Abstract

O receptor transiente canônica canais potenciais (TrpC) são Ca

2 + canais catiônicos -permeable controlam o Ca

2 + influxo evocada por G ativação do receptor acoplado à proteína e /ou Ca

2 + esgotamento loja. Aqui nós investigamos o envolvimento de TRPCs na diferenciação de células de câncer de pulmão. A expressão de TRPCs e a correlação no grau de diferenciação do cancro no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram analisadas por PCR em tempo real e imunocoloração utilizando microarrays de tecido a partir de 28 amostras de pacientes com cancro do pulmão. A associação de TRPCs com a diferenciação celular também foi investigada no cancro do pulmão de células A549 de linha por PCR e transferência de Western. A atividade do canal foi monitorado por Ca

2 + imagem e gravação de patch após o tratamento com todos-

ácido retinóico trans

(ATRA). A expressão de TRPC1, 3, 4 e 6 foi correlacionado com o grau de diferenciação das NSCLC em pacientes, mas não houve correlação com a idade, sexo, história de tabagismo e tipo de células de câncer de pulmão. ATRA regulada TRPC3, TRPC4 e expressão TRPC6 e reforçada Ca

2 + fluxo em células A549, no entanto, ATRA não mostrou nenhum efeito direto sobre canais TrpC. A inibição dos canais de trpC de anticorpos de bloqueio de poros diminuiu a mitose celular, que foi neutralizado por tratamento crónico com ATRA. O bloqueio dos canais de trpC inibiu a proliferação de células A549, enquanto que a sobre-expressão de TRPCs aumentou a proliferação. Conclui-se que a expressão TRPC se correlaciona com diferenciação de câncer de pulmão. TRPCs mediar o efeito farmacológico de ATRA e desempenham um papel importante na regulação da diferenciação de células do cancro do pulmão e proliferação, o que dá uma nova compreensão da biologia do câncer de pulmão e terapia potencial anti-câncer

Citation:. Jiang HN, Zeng B, Zhang Y, Daskoulidou N, Fan H, Qu JM, et al. (2013) Envolvimento de Canais TrpC no cancro do pulmão diferenciação celular e a análise de correlação in Human Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10.1371 /journal.pone.0067637

editor: Peiwen Fei, Universidade do Havaí Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Janeiro, 2013; Aceito: 20 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios de Xangai projectos conducentes Talent (N.º 036, de 2010) e Shuguang Tracking Project da Comissão de Educação Xangai (01SG06) (a JMQ); Leverhulme Fellowship Award Trust (para S.Z.X.); Natural Science Foundation de Shanghai (No. 09ZR1406100) e Shanghai Leading Academic Projeto Disciplina (No. B115) (a H.N.J.). BELEZA. foi apoiada pelo Conselho de Bolsas China ea bolsa de estudo universitário. N.D. recebeu 80 studentship PhD aniversário da Universidade de Hull. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora a taxa de sobrevivência foi melhorado desde a introdução da terceira geração de agentes anti-neoplásicos e do receptor do factor de crescimento epidérmico inibidores (EGFR) de tirosina-quinase, o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes por câncer no mundo [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Portanto, a compreensão da patogênese do desenvolvimento e da identificação de novos alvos potenciais de câncer de pulmão são importantes para o desenvolvimento da estratégia terapêutica.

Ca

2 + é importante nas cascatas de sinalização de tumorigênese. O potencial do receptor transiente (TRP) da família de canais de iões tem sido implicada na regulação do crescimento e a progressão do cancro por meio da modulação de Ca

2+ afluxo e os sinais a jusante, incluindo a transcrição do gene [6], [7], [8] . Entre os seis subfamílias (TRPC, TRPM, TRPV, TRPP, TRPML e trpA) dos canais TRP, os PG canónicas (TRPCs) têm sido sugeridas como a tirosina proteína quinase G ou acoplados à proteína operados por receptores Ca

