Abstract
Eu inventei uma terapia desmetilação aerossol com base para alcançar a eficácia terapêutica no pré-malignas ou em lesões in situ de câncer de pulmão, sem toxicidade sistêmica. regimes óptimos de aerossol azacitidina (AZA), foram concebidos e utilizados em modelos ortotópicos humanos não-pequenas do pulmão de células de xenotransplante de cancro. A eficácia terapêutica e a toxicidade de aerossol Aza foram comparados com Aza administrado por via intravenosa. Observou-se que 80% das gotículas do aerossol Aza medido ~0.1-5 mícrons, o que resultou na deposição nas vias respiratórias inferiores brônquicas. Um modelo animal que fenocópias carcinogeneisis campo em humanos foi desenvolvido por inoculação intratraqueal de células de cancro do pulmão humano em ratinhos, resultando, assim, na sua distribuição ao longo de todo o espaço das vias respiratórias. Aerossolizado Aza prolongou significativamente a sobrevivência de ratinhos portadores de tumores pulmonares endo-brônquica. O tratamento de aerossol não causou qualquer toxicidade pulmonar detectável ou toxicidade sistêmica. Um estudo de pré-farmacocinético em ratos demonstraram que a deposição pulmonar do aerossol Aza foi significativamente mais elevada do que a via intravenosa. tumores de pulmão foram ressecados após o tratamento aerossol e os níveis de metilação de 24 promotores de genes supressores de tumor-relacionadas ao câncer de pulmão foram analisados. Aerosol Aza reduziu significativamente o nível de metilação em 9 desses promotores e reexpressas vários genes testados. Em conclusão, aerossol Aza em doses não citotóxicas parece ser eficaz e resulta na desmetilação de ADN e o gene supressor de tumores re-expressão. O índice terapêutico de aerossol é Aza 100 vezes mais elevada do que a de Aza intravenosa. Estes resultados fornecem uma base racional pré-clínico para uma fase I de ensaios clínicos de aerossol Aza para ser iniciada em nossa Instituição
Citation:. Qiu X, Liang Y, Sellers RS, Perez-Soler R, Zou Y (2014) Aerosol azacitidina Inibe cancros ortotópico de pulmão em ratos por meio de sua DNA desmetila�o e Gene Efeitos reativação. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10.1371 /journal.pone.0109874
editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 19 Março, 2014; Aceito: 12 de setembro de 2014; Publicação: 27 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo é apoiado por uma bolsa NIH 5R01CA154755. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O cancro do pulmão afirma 1,4 milhões de vidas todos os anos (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html~~number=plural) [1], [2]. O cancro do pulmão ocorre como resultado de dano cumulativo no epitélio brônquico provocado por agentes cancerígenos inalados. Uma vez que o dano cumulativo afeta toda a via aérea, epitélio das vias aéreas danificado é propenso a desenvolver tumores primários adicionais durante o tempo de vida de um indivíduo [3]. Todos os não-pequenas do pulmão de células (NSCLC) originam-se do epitélio brônquico cobrindo vias aéreas grandes ou pequenos, dando origem a tumores centrais ou periféricas. Por exemplo, carcinomas do pulmão de células escamosas na maioria das vezes surgem no centro de grandes brônquios, adenocarcinomas de pulmão geralmente desenvolvem perifericamente nas vias aéreas menores, e grandes carcinomas de pulmão de células pode surgir em qualquer local. No entanto, todos os tumores se originam de células epiteliais das vias respiratórias transformadas. Portanto, a intervenção terapêutica seletiva para tumores confinados para as vias aéreas devem efetivamente inibir ou retardar a sua formação sem causar toxicidade sistémica [4] – [7]. Infelizmente, não há terapias que visam especificamente o epitélio brônquico estão actualmente disponíveis
O aumento de conhecimento no campo da epigenética e carcinogénese levou à conclusão de que as mudanças epigenética aberrantes desempenham um papel importante durante a carcinogénese do pulmão.; Além disso, estas alterações são mantidas ao longo de todo o processo de progressão da doença [8], [9]. Por exemplo, o silenciamento de genes supressores de tumor (ETG) por hipermetilação aberrante tem sido encontrado para desempenhar um papel importante na iniciação e desenvolvimento de cancro em vários tipos de cancro [10] – [19]. TSG hipermetilação do promotor, também tem sido demonstrado que se correlacionam com prognóstico pobre e resistência à quimioterapia [20] – [26]. Em particular, todas as lesões genéticas em cânceres de pulmão, incluindo p53 e K-ras mutações, pode ser a consequência de alterações epigenéticas aberrantes [10], [27], [28]. As mudanças epigenéticas são eventos cancerígenas reversíveis [10], [29]. O cancro da especificidade destas alterações epigenética torna-os alvos exclusivos para terapias específicas epigenética [30]. Portanto, se a hipótese de que, visando o epitélio das vias respiratórias, com um agente de desmetilação por administração de aerossol, que pode influenciar favoravelmente a história natural do cancro do pulmão.
Anteriormente observou-se que a hipermetilação da região promotora do gene humano em Rassf1 a linha de células NSCLC H226 pode ser revertida pelo agente de desmetilação azacitidina (AZA). Também demonstramos, usando um modelo animal clinicamente relevante desenvolvido pelo nosso laboratório, que a injecção intratraqueal (uma forma semelhante da administração local como aerossol) de Aza em doses sub-tóxicos podem aumentar a sobrevivência de ratinhos ortotopicamente implantado cancro do pulmão H358 e H460 [31 ], [32]. Este modelo animal clinicamente relevante foi a prova de conceito de que a via aérea terapia-alvo epigenética pode ter uma vantagem na prevenção e tratamento de início de NSCLC. Aqui relatamos a eficácia de Aza aerossol no tratamento de modelos de xenoenxerto humanos com NSCLC ortotópico em murganhos, bem como a eficácia da terapia no desmetilação de promotores específicos de ETG em tecido tumoral. Para elucidar os mecanismos terapêuticas epigenéticas, nós ressecado tecidos tumorais dos animais xenoenxerto tratados com aerossol Aza, analisou o estado de metilação dos promotores da ETG relacionadas com o cancro 24 pulmão, e determinou os níveis de expressão de proteína desses genes que apresentaram significativa desmetilação promotor depois aerossol Aza tratamento.
Materiais e Métodos
As linhas celulares
linhagens de células NSCLC Humano H226, H358 e H460 foram comprados da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) e mantida num banho a 37 ° C incubadora com 5% de CO
2 e 95% de ar.
Animais
e masculino fêmea ICR e ratos nus atímicos, 6-8 semanas de idade (Harlan) foram alojados em biotério no Albert Einstein College of Medicine. Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O (número de protocolo: 20130312) protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) do Albert Einstein College of Medicine. No estudo de sobrevivência, os animais foram observados diariamente. endpoints humanas foram utilizados durante este estudo: moribunda foram humanamente eutanasiados. Foram utilizados dois critérios para identificar os animais moribundos, com base em nosso protocolo de uso de animais: 1) mouse tem dificuldade em respirar, comer ou beber; 2) um rato perde ≥15% do peso corporal em 4 dias. Os ratinhos foram sacrificados por CO2 numa câmara de inalação, seguido por sangria. A anestesia foi utilizado para minimizar o desconforto durante as injecções por via intratraqueal.
injecção intratraqueal
Para injecção intratraqueal (IT), um bolus de células em suspensão ou droga foi injectada na traqueia. O procedimento utilizado para injecção Foi previamente descrita por nós [33]. Resumidamente, os ratinhos são anestesiados com um vaporizador com isoflurano a 2,5% de isoflurano entregue por 2,0 PSI de oxigénio e imobilizada utilizando um dispositivo de retenção. A boca é aberto com uma pinça e um pequeno aparelho de luz tubular ser inserido na boca para localizar a traqueia, se necessário. Uma agulha de alimentação 22 G ligada a uma seringa de 1 mL contendo a suspensão de células ou solução de fármaco é inserida na traqueia. Cerca de 3 ul de peso solução /g de corpo é então injectado por via intratraqueal. O mouse é liberado a partir do dispositivo de retenção após a conclusão do procedimento e observado até completa recuperação da anestesia.
