Abstract
Nós estudamos o potencial benéfico da dimetylthiourea (DMTU), um OH
• caçador radical e N-acetilcisteína (NAC), um precursor da glutationa /H
2O
2 limpador contra nanopartículas de dióxido de titânio (TiO
2-PN) e nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) induzida cito genotoxicidade no cancro do pulmão humano células-A549 cultivadas. Cytogenotoxicity foi induzida por exposição das células a concentrações seleccionadas (10 e 50 ug /ml) de qualquer uma das TiO
2-NPs ou MWCNTs durante 24 h. Os efeitos anti-cytogenotoxicity de DMTU e NAC foi estudada em dois grupos, ou seja, o tratamento de 30 minutos antes da agressão tóxica (exposição de curto prazo), enquanto o outro grupo recebeu DMTU e NAC tratamento durante a exposição nanopartículas, ou seja, 24 h (de longo prazo exposição). As investigações foram realizadas para a viabilidade celular, a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), micronúcleos (MN), e expressão de marcadores de estresse oxidativo (HSP27, CYP2E1), genotoxicidade (P
53) e CYP2E1 nitrosodimethylamine- n- dependentes desmetilase (NDMA-d) actividade. Em geral, o tratamento de ambos DMTU e NAC foi encontrado para ser eficaz contra significativamente TiO
2-NPs e MWCNTs cytogenotoxicity induzida em células A549. O tratamento a longo prazo do DMTU e NAC durante a insultos tóxicos mostrou uma melhor prevenção de pré-tratamento de curto prazo. Embora, as células responderam significativamente a ambos DMTU e NAC, mas as respostas eram específicos química. Em parte, TiO
2-PN respostas tóxicas induzidas foram mediadas através de OH
• geração de radicais e redução do sistema de defesa antioxidante. Enquanto no caso de MWCNTs, efeitos adversos eram principalmente devido à alteração /dificultando o sistema antioxidante enzimática. Os dados indicam a aplicabilidade do pulmão humano câncer de células-A549 como uma ferramenta de pré-triagem para identificar o alvo potencial profilático e terapêutico de moléculas de drogas candidatas contra nanopartículas induzida danos celulares
Citation:. Srivastava RK, Rahman Q, Kashyap MP, Lohani M, Pant AB (2011) AMELIORATIVOS Efeitos da Dimetylthiourea e N-Acetilcisteína em nanopartículas induzida Cyto-genotoxicidade em Câncer de pulmão Humano células-A549. PLoS ONE 6 (9): e25767. doi: 10.1371 /journal.pone.0025767
editor: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 10 de maio de 2011; Aceito: 12 de setembro de 2011; Publicado: September 29, 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Srivastava, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O apoio financeiro foi recebido do Conselho de Desenvolvimento Científico Industrial Research, Nova Deli, (SIP-08). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
interações biológicas intracelulares de nanopartículas de óxido de metal e os nanotubos de carbono têm sido mostrados na literatura e marcado alarmante para a segurança [1], [2]. nanopartículas de dióxido de titânio (TiO
2 -NPs) e nanotubos de carbono multicamadas (MWCNTs) são conhecidas para induzir efeitos citotóxicos e genotóxicos respostas tanto em
in vitro
[3], [4] [5], e eu
n vivo
modelos [6], [7]. Em geral, a produção de ROS mediada estresse oxidativo e o estado antioxidante auditivos tem sido sugerida como causa importante de citotoxicidade e genotoxicidade de nanopartículas [8], [9], [10]. Além disso, o número de factores, incluindo o tamanho de partícula, composição química e cargas de superfície, etc. também desempenhar um papel para determinar o grau de toxicidade de nanopartículas [11], [12], [13], [14]. Nanopartículas induzir a geração de ROS pela ativação de enzimas do citocromo P450 família [15], [16] e /ou por perturbar função da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial [9]. A associação de geração de ROS com níveis induzidos de proteína de choque térmico 27 (HSP27), citocromo P450 2E1 (CYP2E1) e P
53 foram estabelecidos como marcadores de estresse oxidativo induzido quimicamente, apoptose e genotoxicidade [10], [17] , [18].
Uma das maneiras eficazes para evitar a lesão celular ROS mediada é dietético ou medicamentos aumento de varredores de radicais livres. Por isso, têm sido feitas tentativas para evitar /restaurar as nanopartículas induzir cytogenotoxicity utilizando captadores de radicais, tais como desferoxamine [8], antioxidantes – resveratrol [19] e N-acetlylcysteine (NAC) [4], [20], [21], na variedade de sistemas de células de origem humana e animal. No entanto, as alterações nos níveis de expressão (ARNm e proteína) de marcadores envolvidos no stress oxidativo e genotoxicidade em células de cultura expostas a nanopartículas não foram estudados até agora. Assim, os presentes inquéritos foram teve como objetivo estudar as idéias mecanicistas de TiO
2-PN e MWCNTs induzidas estresse oxidativo e cito-genotoxicidade no cancro do pulmão de células A549 humana e efeito benéfico de radical livre caçador e antioxidantes DMTU e NAC, respectivamente. DMTU, foi selecionada no estudo, uma vez que este thiogroup contendo composto tem grande reactividade para com OH
• radicais devido às características dadores de electrões extremamente favoráveis do grupo sulfidrila; Assim, conhecido como potencial de captador de radicais hidroxilo [22]. O outro composto utilizado ou seja, a NAC é um precursor de glutationa (GSH), é um antioxidante celulares importantes e conhecida por desempenhar um papel fundamental na protecção das células contra o stress oxidativo através da inibição da formação de H
2O
2 sob condições in vitro [23]. NAC também é conhecida para melhorar o nível de GSH celular por dirigir cistina para a via de síntese de GSH, porque cistina é um precursor comum de ambos NAC e GSH [24].