2+ canais ( ROCs) ou internos Ca

2 + canais operados-store (SOCs), que mediam a Ca

2 + entrada evocado por muitos hormônios e fatores de crescimento. Por conseguinte, a inibição da actividade de canal ou estes expressão conduz a alterações funcionais na proliferação de células cancerosas, a migração, a formação de colónias e crescimento tumoral [6], [9]. Recentemente, vários estudos têm demonstrado a existência de TRPC em diferentes tipos de células cancerosas ou tecidos de câncer, como TRPC1, 3, 6 em células MCF-7 de cancro da mama [10], [11] e células HepG2 câncer de fígado [12], TRPC1, 3, 4 em células LNCaP de cancro da próstata [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 em carcinoma de células renais [15], TRPC1, 3, 5, 6 em gliomas malignos humanos [16], TRPC1, 3- 7 em neuroblastoma IMR-32 as células [17], TRPC3 em astrocitoma humano 1321N1 células [18], TRPC6 no esôfago e cancro gástrico [19], TRPC1, 3, 4, 6 e suas variantes de splicing em cancro do ovário [9], [ ,,,0],20], e TRPC1, 4 em carcinoma de células basais [21]. Além disso, evidências de

In vitro

experiências têm mostrado que a sobre-expressão de canais de trpC ou silêncio da expressão do gene com o siARN pode regular a proliferação celular ou sobrevivência celular, sugerindo que estes genes são importantes na biologia do cancro [6], [9] , [20].

a expressão de TRPC1, 3, 4, 6 em câncer de pulmão foi detectado [22], [23] e a associação de expressão TRPC3 com o prognóstico do adenocarcinoma do pulmão tem sido descrita [ ,,,0],23]. No entanto, a correlação da expressão TRPC com o grau de diferenciação de cancro do pulmão e o mecanismo subjacente são em grande parte desconhecida. Aqui nós teve como objetivo identificar a expressão de TRPCs no cancro do pulmão humano e determinar os papéis de TRPCs na regulação da diferenciação de células cancerosas e proliferação utilizando anticorpos bloqueadores de canal TRPC específico. Nós também examinou a correlação potencial de expressão TRPC com grau de diferenciação câncer, tipo de célula e fumar por PCR em tempo real e imunohistoquímica sobre os microarrays de tecido de câncer de pulmão. Para examinar ainda mais a relação de expressão TRPC com diferenciação celular, ATRA, um indutor de diferenciação celular potente para muitos tipos de células, foi usado em um

in vitro

modelo de células de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido pulmonar

Vinte e oito pacientes (17 homens e 11 mulheres), com idades de 61,1 ± 1,7 anos com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram recrutados entre Novembro de 2008 e dezembro de 2009. Todos os pacientes com NSCLC foram diagnosticados como clinicamente classificados I ou II cancro do pulmão e recebeu operação na Cirurgia Torácica do Hospital Zhongshan. Os pacientes elegíveis tinham previamente tratada, histologicamente ou citologicamente provou NSCLC. Os pacientes receberam quimioterapia pré-operatória ou radioterapia foram excluídos deste estudo. O tecido de cancro do pulmão e o tecido pulmonar normal circundante do tumor para além de 2 cm de distância foram obtidos a partir de mesmo doente. Os tecidos congelados instantaneamente foram utilizados para análise mRNA e os tecidos fixados em formol para estudo immuocytochemistry. O projeto foi aprovado pela Comissão de Zhongshan Hospital da Universidade Fudan de Ética, e os pacientes assinaram consentimento de acordo com a Declaração de Helsinki.

Tissue microarrays do cancro do pulmão

Lung microarrays de tecido de cancro foram feitas com tecidos de câncer fixados em formol [24]. núcleos de tecidos com 2 mm de diâmetro, foram recolhidas com base no alinhamento visual com o correspondente hematoxilina e eosina (HE). Um núcleo de tecido de pulmão normal e dois núcleos de tecido de tumor foram colhidas de cada paciente e colocados em blocos de parafina receptor. As secções de tecido com a espessura de 5 um foram utilizadas para a imunocoloração. Todas as amostras sobre os microarrays de tecido foram examinadas por um patologista com a classificação histológica e grau de diferenciação de acordo com a classificação da OMS [25].