modelos endobrônquica de xenotransplante de cancro do pulmão ortotópico
foram anestesiados ratos nus atímicos, como descrito anteriormente e humano células de cancro NSCLC em suspensão foram inoculadas com cuidado na traqueia (cerca de 2-4 x 10
6 células /ratinho), utilizando o método descrito acima. Nestes modelos, vários tumores crescem dentro das vias aéreas pulmonares. O tempo de vida dos animais correlaciona-se com a carga tumoral, que está relacionado com o tamanho do inóculo.
aerossol formulação
azacitidina (Sigma) foi dissolvido em solução salina normal estéril a 10 mg /ml direito antes da dosagem. O tamanho aerodinâmico de aerossol Aza foi determinada com o método de extrusão-precipitação usando a 7 Fase Impactor em Cascata ligado ao sistema de nebulizador PARI de acordo com as instruções do fabricante [34]. administração por aerossol. O aerossol foi gerado utilizando compressor pessoal de um PARI e sistema de nebulizador LC Star. A taxa de geração de aerossol foi de cerca de 0,25 ml /min. Um sistema de exposição somente de nariz (CH Technologies Inc. Westwood, NJ) ligada ao sistema de aerossol do PARI em uma capa química fechado foi utilizada para a administração em aerossol para os ratos. O tempo de administração de aerossol (min) (T) foi estritamente controlado. A dose de aerossol depositada nos pulmões (mg /m
2) (D) foi calculada multiplicando o tempo de exposição (min) pela taxa de inalação de aerossóis (ml /min) (R) e a concentração de droga (mg /mL) (C) conforme descrito anteriormente por nós [34], isto é, D = TRCi /W, onde I é a superfície corporal /índice de peso (mg /m
2: mg /kg) (3 para ratos) e W é peso corporal do animal (kg). Num estudo anterior, medimos taxa de inalação de aerossol em ratos, definida como o volume do líquido de aerossol depositado nos pulmões do rato em 1 min foi de cerca de 10
-4 ml /min para um ratinho de 25 g [34]. A dose desejada é depositado conseguido controlando o tempo de aerossol como T = DW /DIC. Por exemplo, o tempo de administração de aerossol para uma dose depositada de 2,5 mg /m
2 em um rato GM 25 ml usando uma solução de concentração de 10 mg /Aza é T = 2,5 × 0,025 /10
-4 × 10 × 3 = 20,83 min.
estudos de toxicidade
ratinhos ICR (6 /grupo) foram tratados com aerossol Aza a 2,5 ou 75 mg /m
2 diária × 7 dias. Um grupo de ratinhos foi tratado com IT Aza na dose máxima tolerada de 270 mg /m
2 como controlo positivo para a toxicidade pulmonar. Os pulmões foram retirados 7 dias após a última administração de aerossol. A toxicidade pulmonar foi determinada por avaliação patológica (3 pulmões /grupo), utilizando um método anteriormente descrito [34]. Além disso, também foi determinada a viabilidade das células epiteliais das vias respiratórias (3 pulmões /grupo). Em resumo, o tecido pulmonar foi digerido com Liberase (Roche) e filtrou-se para se obter uma suspensão de célula única, que foi marcada com anticorpo anti-ratinho de Ep-CAM e anticorpo secundário anti-rato de cabra fluorescência conjugada (BioLegend, San Diego, CA), e ordenados por citometria de fluxo. A percentagem de células viáveis foi determinado por exclusão de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole coloração. A toxicidade sistémica foi determinada medindo as contagens de células de sangue como um indicador de mielossupressão (a principal toxicidade de IV Aza) [35]. As amostras de sangue foram tomadas no momento da eutanásia por punção cardíaca 7 dias após o último tratamento. O número total de células brancas do sangue (WBC) foi determinado após a remoção das células vermelhas do sangue tal como anteriormente descrito [32].