Resultados
Caracterização das nanopartículas
o diâmetro hidrodinâmico do TiO
2-NPs e MWCNTs suspensão em meio completo foram 417,7 nm e 401,3 nm, e zeta (Ç) potenciais foram calculados como (-) 7,83 mV e (-) 14,4 mV, respectivamente (Figura 1-a (I, II), b (I, II)). Os estudos TEM mostram a gama de tamanho de partícula de 5-20 nm de diâmetro e 300-2000 nm de comprimento para MWCNTs (dados já foram publicados por nós) [15]. TiO
2-PN (anatase) utilizados no estudo foram de 99,7% de pureza e o tamanho das partículas varia entre 5-25 nm, em estudos TEM. As partículas foram aderidos à superfície da célula entre as microvilosidades e pseudopodes, quando incubadas durante 24 h, subsequentemente internalizados em pequenos vacúolos no citoplasma cortical (Figura 2-A b). Nós não observamos nenhuma mudança significativa na partícula hidrodinâmico (TiO
2-NPs e MWCNTs) tamanho na presença de DMTU e NAC durante a medição DLS. Após a esterilização, a endotoxina não foi detectada em ambas as nanopartículas por ensaio de LAL. O limite de detecção foi de 0,03 EU /ml
distribuição de tamanho e potencial zeta de TiO
2-PN (a, I II). E MWCNTs (b, I II) foram determinados utilizando dinâmica espalhamento de luz e espalhamento de luz análise de fase (PALS) num Zetasizer Nano-ZS, Modelo ZEN3600.
microfotografias TEM mostrando internalização de TiO
2-PN (a, b) no cancro do pulmão humano células A549. As setas indicam as nanopartículas foram aderidos à superfície da célula entre as microvilosidades e pseudopodes dentro de poucos minutos de tempo de (a) e subsequentemente internalizados em pequenos vacúolos profundas no citoplasma, quando observada às 24 h (b).
restauração da viabilidade celular
a tendência para a restauração da viabilidade celular foi semelhante para os três ensaios utilizados no estudo. No entanto, o ensaio de MTT foi encontrada para ser mais sensível quando comparados com os outros ensaios viz., NRU e libertado LDH. Os resultados de DMTU ou NAC restauração induzida na percentagem de viabilidade de células A549 expostos a nanopartículas são resumidos na Figura 3 um b. A curto prazo pré-tratamento (30 minutos) de DMTU mostra uma protecção significativa na viabilidade das células A-549 expostos para TiO
2-PN (10, 50 ug /ml), ao passo que a resposta de NAC pré-tratamento não foi significativa contra TiO
2-NP induzida perda de viabilidade celular. As células que receberam a longo prazo (24 h) a exposição de DMTU (10 mM) ou NAC (2 mM) juntamente com TiO
2-PN (10, 50 ug /ml) a exposição demonstraram mais ou menos semelhante magnitude e tendências como observado na exposição a curto prazo (Figura 3 a). Contemporary a isto, exposição a curto prazo de NAC foi encontrado para ser significativamente eficaz contra a exposição MWCNTs, ao passo que, DMTU não foi eficaz. A exposição a longo prazo de ambos NAC e DMTU mostrou tendência semelhante e eficácia contra a exposição MWCNTs, como foi no caso de exposição a curto prazo (Figura 3 b). Na exposição termo geral, longa de DMTU e NAC tem mostrado pouco melhor restauração da viabilidade celular de curto prazo.
(a) No grupo de curto prazo, as células foram pré-tratadas com qualquer um dos DMTU ou NAC por 30 minutos seguido de exposição do TiO
2-PN (10 50 ug /ml) durante 24 h. No grupo a longo prazo, as células estavam recebendo uma co-exposição (24 h) de DMTU /NAC e de TiO
2-PN (10 50 ug /ml). As células foram então analisadas para DMTU /NAC restauração mediada na viabilidade celular reduzida devido a TiO
exposição de 2 PN. Todos os valores são média ± S.E.. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs TiO
exposição 2-PN). ## P 0,01 (TiO exposição
2-NPs Vs tratamento DMTU /NAC). (B) No grupo de curto prazo, as células foram pré-tratadas com um dos DMTU ou NAC durante 30 minutos, seguida por exposição de MWCNTs (10 50 ug /ml) durante 24 h. No grupo a longo prazo, as células estavam recebendo uma co-exposição (24 h) de DMTU /NAC e MWCNTs (10 50 ug /ml). As células foram então analisadas para DMTU /NAC restauração mediada na viabilidade celular reduzida devido a exposição MWCNTs. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs exposição MWCNTs). ## P . (Exposição MWCNTs Vs tratamento DMTU /NAC) 0.01
geração de ROS
O estatisticamente significativa (p 0,01) foi observada geração de ROS em células A549 que recebem TiO
2-NPs e MWCNTs (10 50 ug /ml) durante 24 h. Tanto o tratamento de DMTU e NAC curto prazo (30 minutos) e a longo prazo (24 h) foi encontrado para ser eficaz de forma significativa (p 0,01) na redução dos níveis de ROS. No entanto, a magnitude da redução de níveis de ROS foi maior no tratamento de longo prazo. O tratamento a longo prazo de NAC foi mais eficaz do que DMTU (Figura 4-A b). Nós não observamos qualquer aumento na intensidade de fluorescência devido à nanopartículas em suspensão no meio de cultura (sem células). