mediado por p53 em células OVCA433. Descobertas similares foram relatados que a indução de p21 por PDCD4 em células carcinóides era independente de p53 [7]. Nossas descobertas implícito que um dos potenciais mecanismos para a indução de parada do ciclo celular na fase G1 por PDCD4 foi devido ao regulamento acima de p21 e p27. Notamos que não houve diferença na expressão de ciclina A ou Cdc25A entre clone estável e controle vazio vector em linhas celulares SKOV3. No entanto, para OVCA433 células, observou-se um aumento da expressão na Cdc25A dois PDCD4 sobre-expressão de clones estáveis, e um aumento de ciclina A expressão em PDCD4 433 C2, mas não em C1. A expressão diferencial de ciclina A pode ser devido aos diferentes actividades proliferativas e de clonogénicas PDCD4-expressando o clone C1 e C2. No entanto, os efeitos da PDCD4 sobre ciclina A e Cdc25A seria necessário uma investigação mais aprofundada.
Além de proliferação, nós também demonstraram os efeitos inibitórios de PDCD4 sobre a migração de células de câncer de ovário e invasão. Efeitos semelhantes também foram relatados em estudos realizados no cólon e células de carcinoma hepatocelular [8], [20], [28]. PDCD4 foi encontrado para ser induzida mediante o tratamento de substâncias pró-apoptóticos [29], [30]. As investigações sobre o seu papel na apoptose têm gerado resultados inconsistentes. PDCD4 foi demonstrada para induzir apoptose em células da mama e cancro do pulmão [22], [26] Em contraste, não se observou qualquer efeito apoptótico de PDCD4 em outros estudos [8], [12]. Além disso, foram relatados expressões PDCD4 mais elevadas para ser correlacionado com o aumento da sensibilidade à geldanamicina e tamoxifeno [31]. Além disso, um estudo recente realizado em células de cancro da próstata sugeriu um aumento da sensibilidade e cisplatina paclitacel por sobre-expressão de PDCD4 [32]. No presente estudo, a sobre-expressão de PDCD4 não induziu apoptose de acordo com citometria de fluxo e ensaio de Western Blot por meio da expressão de PARP (Figura S2). Também avaliou o papel potencial da PDCD4 na sensibilidade à cisplatina. No entanto, não se observou qualquer diferença significativa entre PDCD4 sobre-expressando células e as células de controlo em resposta ao tratamento com cisplatina (Figura S2), o que era consistente com os nossos dados publicados anteriores que não foi observada nenhuma correlação entre a expressão PDCD4 com o estado quimiossensibilidade de pacientes de cancro do ovário [17]. Dado que o mecanismo de cisplatina para matar as células cancerígenas é iniciar a apoptose celular, e não mostrou nenhum efeito PDCD4 apoptose em células de cancro do ovário, esta pode ser uma das razões que contribuem para a observação acima mencionada.