estudo farmacocinético Pré-
murganhos ICR foram dados normais aerossol Aza a 2,5 mg /m
2 utilizando o método descrito acima. Em cada ponto de tempo designado (5 min, 20 min, 2 h, 6 h e 24 h), três murganhos foram sujeitos a eutanásia e os seus pulmões foram ressecados após a perfusão do ventrículo direito com uma solução salina. Azacitidina nos pulmões foi extraído e medido quantitativamente por um método relatado anteriormente utilizando o sistema de LC-MS [36]. A detecção quantitativa foi realizada por Millis Scientific Inc. A sensibilidade foi de 1 ng /ml de Aza amostra. A concentração Aza no tecido versus dados de tempo foram analisados e simulados com o melhor ajuste (o maior valor R
2) no âmbito do programa Microsoft Excel. A equação das curvas simuladas C = f (t) foram usadas para a AUC calculadas a partir de 0 a 24 horas, como AUC = ∫
0-24 f (t) dt. tempo com pico (T) e pico de concentração foram obtidos diretamente a partir da observação das curvas.
antitumoral eficácia
Dez dias após a inoculação intratraqueal de células tumorais, os ratinhos nus foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (6 ratinhos /grupo): 1) em aerossol Aza a 2,5 mg /m
2 por dia durante 7 dias, 2) em aerossol de solução salina normal (veículo) por dia, durante 7 dias, a 3) ou IV Aza a 75 mg /m
2 por dia durante 7 dias. Neste estudo de sobrevivência os animais foram observados diariamente. endpoints sem crueldade para a eutanásia (descrito anteriormente) foram utilizados durante este estudo e ratinhos moribundos eram humanamente eutanasiados e os ratos foram necropsiados. O tempo de vida aumentada (ILS%) [37] foi utilizado para avaliar a eficácia de cada agente testado.
Histologia dos xenoenxertos de cancro do pulmão
Os ratinhos do estudo de eficácia antitumoral após a morte foram necropsiados e amostras de pulmão e tumor para histologia foram recolhidas e colocadas em 10% de formalina tamponada neural. As amostras foram transferidas para 70% de etanol e submetidos à Histologia e Patologia Comparada recursos partilhada pelo Einstein para o processamento de rotina para parafina. Os tecidos foram seccionados a 5 um, corados com hematoxilina e eosina (H E), e avaliados por um conselho patologista veterinário certificado
análise do estado de metilação em tumores de pulmão
Os ratinhos portadores de pulmão ortotópico. Os tumores foram divididos em 3 grupos e tratado com aerossol Aza, veículo de aerossol, ou IV Aza. Duas semanas após o tratamento final, os ratinhos foram eutanizados e os tumores pulmonares visíveis (1~3 mm) foram ressecados, congeladas em gelo seco, e divididos em pequenos ( 0,5 mm) em pedaços por um homogeneizador Eppendorf-tubo. Cada amostra de tumor foi dividida em duas alíquotas: uma para o ensaio de metilação e outro para western blot. O estado de metilação de as regiões promotoras de genes supressores de tumores envolvidos 24 na carcinogénese pulmonar foi medida usando um método de matriz metilação qPCR pela Qiagen (SA Bioscieces) como anteriormente descrito [38].
Análise da expressão de proteína em tumores pulmonares
a segunda aliquota das amostras de tumores pulmonares foi utilizado para determinar a expressão da proteína do ETG. Foram selecionados os ETG mostrando desmetilação promotor significativa após tratamento Aza aerossol, tal como analisada por a matriz qPCR metilação para avaliação por western blot. Os tecidos congelados foram homogeneizados em tampão RIPA frio com um cocktail inibidor de protease (Sigma) utilizando um homogeneizador de mão, seguido por sonicação. As amostras de proteína foram preparadas por transferência de Western, seguindo um protocolo de rotina a partir de Life Technologies (Grand Island, NY). Os anticorpos primários contra H-caderina humana, OPCML, RASSF1A (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), e beta-actina (Santa Cruz Biotechnology) foram utilizadas para identificar as proteínas-alvo. LI-COR C dígitos Blot Scanner foi utilizado para digitalizar os borrões ocidentais; as bandas foram analisados pelo programa Image Estúdio (LI-COR). A relação de densidade de proteína alvo vs. controlo actina carregamento de cada amostra foi utilizado para apresentar os níveis de expressão de proteína de forma semi-quantitativa.
A análise estatística
As diferenças entre os diferentes grupos foram analisados por dois lados log-rank (Mantel-Cox) teste. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p 0,05.
Resultados
modelos Ortotópico NSCLC
NSCLC é uma doença do epitélio das vias aéreas como resultado da exposição crônica de substâncias cancerígenas no ar . De modo a imitar este crescimento do tumor em particular nas vias respiratórias num modelo de xenoenxerto, nós intra-traquealmente inoculadas células NSCLC humanas directamente nas vias respiratórias, e, em seguida, em comparação este modo de transplante de injecção IV das células do tumor em ratinhos nus. O exame histológico do pulmão revelou que o padrão de distribuição do tumor e o crescimento foi mais semelhante ao cancro do pulmão humano no modelo de implante de TI: a maioria da descendência células cancerosas na superfície do epitélio das vias aéreas em aproximadamente uma semana após a implantação. Decorridas 3 semanas, pequenos nódulos tumorais mucosas foram localizados dentro das vias aéreas ou a tecido pulmonar adjacente à via aérea, indicando crescimento do tumor primário dentro da via aérea e invasão para o parênquima pulmonar (Figura 1 linha de cima). O crescimento e tamanho do tumor são de linha celular e inóculo tamanho-dependente. Em nossa experiência, H460 (carcinoma de grandes células) tumores desenvolveu mais rápido do que H358 (carcinoma broncoalveolar) e muito mais rápido do que o H226 (carcinoma de células escamosas) quando inoculados TI em camundongos. Na ausência de qualquer intervenção, os ratos sucumbir aos tumores de pulmão entre os dias 40 e 102. Não houve metástases distantes identificáveis. Em contraste, quase todos visível /IV detectável implantadas células cancerosas semeadas no sistema capilar do pulmão e relativamente longe das vias respiratórias (Figura 1 linha de baixo), que se assemelha mais de perto as células tumorais metastáticas migração de outros órgãos para o pulmão. Os tumores também desenvolvido mais rapidamente do que após a implantação, e os ratos morreram geralmente nos dias 35-68 (dados não mostrados). Nossos resultados sugerem que o implante é um modelo de xenotransplante ortotópico mais apropriado para imitar NSCLC humano do que o modelo IV ou outros modelos ectópicas.
O modelo foi criado por intratraquealmente injeção de células NSCLC H460 em ratinhos nus. Top: H E coradas secções de pulmão de ratos inoculados IT no dia 35. Os tumores (T) surgem dentro das vias respiratórias e vicinalmente crescer dentro do parênquima do pulmão. Resumindo: H E coradas secções de pulmão dos ratos IV inoculados no dia 35. Os tumores surgem dentro de pequenos vasos no parênquima pulmonar. A ampliação da objetiva foi de 40X. As barras de escala eram 50 mm.
Aerosol formulação
Nós desenvolvemos uma formulação de aerossol para o agente de desmetilação protótipo, azacitidina (AZA). A formulação é composta de Aza e grau de injecção de solução salina normal estéril ou água. O poder Aza pode ser dissolvido rapidamente ( 30 s) na solução aquosa imediatamente antes da administração de aerossol. Tem sido sugerido que as gotas de aerossóis 5 um, em particular 3 mm, no depósito de diâmetro mais frequentemente nas vias respiratórias inferiores e, por conseguinte, são adequados para inalação farmacêutica de preparações de aerossol por seres humanos [39] [40]. Medimos o tamanho aerodinâmico da formulação de aerossol Aza, sob o nosso sistema de geração de aerossol com o método de extrusão-precipitação [34], e descobriu que cerca de 80% das gotículas (% em peso) foram entre 0,25-5 um de diâmetro, e cerca de 71% entre 0.25~3 uM (Figura 2). Os nossos resultados sugerem que a sobre 71~80% das gotas deve depositar nas vias respiratórias distais em seres humanos [39] [40].
T determinada com o método de extrusão-precipitação usando a 7 Fase de impactos em cascata ligados a PARI de compressor pessoal e sistema de nebulizador estrela LC. Aza solução (4 mL) foi transformado em aerossol a uma taxa de fluxo de ar de 5 L /min. As amostras de aerossóis condensadas foram recolhidas a intervalos de 3 diferentes, de 1 a 1,5 min, de 3 a 3,5 minutos, e de 5 a 5,5 min. dimensão aerodinâmica e fracção de aerossol com um intervalo de tamanho específico foram medidos e calculados de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados eram média ± desvio padrão do tamanho aerodinâmico com base no peso (barras a cheio) e de peso cumulativo (barras vazias) de 3 experiências independentes.