Células Cultura e Gene transfecção

linha de células A549, um comumente usado modelo de células de cancro de pulmão derivado a partir de células alveolares humanas adenocarcinomic basais epiteliais, foi cultivada em meio DMEM /F12 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, e mantida a 37 ° C sob 95% de ar e 5% de CO

2. TRPC1 humano, TRPC3 e TRPC6 foram amplificados a partir do ADNc das células cancerosas e TRPC4 humano do ovário humano foram amplificadas a partir do ADNc de células endoteliais aórticas humanas com 100% de identidade com as sequências no Genbank (números de acesso: X89066 (TRPC1); U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) e BC093660 (TRPC6). A TRPC ADNc foram subclonados em pcDNA3.1 ou vectores de pEGFP-C1 e a sua expressão funcional foi confirmada como já relatado [9]. As células A549 foram transfectadas com TRPC1, 3, 4, 6 e em ADNc de plasmídeo vector pcDNA3 utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen). As células transfectadas foram semeadas em placa de 48 poços para ensaio.

Giemsa de coloração, mitose e proliferação celular Os ensaios

células A549 foram plaqueadas em placas de 3,5 cm com uma densidade final de 4 × 10

4 células por placa. As células foram tratadas com 1 ^ M de ATRA ou veículo. O meio de cultura foi alimentada a cada 24 h. As células foram fixadas com metanol durante 10 min e corados com uma solução de trabalho diluiu-se 1:09 Giemsa (Sigma) em PBS a pH 6,5 durante 45 min, e lavou-se com água e secou-se ao ar. As células totais número de células e mitóticas foram contadas nas imagens fotografadas sob 200 × ampliação. A proliferação celular foi também determinada utilizando um ensaio de WST-(Roche, Reino Unido) [9].

RT-PCR e PCR em tempo real

O ARN total foi extraído de pulmão humano e tecidos de cancro do pulmão ou células A549 usando Trizol reagente (Invitrogen, UK). O RNA foi quantificado com um nanophotometer (Implen, alemão). O ARNm (1 ug) foi transcritos de modo inverso em ADNc utilizando transcriptase MultiScribe (Applied Biosystems, EUA) e iniciadores aleatórios (Promega, Reino Unido) reverso. RT-PCR quantitativa foi realizada utilizando StepOne ™ Real-Time PCR System ou Sistema de Detecção de PRISM ABI 7900 HT Sequence (Applied Biosystems, UK). O conjunto de primers foi desenhado através intron e as sequências foram dadas na Tabela S1. Cada reacção continha 1 × SYBR Mistura Universal Master (Applied Biosystems) a 10 ul, 1 uL de ADNc, e iniciadores directos e inversos 1,5 ul cada. O gene GAPDH de limpeza gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase humana foi utilizado como um padrão interno. Não-molde ou não-RT foi definido como controlo negativo. O ciclo de PCR consistiu de um ciclo inicial de 50 ° C durante 2 minutos seguido de 95 ° C durante 10 minutos, depois 50 ciclos repetidos de 95 ° C durante 15 s, 54 ° C temperatura de recozimento durante 30 s, e a extensão do iniciador a 72 ° C durante 30 s.

anticorpos, Western Blotting e imuno-histoquímica

policlonal de coelho anti-anticorpos trpC (T1E3, T5E3, T367E3 e T45E3) foram gerados contra a terceira ansa extracelular (E3) região perto da poro do canal [26]. A especificidade dos anticorpos E3-alvo foi testado por ELISA, transferência de Western e ensaios funcionais, e de fluorescência de células activadas (FACS) [9], [26]. O procedimento para a transferência de Western foi descrito anteriormente [26]. Resumidamente, as células foram lisadas em tampão RIPA (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) e as proteínas foram separadas em gel de SDS-PAGE a 10% antes de ser transferido para uma membrana de nitrocelulose. O blot foi incubado com anticorpos de coelho anti-trpC (1:200) durante a noite a 4 ° C, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e incubadas com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP no 1:2000 diluição (Sigma). O anticorpo de coelho anti-β-actina (Santa Cruz Biotech, EUA) em 1:400 diluição foi utilizada como um padrão interno para quantificação de proteínas. A visualização foi realizada usando reagentes de detecção de ECLplus (GE Healthcare, Reino Unido) e exposição a películas de raios-X. A quantificação foi analisado utilizando o software Image J. (NIH, EUA). O procedimento de imunocoloração foi semelhante aos nossos relatórios [9], [27] e o sistema Vectastain ABC (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido) foi utilizado. O anticorpo de coelho anti-TRPC1, 3, 4 e 6 a partir de anticorpos adquiridos Abcam (Cambridge, Reino Unido) foram usadas para tecido pulmonar humano e cancro do pulmão secção de coloração. A quantificação coloração foi avaliada marcando células positivas coradas e intensidade da coloração classificados como 0 (negativo), 1 (fraco), 2 (intermediário) e 3 (forte) [28].