Como observado dos seus resultados, a magnitude de supressão da proliferação de células de cancro do ovário, migração e invasão não era proporcional aos níveis sobre-expressão da proteína PDCD4 nesses clones estáveis. Achados semelhantes também foram relatados no estudo conduzido por Yang et al. no rato epidérmicas células JB6 RT101 [21]. Propusemos que pode haver um limiar de concentração, quando excedido, ocorreria a função inibidora de PDCD4 na progressão do tumor. De acordo com a nossa análise de citometria de fluxo, sobre-expressão de PDCD4 em ambas as células SKOV3 OVCA433 e induzidas de paragem do ciclo celular na fase G1. No entanto, embora tenha sido observado um efeito supressor sobre a proliferação celular e formação de colónias em PDCD4 sobre-expressando células SKOV3, o efeito não foi estatisticamente significativo, quando comparado com as células de controlo parental (Figura S3). Se foi devido ao fundo genético das células SKOV3 ou o envolvimento de outros mecanismos e fatores foram atualmente não é clara e exigiu uma investigação mais aprofundada
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As observações do down-regulação da p-Akt e p-ERK em PDCD4 sobre-expressando células sugeriu um potencial envolvimento da P-Akt e p-ERK percursos na regulação da PDCD4. Para abordar a questão de que se estas duas vias são realmente envolvidos, procedeu-se a estudar as expressões simultâneas de p-Akt, p-ERK e PDCD4 durante a retirada do soro e re-adição tratamento. Houve um aumento dramático de PDCD4 mediante a retirada de soro, seguido por uma rápida depleção do soro PDCD4 depois foi re-administrado. Durante o mesmo processo, uma tendência reversa da expressão de ambos P-Akt e ERK-P, as duas moléculas reguladoras importantes da proliferação celular, foi observado: uma diminuição da expressão inicial seguida por uma retoma gradual. A alteração da P-Akt e ERK-P pode ser simplesmente as consequências de privação de soro de tratamento. E ainda, tendo em conta as alterações simultâneas das expressões de PDCD4 e P-Akt e p-ERK, e o nível de expressão alterado de ambas as moléculas observadas no PDCD4 sobre-expressando células, existe uma possibilidade de que a P-Akt e p-ERK vias estava envolvido na regulação da PDCD4. Para confirmar ainda mais que, aplicamos inibidor PI3K LY294002 (que posteriormente blocos fosforilação Akt), juntamente com o soro, e encontrou proteína PDCD4 não era mais degradada. Introdução de inibidor MEK não impediu o esgotamento dos PDCD4. Os nossos resultados indicaram que a P-Akt, mas não p-ERK foi necessário para a degradação de PDCD4 após estimulação sérica, e, portanto, via PI3K-Akt pode desempenhar um papel directo na modulação da degradação PDCD4 em células de cancro do ovário. No entanto, o envolvimento da via p-ERK não está claro na investigação adicional presente e necessária. Tem havido estudos que relatam a via p-Akt sobre a regulamentação da PDCD4. O estudo de Dorrello implicado o papel de S6K1 na regulação da degradação PDCD4 em resposta ao mitogénio [23]. O tratamento com o promotor do tumor 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) a diminuição da expressão PDCD4, o que foi atribuível a degradação proteossómica mediada por PI3K-Akt-mTOR-p70
S6K e facilitada pela via de sinalização de MEK-ERK [16] . Uma correlação inversa de PDCD4 e expressão P-Akt tem sido relatada em amostras de tecido de cancro colorrectal [33]. shRNA PDCD4 activado Akt, que leva ao aumento da expressão P-Akt, mTOR e p70S6K nos pulmões de ratinhos [34]. Nossos resultados estavam em concordância com estes resultados e implicou o envolvimento da via p-Akt na regulação da PDCD4 em células de cancro do ovário.
Combinando o fenômeno que down-regulação da expressão de p-Akt foi observada em PDCD4 mais células, e o fato de que o bloqueio de p-Akt por inibidor PI3K impediu a degradação de PDCD4 durante o processo de privação de soro e re-adição -expressing, propusemos um potencial de controle de feedback de PDCD4 através de via p-Akt: estabelecimento de PDCD4 sobre- Os clones estáveis que expressam só poderia ser conseguido quando a degradação de PDCD4 foi inibida, o que exigia a supressão da expressão da P-Akt (Figura 5). No entanto, os mecanismos potenciais mediadores este controle de feedback e moléculas envolvidos não foram identificados e novos estudos são necessários.
Elevated PTEN e suprimiu p-Akt foram encontrados no PDCD4 sobre-expressar clones estáveis. Quando as células foram privadas de meio isento de soro, foi un PDCD4 fosforilado devido à expressão P-Akt suprimida. Un-fosforilada PDCD4 não foi reconhecida pelo proteassoma conduzindo assim à acumulação de PDCD4. Quando o soro foi re-administrado às células, sobre-regulada P-Akt fosforilada PDCD4, o qual foi, em seguida, empobrecido através da degradação de proteassoma. A administração quer de inibidor de PI3K LY294002, capaz de prevenir PDCD4 de ser fosforilado pela P-Akt, ou inibidor de proteassoma MG132, impedindo a depleção de PDCD4, levando à acumulação de PDCD4.