A toxicidade e a dose de selecção
De nosso estudo anterior, aprendemos que a concentração desmetilação eficaz de Aza para células cultivadas poderia ser 3 logs menor que o IC
50. A dose eficaz antitumoral (7,5 mg /m
2 × 3), por injecção intratraqueal de Aza no modelo de ratinho não causar toxicidade pulmonar ou toxicidade aguda sistémica detectável, e toxicidade pulmonar ocorreu apenas à dose mais elevada de 270 mg /m
2, que foi a dose máxima tolerada por injecção IV [32]. Com base nestes resultados, foi selecionada uma dose para aerossol Aza que previmos teria função de desmetilação e eficácia terapêutica sem toxicidade significativa. Os resultados indicam que a dose de aerossol seleccionada de 2,5 mg /m
2 (exposição ao aerossol de cerca de 21 minutos a um rato de 25 g) por dia, durante 7 dias, ou uma dose de injecção de bolus intratraqueal mais elevada de 75 mg /m
2 para 5 dias, não provocou qualquer toxicidade detectável pulmonar (avaliada histologicamente) ou toxicidade sistémica (medido por mielossupressão) no dia 7 após a administração final (Figura 3A, B). A toxicidade pulmonar (pneumonite) (Figura 3C) e mielossupressão (Figura 3D), apenas ocorreu quando os ratinhos receberam a dose mais elevada de injecção intravenosa ou intratraqueal de Aza a 270 mg /m
2 (a DMT de Aza intravenosa). Do mesmo modo, o aerossol Aza com a dose terapêutica seleccionada não causou qualquer morte de células epiteliais das vias aéreas determinadas por citometria de fluxo, como em relação ao controlo positivo em ratinhos tratados com a mais elevada que as doses de Aza a 270 mg /m
2 ( Figura 3E).
secções de pulmão de camundongos tratados com aerossol Aza a 2,5 mg /m
2 × 7 (a), IT Aza a 75 mg /m
2 × 7 (B), e TI Aza a 270 mg /m
2 × 5 (C), respectivamente, mostram nenhuma toxicidade em 2,5 e 75 2,5 mg /m
2, mas pneumonite a 270 mg /m
2. A ampliação da objetiva foi de 40X. As barras de escala foram de 50 uM. Branco relação de contagem de células do sangue (após vs tratamento antes do tratamento, n = 6) (D) e a percentagem de células viáveis das células epiteliais das vias respiratórias classificados (n = 6) (E), respectivamente.
eficácia terapêutica
sistémica (IV), a administração de Aza conduziu apenas eficácia limitada em doentes com NSCLC [41] [42], que tem sido retomados em nossos modelos de ratinhos experimentais de NSCLC tratados com Aza IV, (figura 4A-C). Na verdade, existe pouca evidência experimental apoio à utilização de um agente de desmetilação para inibir de forma eficaz o cancro do pulmão em modelos animais [43] [32]. Uma das possíveis razões é que esta droga muito instável não foi eficientemente entregues aos tumores do pulmão. Fomos o primeiro grupo para relatar um estudo de prova de conceito em que a administração de Aza diretamente nas vias aéreas de forma eficaz prolongou a sobrevivência de ratos com câncer de pulmão ortotópicos [32]. No estudo atual, estamos relatando os resultados usando aerossol Aza para o tratamento em xenoenxertos NSCLC ortotópicos humanos em camundongos. Um dos nossos objetivos foi demonstrar que a entrega de aerossol de Aza para o epitélio das vias aéreas pode inibir eficazmente o crescimento dos modelos NSCLC clinicamente relevantes. Além disso, estes estudos foram adicionalmente concebido para investigar se o fornecimento de aerossol do agente de desmetilação pode inibir o crescimento de tumores dentro das vias aéreas em doses baixas doses de desmetilação em vez de citotóxicos (Figura 4A-C).
Os ratinhos inoculados intratraquealmente com as linhas de células H226 (a), H358 (B), ou H460 (C) foram tratadas com aerossol Aza (linha grossa vermelho) a 2,5 mg /m
2 por dia durante 7 dias ou veículo de aerossol (azul linha fina) com o mesmo volume. O tratamento com IV Aza (linha do traço) na dose ideal de 75 mg /m
2 dia durante 5 dias foi utilizado como controle. A comparação estatística das curvas de sobrevida foi realizada com teste log-rank (Mantel-Cox). Os valores de p para H266, H358, H460 e modelos eram 0,0135, 0,0150, e 0,0719, respectivamente. Pré-farmacocinética do aerossol Aza (D). murganhos ICR foram tratados com aerossol Aza a 2,5 mg /m
2. Os dados em cada ponto de tempo foi a média ± desvio padrão da percentagem da dose administrada inicial /de pulmões de 3 ratinhos. A equação para cada curva foi simulado curva com o melhor ajuste (o mais alto R
2 Valor) no âmbito do programa Microsoft Excel.
Nossos resultados indicam que uma dose de aerossol baixo Aza prolongou significativamente o tempo de vida dos ratinhos portadores de tumores endobrônquico. Os ILS% e mediana de sobrevida foram prolongadas por 5.1 e 1.5-, (p = 0,0135), 6.4- e 1.9- (p = 0,0150) e 8.9- e 1.6- (p = 0,0719) dobre nos grupos tratados com aerossol aza utilizando uma dose de mais de 20 vezes mais baixa do que a dose utilizada no grupo de controlo de tratamento sistémico, no modelo H226, H358, H460 e, respectivamente. Estes resultados demonstram claramente que a administração em aerossol de Aza em demetilantes, doses não citotóxicas é superior à administração sistémica de Aza em termos de eficácia inibitória do crescimento do tumor.
Pré-farmacocinética
Para determinar a deposição de Aza nos pulmões realizamos estudos de pré-farmacocinéticos in vivo. Aza injectados intravenosamente com a mesma dose foi utilizada uma comparação. No primeiro ponto de tempo (3 min, o mais breve espaço de tempo possível), é possível recuperar ~89% da dose inicial de aerossol a partir do pulmão. No entanto, quando a mesma dose foi administrada por injecção sistémica, a concentração de pico nos pulmões foi de apenas 1,62% da dose inicial. A área sob a curva concentração vs. tempo (AUC
0~24 h) de aerossol Aza foi 15 vezes maior do que a IV Aza (Tabela 1). Aza dada através de duas vias mostrou um padrão de declínio similar: um rápido declínio nas primeiras 2 horas após a administração seguido por um declínio mais lento. Aerossol Aza mostrou uma taxa mais lenta de declínio na fase mais lenta, enquanto IV Aza mostrou uma concentração de pico atraso no pulmão (Figura 4D). Estes dados demonstram que a Aza aerossol tem concentração de tecido maior nos pulmões com a exposição sistémica inferior previsível do que a IV Aza.
Aerosol Aza desmetilação
Para analisar se Aza tem um efeito demetilante nos modelos NSCLC clinicamente relevantes, eu colhi os tumores de pulmão a partir dos modelos de xenoenxertos tratados com aerossol Aza ou IV Aza e determinado o estado de metilação das regiões promotoras dos genes supressores de 24 tumorais, cuja hipermetilação do promotor foi reportado como relevante no cancro do pulmão literatura. células epiteliais brônquicas normais de animais sem tratamento Aza foram utilizados como controle metilação linha de base. Os 24 ETG selecionados são APBA1, APC, CADM1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, PRDM2, RARB, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, Slit2, TCF21 , e TGFB1. Verificou-se que 11 dos 24 promotores foram hipermetilado nas amostras de tumor a partir de 3 modelos de xenoenxerto diferentes e que o aerossol Aza poderia desmetilar 5 deles (Figura 5A). No contrato, IV Aza na mesma dose não mostrou qualquer efeito demetilante (Figura 5B). Os dados mostrados na Figura 5 ilustram o nível de metilação detectado por uma matriz de metilação Q-PCR e são apresentados como% da metilação da citosina total de CG da região promotora particular.
ratinhos portadores de tumor a partir de 3 modelos ortotópicos de cancro do pulmão (H226-xeno, H358-xeno, e H460-xeno) foram tratados com aerossol Aza (a) ou IV Aza (B) a 2,5 mg /m
2 diária × 7. Os pulmões foram ressecados 14 dias após o tratamento final do tumor e nódulos maiores que 1,5 mm foram isolados para a detecção da metilação por tecnologia de matriz de qPCR em Qiagen (SA Biosciences). Os dados são% metilação da citosina total de CG da região promotora particular.
