Abstract

Fundo

O tratamento para pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas avançado (NSCLC) é muitas vezes determinada pela presença de biomarcadores que predizem a resposta a agentes de direccionamento vias moleculares específicos. Demandas para análise multiplex dos genes envolvidos na patogênese da NSCLC estão aumentando.

Métodos

Nós validado o sistema Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM), utilizando o painel de Hotspot Cancer Ion AmpliSeq e comparados os resultados com aqueles obtidos utilizando os métodos padrão-ouro, convencional PCR e sequenciamento Sanger. O método PCR cycleave foi utilizado para verificar os resultados.

Resultados e Conclusão

O Ion Torrent PGM resultou em um nível similar de precisão na identificação de várias mutações genéticas em paralelo, em comparação com a PCR convencional e seqüenciamento Sanger; No entanto, o Ion Torrent PGM era superior aos outros métodos de sequenciação em termos de aumento da facilidade de utilização, mesmo quando se toma em conta a pequena quantidade de DNA que foi obtido a partir de parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras de biópsia.

Citation: Fujita S, Masago K, Takeshita J, Okuda C, Otsuka K, Hata A, et al. (2015) Validação de uma Plataforma Sequencing Ion Torrent para a detecção do gene Mutações em Biópsia amostras de pacientes com não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10.1371 /journal.pone.0130219

Editor do Academic: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recebido: 28 de dezembro de 2014; Aceito: 17 de maio de 2015; Publicação: 15 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fujita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os dados estão disponíveis da Comissão de IBRI Institucional Data Access /Ética devido a restrições éticas relacionadas com a privacidade do paciente. Em caso de solicitação de dados, os conselheiros irão decidir se deve ou não liberar a informação

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o tratamento para pacientes com câncer avançado de pulmão não pequenas células (CPNPC) é muitas vezes determinada, como é o caso de outros cancros humanos, pela presença de biomarcadores que predizem a resposta a agentes de direccionamento vias moleculares específicos em células malignas. resposta favorável à tirosina-quinase (TK) inibidores da segmentação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), em casos de NSCLC em que as mutações estão presentes no gene de EGFR, ilustram a importância da identificação de biomarcadores moleculares, e várias dessas alterações oncogénicas tem sido relatados até agora [1-3]. Estas alterações moleculares podem ser divididos em duas categorias; rearranjos genéticos que exigem análise e /ou de fluorescência baseada em RNA hibridização in situ para a sua identificação, e mutações genéticas (incluindo pequenos eventos de inserção ou supressão) que são investigadas pela análise baseada em DNA. As mutações foram descobertas em vários genes, além de

EGFR

que estão envolvidos na patogênese da NSCLC (ou seja,

KRAS

,

ARN

,

HER2

,

AKT1

,

BRAF

,

PIC3CA

) e a demanda de análise multiplex destes genes está aumentando.

as únicas amostras de tecido que são normalmente disponível para análise mutacional no contexto clínico são amostras de biópsia obtidos transbronchially ou transcutânea. Estas amostras tendem a ser pequenos e são submetidos ao processo de fixação em formalina. A detecção de mutações através da realização de PCR e sequenciação de Sanger em paralelo é demorado e requer uma quantidade substancial de ADN, que é frequentemente indisponível devido ao pequeno tamanho da amostra. A técnica desenvolvida recentemente, massivamente paralela sequenciamento de DNA, permite a detecção rápida, sensível e altamente específico de mutações genéticas em um único ensaio, a um custo razoável.

Aqui, usamos o sistema Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (Thermo Fisher Scientific) em conjunto com o ponto de acesso AmpliSeq Painel Ion cancro, versão 2 e comparados os resultados com os obtidos pelos métodos padrão de ouro para a análise mutacional, convencional por PCR e sequenciação de Sanger. Além disso, um método de PCR altamente sensível, o método de PCR cycleave, foi empregado, concentrando-se em mutações no gene de EGFR e KRAS especificamente, para verificar os resultados obtidos por ambos os PCR convencional e o sistema de iões de Torrent PGM.