de célula inteira Grampo patch

As correntes de células inteiras foram gravados usando Axoclamp 2B ou Axopatch B200 patch-clamp amplificador e controlada com software pClamp 10. Os procedimentos para a gravação correntes TrpC foram semelhantes aos nossos relatórios anteriores [29], [30]. Um protocolo de tensão 1-s rampa de -100 mV a +100 mV foi aplicado com uma frequência de 0,2 Hz a partir de um potencial de realização de 0 mV. Os sinais foram amostrados a 3 kHz e filtrados a 1 kHz. Utilizou-se o microeléctrodo de vidro com uma resistência de 3-5 MQ. A 200 nM de Ca

2+ solução da pipeta (115 CsCl, 10 EGTA, 2 de MgCl

2, 10 HEPES, e 5,7 CaCl

2 em mM, o pH foi ajustado para 7,2 com CsOH e a osmolaridade foi ajustada para ~290 mOsm com manitol). O Ca livre calculada

2 + foi de 200 nm usando EQCAL (Biosoft, Cambridge, UK). A solução padrão banho continha (mM): NaCl 130, KCl 5, 8, D-glucose, 10 de HEPES, 1,2 MgCl

2 e CaCl 1,5

2. O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH. O experimento foi realizado à temperatura ambiente (23-25 ​​° C).

Ca

2 + de imagem

As células A549 foram carregados com 2 mM Fura-PE3 AM a 37 ° C para 30 min em Ca

2 + -livre solução do banho, seguido de uma lavagem de 20 minutos em solução de banho normal, à temperatura ambiente. Fura-PE3 fluorescência foi monitorizada com um microscópio de epifluorescência invertido (Nikon Ti-E, Japão). Uma lâmpada de xenon arco de luz fornecida excitação, o comprimento de onda que foi selecionado por um sistema de imagem Nikon controlado por software NIS Elements 3.0. comprimento de onda duplo animado a 340 nm e 380 nm foi utilizada para a fluorescência Fura-PE3, e emissão foi recolhida através de um filtro de 510 nm e fotografado pela câmera Orca-R2 CCD (Hamamatsu, Japão). A proporção de Ca

2+ fluorescência corante em F

340 /F

380 comprimento de onda foi medida [30]. Todas as experiências foram realizadas à temperatura ambiente.

Reagentes e produtos químicos

Todos os sais gerais foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido). cloreto de gadolínio (Gd

3+), 2-aminoethoxydiphenyl borato (2-APB), tripsina, todos-

ácido retinóico

trans (ATRA), e iniciadores de PCR foram adquiridos da Sigma-Aldrich, e Fura -PE3 AM foi a partir de Invitrogen (Paisley, UK).

Estatísticas

Os dados são expressos como média ± SEM A significância estatística foi analisada utilizando análise de variância e a diferença entre os grupos foi avaliada com Dunnett do

t

-test no software SPSS.

t

teste de Student foi aplicado para dois comparação grupo. A análise Ridit foi utilizada para os dados semi-quantitativos de imunocoloração experimento. O

P

valor. 0,05 foi considerado significado

Resultados

A expressão de TRPCs no cancro do pulmão

A expressão de TRPCs no pulmão humano normal e tecidos de câncer de pulmão foi examinado por imunocoloração (Fig. 1A). Em secções de tecido normal do pulmão, as células epiteliais alveolares foram coradas com anticorpos anti-anti-TRPC6 TRPC1 e, mas a coloração para TRPC3 e TRPC4 foram negativos ou muito fraco. Em pulmonares seções carcinoma epidermóide, as células escamosas foram fortemente coradas com anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 e anticorpos anti-TRPC6. Do mesmo modo, a coloração positiva para TRPC1, TRPC3, TRPC4 TRPC6 e também foi observada em secções adenocardionoma pulmão. Usando PCR em tempo real, que quantificada a expressão de TRPCs nos tecidos do pulmão e cancro normais. O ARNm de TRPC1, 3, 4 e 6 foram detectados em ambos os tecidos do pulmão e do cancro do pulmão normais. O nível de TRPC1 e TRPC6 expressão foi muito mais elevada do que a de TRPC3 e TRPC4. Os mRNAs para TRPC5 e TRPC7 foram indetectáveis ​​em tecidos normais e de cancro do pulmão (Fig. 1B-C). Estes dados sugerem a existência de TRPC1, 3, 4, 6 isoformas em NSCLC.