TSG re-expressão
A fim de analisar se a desmetilação na região promotora do ETG pode reativar a ETG, nós ressecados os tumores de pulmão e mediu a expressão da proteína da ETG cujos promotores foram significativamente desmetilado após o aerossol tratamento Aza. ensaio de transferência de Western foi utilizada para detectar a expressão do gene em amostras de tumor dos mesmos ratinhos utilizados no estudo desmetilação. Foram selecionados 5 ETG cujos promotores foram significativamente desmetilado após o aerossol tratamento Aza. Verificou-se que H-CAD e Rassf1 nos tumores H266, H-CAD, OPCML, e SFRP1 em tumores H358, e OPCML em tumores H460 foram reactivadas ao nível da proteína (Figura 6A e B) depois do tratamento de aerossol Aza. A expressão destes ETG foi mostrado para inibir ou retardar o desenvolvimento de cancro em vários tipos de cancros, incluindo o cancro do pulmão. Por exemplo, temos relatado antes que a perda de H-caderina em NSCLC humano está associado com tumorigenicidade [44]. A região promotora de RASSF1A também é encontrado pesadamente metilado em cancro do pulmão [45]. OPCML, um supressor tumoral ampla originalmente encontrada em cancros do ovário, encontra-se metilado em muitas linhas celulares de cancro do pulmão [46]. SFRP1 na via de sinalização Wnt é transcricionalmente silenciados por hipermetilação do promotor em NSCLC [47]. Os resultados deste estudo in vivo implicam que o tratamento com aerossol de desmetilação pode ser eficaz na inibição de tumores de pulmão endo-brônquica e lesões pré-malignas brônquicas.
ensaio de transferência de Western foi utilizada para determinar a expressão da proteína de ETG com a desmetilação promotor significativa após tratamento aerossol Aza identificado pela matriz Q-PCR metilação. As amostras de tumor foram as mesmas usadas na Figura 5; Histograma dos Western blots (B). Os filmes de fotografia de Western blot foram digitalizados ea taxa de densidade de proteína alvo vs. controle de actina de carregamento de cada amostra foi apresentado como o nível de expressão da proteína.
Discussão
O cancro do pulmão é visto como uma “doença genética” [48], [49]. Após a demonstração de que TSG desactivação e activação de oncogenes desempenhar um papel crítico na carcinogénese, os esforços terapêuticos têm progressivamente deslocado de optimizar as formas de radiação e quimioterapia não-específicos de terapia que principalmente matam as células rapidamente se dividem para desenvolver agentes que têm como alvo as alterações genéticas específicas . Evidências recentes sugerem uma relação direta entre as mudanças epigenéticas aberrantes e desenvolvimento do câncer; isso indica que o câncer é também, em parte, uma doença epigenética. Ao contrário de mudanças genéticas, alterações epigenéticas ocorrer mais cedo na progressão do cancro e são reversíveis. Portanto, uma estratégia terapêutica visando inverter alterações epigenética aberrante deve ser uma estratégia mais eficaz do que as que incidam sobre a utilização de agentes citotóxicos não-específicas, ou por segmentação defeitos genéticos irreversíveis.
De acordo com o modelo de campo de cancerização [3 ] [50], todas as células epiteliais brônquicas acumular epigenética e lesões genéticas até uma única célula adquire um fenótipo maligno e dá origem a um tumor invasivo, enquanto o restante do domínio continua a acumular epigenética e defeitos genéticos e está em risco de desenvolver outras primário cancros do pulmão (segunda primárias) [51] [52]. Durante este processo, as alterações epigenética aberrantes, tais como hipermetilação dos promotores de ETG, ocorrer antes e podem causar as seguintes alterações genéticas, e que persistam nas células tumorais através de todo o processo de carcinogénese.
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