Os nossos resultados actuais demonstrada uma translocação de PDCD4 endógeno do núcleo para o citoplasma após a privação de soro. Nossa hipótese é que PDCD4 shuttle força para o citoplasma para expor a sua função inibitória na tradução da proteína quando as células estavam sob condição de crescimento desfavorável. De acordo com as nossas descobertas anteriores, observou-se uma localização diferencial de PDCD4 entre amostras de tecidos normais e malignas de ovário: foi observada mais localização citoplasmática de PDCD4 em amostras de tecido de cancro do ovário [17]. Quando tumor cresce, pode haver algumas regiões onde a concentração de oxigénio é significativamente menor do que nos tecidos normais, e as células tumorais estão sob uma tensão hipóxica. Uma hipótese é que nestas células, PDCD4 pode shuttle para o citoplasma para inibir a tradução e crescimento celular posteriormente. No seu conjunto, PDCD4 funciona como supressor de tumor no núcleo em células normais, no entanto, quando as células estavam sob certas stress ambiental ou a sofrer uma transformação potencial de normal a maligna, um de a resposta celular pode ser o transporte de PDCD4 para o citoplasma. Isto torna a localização de PDCD4 como um indicador das células, em ambiente de crescimento anormal ou transformação neoplásicas. No entanto, o mecanismo de translocação de PDCD4 ainda não está clara e a hipótese deve ser mais avaliada.
Materiais e Métodos
cultura celular, o tratamento privação de soro e tratamento medicamentoso
linhas celulares de cancro do ovário OVCA433 e SKOV3 utilizados neste estudo foram presente do Prof. SW Tsao, do Departamento de anatomia, da Universidade de Hong Kong. linhas celulares de cancro do ovário C13 e OV2008 foram presente do Prof. BK Tsang, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade de Ottawa, no Canadá. Estas linhas celulares foram cultivadas em MEM com 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).
células sob tratamento privação de soro foram cultivadas em MEM sem FBS. Phosphoinositide 3-quinase (PI3K) inibidor de LY294002 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), inibidor MEK U0126 (Cell Signaling), inibidor de proteassoma MG132 (sinalização celular) foram dissolvidos em DMSO (Sigma Co., St. Louis, MO ) e em seguida diluído antes introduzido nas células. O meio com DMSO por si só também foi incluído como controlo.
Os anticorpos e análise de mancha de
extracção Proteína ocidental e métodos de Western blot foram as mesmas como previamente descrito [17]. anticorpo PDCD4 era de Rockland (immunochemicals Rockland, Gilbertsville, PA); anticorpos de p21, cyclinA, ciclina e p53 foram de Santa Cruz; anticorpos de PTEN, P-Akt, Akt, ERK-p, ERK, JNK-p, JNK, Cdc25A, mTOR eram de sinalização celular; anticorpo de p27 foi de laboratórios BD Transduction.
Construção de vector de expressão de ADNc PDCD4
ADNc de comprimento completo PDCD4 foi amplificado por PCR utilizando o clone de ADNc humano PDCD4 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) (número de acesso do Genebank NM_014456.3) como molde e os seguintes pares de iniciadores 5 ‘gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3’ (sentido directo) e 5 ‘gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3’ (anti-sentido), os quais continham locais de enzima de restrição EcoRI e SalI. A 1.5-kb, full-length produto PDCD4 PCR foi então clonado no quadro, em pEGFP-C1 (laboratórios Clontech, Mountain View, CA).
Estabelecimento de PDCD4 sobre- expressar clones estáveis
PDCD4 plasmídeo ou vector GFP-C1 foi transfectado em células de cancro do ovário SKOV3 OVCA433 e utilizando o reagente de transfecção FuGENE HD (Roche molecular Biochemicals, Manniheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram então colhidas para análise de mancha de Western ou ensaio.