A, Exemplos de pulmão humano normal (

n

= 20) e de tecido de câncer de pulmão seções (

n

= 28), incluindo adenocarcinoma (AC) e carcinoma de células escamosas (SCC) foram coradas com anti-TRPC1, anti-TRPC3, os anticorpos anti-TRPC6 usando o sistema Vectastain ABC anti-TRPC4 e. A coloração positiva foi mostrada como a cor marrom. Os núcleos foram contra-coradas com hematoxilina. B, O ARNm foi detectada por PCR em tempo real em tecidos normais do pulmão utilizando os primers na Tabela S1. A GAPDH foi utilizado como controlo do gene da casa mantendo-se interna para quantificação (

n

= 25 pacientes para TRPC1, 4, 5 e 6 grupos;

n

= 24 para TRPC3; e

n =

9 para TRPC7). C, Os níveis de mRNA em tecidos de câncer de pulmão (AC:

n

= 9-15; SCC:

n

= 8-11)

Correlação de. TRPC Expression to cancer Diferenciação Grade

a diferença nos níveis de mRNA entre graus de diferenciação cancro, tipos de células, fumante e não-fumante foi detectada por PCR em tempo real. A expressão de TRPC1, 3, 4 e 6 canais foi significativamente menor no cancro do pulmão pobremente diferenciadas do que no grupo bem moderadamente diferenciado (Fig. 2A, ver também Tabela S2). No entanto, não houve diferença significativa entre os fumadores e não fumadores grupos (Fig. 2B). A análise de regressão multivariada linear também mostrou uma correlação negativa da expressão de mRNA de TRPC1, TRPC3, TRPC4 e TRPC6 de pulmão grau de diferenciação do cancro com seqüência padronizada coeficiente β de TRPC1 (-0,563) TRPC4 (-0,360) TRPC6 (0,271 ) e TRPC3 (-0,057), respectivamente. de regressão mostrou que TRPC1 foi uma variável significativa (P 0,01)., mas a correlação de diferenciação câncer de grau para sexo, idade, tabagismo e tipo de célula cancerosa não foi significativa

A, A expressão de mRNA de TRPCs em tecidos de câncer de pulmão com o bem-moderado (grau II (

n

= 17) e grau III (

n

= 6)) ou pobre (grau IV,

n

= 5) grau de diferenciação foi detectado por PCR em tempo real. GAPDH foi usada como controlo do gene de arrumação. B, A expressão de mRNA de TRPCs nos tecidos de câncer de pulmão obtidos a partir fumante (20 cigarros por dia há mais de 10 anos,

n

= 11) e não-fumante (

n

= 17 ). C, Exemplo de dois micromatrizes de tecidos com pulmão normal (N) e cancro do pulmão (C) etiquetas foram coradas com anticorpo anti-TRPC1. O tipo de célula e diferenciação grau de cada secção foram caracterizados por SE-coloração. Os dois exemplos (11C e 9c) com adenocarcinoma bem diferenciado foram mostradas em inserções. A correlação de intensidade de coloração para outros factores foi mostrada na tabela e a significância foi determinada por análise de Ridit. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Nós também investigaram a correlação do grau de diferenciação do cancro do pulmão para os níveis de expressão da proteína usando a imunocoloração trpC semiquantitativa. Dois microarrays de tecido com 20 tecidos pulmonares normais e 28 amostras de NSCLC, incluindo 15 casos com adenocarcinoma, 11 casos de carcinoma epidermóide, e 2 casos com mistura de tipos celulares de carcinoma adeno foram construídos (Fig. 2C). O tipo de célula de cancro do pulmão foi confirmada por SE-coloração. O TRPC1, TRPC3, e TRPC6 nas secções de tecido de microarray adjacentes foram fortemente corados com anti-TRPC1, 3, e 6 anticorpos com uma percentagem de secções de cancro coradas positivamente de 71,4%, 75,0% e 71,4%, respectivamente, enquanto que a coloração leve foi visto para TRPC4 com uma percentagem de coloração positiva de 32,1%. Para secções pulmonares normais sobre os microarrays, a percentagem de coloração positiva para TRPC1, 3, 4 e 6 foram 70%, 70%, 45%, e 85%, respectivamente. A análise Ridit mostrou que a intensidade de coloração do TRPC1 foi associada com o grau de diferenciação (Fig. 2C). No entanto, a análise de regressão multivariada linear não mostrou correlação significativa dos escores de coloração proteína de TRPC ao grau de diferenciação câncer de pulmão, tipo de célula, tabagismo, idade e sexo.