Métodos

Ética

Este estudo foi aprovado pelo Instituto de Pesquisa Biomédica e revisão Institucional Conselho de Administração da Inovação Hospital. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. O estudo foi conduzido de acordo com os princípios éticos da Declaração de Helsinki.

As informações do paciente

amostras tumorais utilizadas no estudo foram coletados pelo Instituto de Investigação Biomédica e Inovação Hospital, Japão. De acordo com as diretrizes atuais, todas as amostras tumorais FFPE de pacientes com câncer de pulmão de não-pequenas células com genótipo desconhecido (

EGFR

e

KRAS

) foram analisados ​​por sequenciação de PCR e Sanger convencional para determinar tratamento adicional. Como comparação, um total de 21 amostras de tumor foi analisado com o sistema Ion PGM eo método de PCR cycleave

genes analisados ​​

EGFR

:. Exon 19 exclusão (incluindo E746 -A750), Exon 21 L858R, Exon 21 L861Q

KRAS

: Exon 2 G12X

amostras de tecido e isolamentos de DNA

Apenas as amostras de biópsia que revelou NSCLC patologicamente foram analisados. Em todos os casos, por broncoscopia ou biópsia de agulha núcleo biópsia foi realizado (Figura 1A e 1B). Uma agulha de calibre 21 dedicado foi usada para obter núcleo histológico. histológicos núcleos foram fixados com formalina e utilizado para o diagnóstico patológico. Após o diagnóstico histopatológico, as amostras de FFPE (1 a 3 amostras de seção 5 mícrons de espessura) foram desparafinados com xileno. O ADN foi isolado a partir das secções utilizando o kit QIAamp DNA Mini (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Nós medimos a concentração de ADN com NanoDrop Lite Espectrofotômetro (Thermo Fisher Scientific).

(A) embebidos em parafina espécime fixadas em formalina. (B) Uma amostra de seção de 5 mícrons de espessura.

PCR convencional e seqüenciamento Sanger

Os exons 18 a 21 foram amplificados por PCR e analisados. Iniciadores e condições de ciclismo para a amplificação PCR foram modificados a partir de métodos publicados anteriormente [4]. As reacções de sequenciação foram sujeitas a electroforese num ABI PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). A sequenciação directa dos produtos de PCR foi realizada em ambos os sentidos e anti-sentidos.

O método de PCR cycleave

Utilizou-se uma sonda de ARN-ADN quimérica de ADN marcada com um corante fluorescente e extintor em cada uma das extremidades [5]. Uma sequência de ARN das sondas corresponde à do tipo selvagem e de mutação pontual (Exão 21 L858R, Exão 21 L861Q) marcado com ROX e FMA, respectivamente. Quando as moléculas mutantes estão presentes na amostra e o ADN amplificado por PCR gera um híbrido completo com a porção de ARN da sonda mutante, RNase-H digere a sonda no heteroduplexes de ARN-ADN em duas peças, o que leva a um aumento significativo da intensidade de fluorescência por separação do corante fluorescente a partir do quencher.

Para detectar a deleção do exão 19 do gene de EGFR, foi utilizada análise de fragmentos comum. A amostra de ADN foi amplificado com um conjunto de primers marcados com FAM e produtos de PCR foram sujeitos a electroforese. PCR amplificado o segmento mais curto de DNA, criando um novo pico em um electrofograma quando uma mutação de deleção estava presente [5].

Ion Torrent PGM Biblioteca Preparação e Sequenciamento

Um Ion Torrent adaptador ligado biblioteca foi gerado seguinte Ion AmpliSeq biblioteca Kit 2.0 protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5; MAN0006735). Resumidamente, 50 ng amplicons pool estavam reparado nas extremidades, e Ion Torrent adaptadores P1 e A foram ligados com ligase de DNA. A seguir à purificação do grânulo AMPure (Beckman Coulter), a concentração e tamanho da biblioteca foram determinadas utilizando o sistema de Life Technologies StepOne (Thermo Fisher Scientific) e ião Biblioteca TaqMan Quantificação Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).

emulsão Amostra PCR, quebra de emulsão, e o enriquecimento foram realizadas utilizando o Ion PGM IC 200 Kit (Thermo Fisher Scientific), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, uma concentração de entrada de um molde de ADN de cópia /Iões Esfera Partículas (FSI) foi adicionado à emulsão de PCR Master Mix e a emulsão foi gerado utilizando o Chef Ion (Thermo Fisher Scientific). ISPs Template-positivos foram enriquecidos e sequenciamento foi realizado usando 314 fichas BC sobre a Ion Torrent PGM durante 65 ciclos e barcoding foi realizada utilizando o kit Ion DNA Barcoding (Thermo Fisher Scientific).