regulação positiva de TRPC Expression pelo tratamento crônico com ATRA

TRPC1, 3, 4 e 6 foram detectados em células A549, mas TRPC5 e TRPC7 foram indetectáveis ​​embora os conjuntos de iniciadores para TRPC5 TRPC7 e pode amplificar o ARNm isolado a partir de cérebro ou células HepG2 (Fig. 3A). As duas bandas TRPC1 no gel foram isoformas a e p, e as faixas para as TRPC4 foram α, β, γ e isoformas ô, respectivamente, como descrito nas células de cancro do ovário [9]. Os níveis de mRNA e proteína para TRPC3, TRPC4 e TRPC6 foram significativamente aumentados pelo tratamento crônico com 1 PM ATRA por 96 horas (Fig. 3B-C), no entanto, o regulamento sobre a expressão TRPC1 não foi significativa. Estes dados sugerem ainda que a expressão de algumas isoformas trpC está associada a diferenciação celular.

A, O ARNm de TRPC1, 3, 4 e 6 foram detectados em células A549 por RT-PCR utilizando o conjunto de iniciadores na Tabela S1. As bandas de PCR para TRPC5 e TRPC7 foram negativos em células A549, mas positiva no cérebro humano ou HepG2. B, O ARNm foi detectada por PCR em tempo real nas células A549 tratadas com todos-

ácido retinóico

trans (ATRA, 1 uM) durante 96 horas. A β-actina foi utilizado como um gene de manutenção para a quantificação relativa. O 2

(- ΔΔCt) método foi utilizado para o cálculo. C, as proteínas trpC foram quantificados através de Western blotting utilizando anticorpos anti-TRPC1 (T1E3), anti-TRPC3, anti-TRPC4 (T45E3) e anticorpos anti-TRPC6. Foi utilizado anticorpo anti-β-actina para a quantificação relativa de proteína (

n

= 3 experimentos independentes e cada experimento com amostras em triplicado).

Efeitos do ATRA em Ca

2 + Emissões e Influx em células A549 e TRPC Canal Atividade

células A549 foram tratados cronicamente com ATRA (1 M), durante 4 dias com cada 24 horas refresco de meio de cultura celular. A dinâmica de Ca intracelular

2 + foi monitorado por Fura-PE3 /AM. Tripsina a 0,2 nM induziu uma Ca robusta

2 + lançamento em Ca

2 + solução gratuita, que foi seguido por um segundo Ca

2 + pico em células A549. A perfusão com 1,5 mM de Ca

2+ após o armazenamento de depleção com tripsina aumentou a Ca

2+ influxo nas células tratadas com ATRA (Fig. 4A-B), sugerindo que o tratamento crónico com ATRA reforçada Ca

2 + fluxo, mas não teve efeito sobre o Ca

2 + sinal de liberação. Usando gravação remendo de célula completa, a corrente de células A549 não foi alterado por perfusão aguda com ATRA (Fig. 4C-E). Para investigar o efeito directo potencial de ATRA em canais trpC, as células de HEK-293 que expressam indutivelmente TRPCs foram usadas para a gravação remendo de células inteiras. As correntes de TRPC3, 6 e correntes TRPC4 foram ativados por tripsina ou Gd

3+ (100 M), respectivamente. A relação corrente-tensão (

IV

) curvas para estas correntes foram semelhantes ao nosso relatório anterior [29]. ATRA em 1 uM e 10 uM teve nenhum estimulante ou efeito de bloqueio sobre estes canais, mas todas estas correntes foram bloqueados por o bloqueador TRPC 2-APB, sugerindo que o ATRA não teve nenhum efeito directo aguda em Ca

2+ corrente ou Ca

2 + influxo através dos canais trpC (Fig. 4F-I). O aumento crônico de Ca

2 + influxo na ATRA trataram células A549 poderia ser apenas contribuído por regulação positiva gene TRPC.

A, células A549 foram carregados com 2 mM Fura-PE3 /AM eo Ca

2+ foi medida como a proporção (F

340 /F

380) de Ca

2+ corante de fluorescência. Ca

2 + libertação foi evocada por tripsina (0,2 nM) e Ca

2 + fluxo foi introduzido por Ca 1,5 mM

2 + na solução de perfusão. As células foram incubadas com 1? M de ATRA durante 96 horas e as células de controlo foram incubadas com o mesmo volume de veículo. B, média ± S.E.M. Dados para o Ca

2+ entrada após o esgotamento da loja por tripsina, como mostrado em (A).

n

= 21-32 para cada grupo, ***

P Art 0,001. C, correntes de célula inteira da amostra com a tensão de comando de ± 80 mV em células A549 antes e após a perfusão com ATRA (1 uM), tripsina (0,2 nM) e 2-APB (100 uM). D,

curvas IV Compra de (C). E, os dados médios para o efeito de ATRA. F-H, Efeito do ATRA em correntes de células completas de TRPC3, TRPC4 e TRPC6 nas células HEK293 com superexpressão isoformas TrpC individuais. I, média ± S.E.M. dados medidos a -80 mV, e

n =

4-6 para cada grupo.

Diferenciação Celular reguladas pela actividade Canal TRPC

A diferenciação de A549 pulmão células cancerosas foi avaliada por coloração Giemsa que pode visualizar cromossomos. Celular com a mitose nuclear exibido núcleo azul escuro ou coloração núcleos twin (Fig. 5). O ATRA (1 uM) inibiu significativamente a mitose de células em 24 horas e 48 horas de cultura celular. A percentagem de células mitóticas tornou-se menos às 72 horas e 96 horas de cultura de células e a diferença entre os dois grupos não mostrou significância (Fig. 5B). A perda de diferença estatística após cultura de células de 72 horas pode ser devido à inibição de contacto celular que ocorreu nas células confluentes depois de cultura de células de 3 a 4 dias. Portanto, avaliamos o efeito de bloqueadores dos canais de TrpC na mitose dentro da cultura de 48 horas. A especificidade e função do poro TRPC anticorpos bloqueadores foram demonstradas em estudos anteriores [9], [31], [32], [33]. A inibição dos canais de TRPC1, TRPC3 e TRPC6 por anticorpos T1E3 e T367E3 inibiu significativamente a mitose, enquanto que os efeitos de T1E3 e T367E3 mostrou menos eficaz após o tratamento com ATRA em comparação com os grupos tratados com o anticorpo fervida ou o grupo sem adição de anticorpo.

a, Exemplo de Giemsa coloração de células A549 e o tratamento com ou sem ATRA para 0-96 horas. As células mitóticas foram indicado pela seta. B, a porcentagem de células mitóticas em controle e grupos tratados com ATRA (

n

= 32-40 campos microscópicos para cada grupo contendo 6 pratos de cultura, ***

P Art 0,001). C, Efeito de canal TRPC anticorpos bloqueadores na mitose celular. O meio sem anticorpo (No-Ab) e o anticorpo cozidos (fervidos-Ab) como controles (

n

= 18 campos microscópicos a partir de 6 poços de cultura para cada grupo, NS: não significativo, *

P Art 0,05, e **

P Art 0,01). Os delta (Δ) alterações da inibição induzida por ATRA também foram comparados entre os cozidos e Ab (Control) e os grupos tratados com anticorpo de bloqueio.

TRPC Canal e proliferação celular A549

celular diferenciação e proliferação são dois processos celulares intimamente relacionados, portanto, também observamos efeito da atividade do canal TRPC na proliferação de células A549. O número de células foi aumentado em ~ 8-pregas depois de cultura de células de 96 horas. O ATRA (1 uM) inibiu significativamente a proliferação de células após 72 horas e a cultura de células de 96 horas (Fig. 6A), sugerindo que o efeito da ATRA na proliferação celular é um processo lento de início. No entanto, o efeito anti-proliferativo, bloqueando a actividade do canal TRPC era muito mais rápido e a diferença significativa foi alcançada dentro de 24 horas após a incubação com 2-APB, um bloqueador do canal de TRPC não selectivo. A CE