Variant chamando

os dados dos PGM corridas foram inicialmente processados ​​usando o software gasoduto específico da plataforma Ion Torrent, Torrent suite para gerar sequência lê, aparar as sequências de adaptador, filtrar e remover pobres sinal perfil lê. variante inicial chamando a partir dos dados de sequenciação Ion AmpliSeq foi gerado usando v4.0 Torrent Software Suite com um plug-in ” programa variante chamador “. Para eliminar vocação de base errônea, foram utilizados três etapas de filtragem para gerar chamada variante final. O primeiro filtro é estabelecida em uma profundidade média de cobertura total de 100, uma cobertura de cada variante de 20, e P-valor 0,01. O segundo filtro foi empregado por exame visual de mutações usando software Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv) ou CLC Genomics Workbench versão 7.5.1 (Qiagen), bem como através da filtragem de possíveis erros específicos de cadeia ; ou seja, uma mutação foi detectada apenas em tanto o ” plus “ou” “menos” vertente, mas não em ambos os filamentos de DNA.

Resultados e Discussão

Um total de 21 amostras de tumores (10 a partir de biópsia transbrônquica broncoscopia, 6 biópsia do tumor guiada por CT e 5-agulha núcleo biópsia de linfonodo superficial) foram analisados. Um valor médio da concentração de ADN foi extraído de 115,2 ng /mL (29,3 mínimo, máximo 786,1) e uma quantidade apropriada de ADN foi utilizada para análise. Como mostrado na Tabela 1 e na Figura 2, os resultados das análises de mutação do gene obtido por Sanger de sequenciação foram idênticas em todos os casos para os derivados de análises que utilizam o sistema de iões de PGM. No que diz respeito a EGFR, os resultados analíticos obtidos por sequenciação de Sanger combinado completamente os obtidos pelo método cycleave e o sistema de iões de PGM. Nenhum dos tumores examinados tinham mutações em ambos o domínio TK EGFR e o gene KRAS.

(A) mutação KRAS (G12V) identificado por tecnologia cycleave. (B) mutação do EGFR (exão 19 deleção), identificado por análise da mutação KRAS fragmento (C) (G12V) foi detectado com a tecnologia de iões de PGM. C a uma transversão foi identificado. (D) mutação EGFR (exão 19 supressão) foi detectado com a tecnologia Ion PGM.

A segunda mutação EGFR em que a metionina é substituído por treonina na posição 790 (T790M) se correlaciona com a resistência adquirida para inibidores da tirosina-cinase EGFR [6]. Na nossa série, 3 pacientes foram submetidos a uma segunda biópsia após a progressão no tratamento de inibidores da tirosina-cinase EGFR. sequência de ADN destas amostras de biópsia por sequenciação de Sanger convencional apresentou mutação T790M em dois casos. Sequenciamento utilizando o Ion PGM revelou mutação T790M também em dois casos. Além disso, entre os 900 leituras obtidas, a mutação T790M foi observada em 53 lê-se (5,9%) no terceiro paciente. Embora o número de leituras detectada estava abaixo do nível de limiar, é possível que o surgimento de T790M é a principal causa de resistência ao EGFR tratamento inibidor da tirosina quinase, neste caso.

Apesar do pequeno número de casos analisados, os resultados sugerem que o Ion Torrent PGM é um procedimento praticável e sensível que seria adequado na prática clínica, quando apenas uma pequena quantidade de tecido maligno está disponível e analisa multiplex de genes são necessários para o planeamento do tratamento. Para além da investigação de mutações no gene aqui realizados, informação sobre os rearranjos genéticos deve ser integrado no conhecimento actual para melhorar o tratamento de NSCLC e facilitar ainda mais estudo.