50 para 2-APB foi de 87,9 mM (Fig. 6B). Utilizando os anticorpos bloqueadores T1E3 e T367E3 para bloquear especificamente TRPC1 e TRPC3 /6 em células A549 também inibiu a proliferação das células sem tratamento com ATRA, mas o efeito inibitório foi mais pronunciado quando as células foram tratadas com 1 ^ M de ATRA durante 48 horas (Fig . 6C), sugerindo que a actividade do canal de TRPC pode ser aumentada pelo ATRA. Para demonstrar ainda mais o envolvimento de canais de trpC na proliferação de células de cancro do pulmão, células A549 foram transfectadas com TRPC1, 3, 4, 6 e ADNc de plasmídeo. A proliferação celular foi aumentada em células A549 que sobre-expressam TRPC1 e TRPC6, mas não significativa para as células que sobre-expressam TRPC3 e TRPC4 (Fig. 6D). Estes resultados indicam que a proliferação de células de cancro do pulmão é regulada pela actividade dos canais de trpC.

A, o decurso de tempo para o efeito da ATRA na proliferação de células A549. B, células A549 foram incubadas com 2-APB em diferentes concentrações durante 24 horas (

n

= 8 poços para cada grupo) e a proliferação das células foi testada por WST-1 Kit de ensaio de proliferação celular. C, as células A549 tratadas com específica TRPC anticorpos bloqueadores ou combinação com ATRA por 48 horas (

n

= 6-7 para cada grupo-alvo E3; comparação com o controle (

#); * ou

#

P Art 0,05, ** ou

##

P Art 0,01). D, a proliferação de células A549 foi avaliada por WST-1 após a transfecção com TRPC1, 3, 4, 6 e ADNc de plasmídeo por 48 horas (

N

= 8 para cada grupo, **

P

. 0,01)

Discussão

neste estudo, nós mostramos que TRPC1, TRPC3, TRPC4 e TRPC6 existem no cancro do pulmão humano, incluindo o adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas eo derivadas de adenocarcinoma linha celular A549. O nível de expressão de canais de trpC é correlacionado com o grau de diferenciação de cancro do pulmão. ATRA regula positivamente a expressão do gene em células A549 TRPC. A inibição da actividade do canal de TRPC mostra o efeito antiproliferativo. Estes resultados são importantes para a compreensão dos papéis dos canais trpC na diferenciação de células de cancro do pulmão e proliferação.

canais trpC ter sido detectada em muitos tecidos [32], [34], [35], [36], incluindo o cancro tecidos, tais como o cancro da mama [37], do cancro do ovário [9], [20], de hepatoma [12], o cancro da próstata [13], carcinoma de células basais [21], carcinoma de células renais [15], gliomas malignos [16] , glioblastoma [8], e tumores gástricos [19]. O nível de cada isoforma TRPC em diferentes tipos de células cancerosas ou tecidos expressão são variáveis, sugerindo a contribuição ou a importância biológica de cada isoforma TRPC no tipo de cancro diferente poderia ser diferente. Por exemplo, a expressão de TRPC7 é negativo em A549 e SKOV-3, mas positiva em células HepG2 neste estudo e nas células de neuroblastoma diferenciadas [17]. Além disso, as variantes de splicing alternativos também podem contribuir para a funcionalidade dos canais de trpC, tais como isoformas TRPC1 e TRPC4 emendados em células do cancro do ovário SKOV3 [9]. Além disso, o nível de canais de trpC de expressão pode depender do estado de diferenciação das células de cancro, porque descobrimos a expressão de ARNm de TRPC1, TRPC3, TRPC4 e TRPC6 no cancro grau de pulmão de baixa diferenciação foi menor do que no cancro bem diferenciado , o que é consistente com nossa observação no cancro do ovário [9] e a expressão de baixo nível de TRPC4 e TRPC6 em células-tronco imaturas [38]. Embora os nossos dados mostram que os níveis de mRNA de TRPCs em pulmão normal foram maiores do que no cancro do pulmão, é difícil de fazer esta comparação, devido à variação de tipos de células, porque as amostras de pulmão normal contém células muito mais não-epiteliais que não aquele as amostras de tumores sólidos, tais como células vasculares, macrófagos alveolares, fibroblastos e células do sangue. A imunocoloração nas micromatrizes de tecido de cancro do pulmão mostraram menos significativo, o que pode ser devido à baixa sensibilidade da metodologia de comparação para a elevada sensibilidade da PCR em tempo real.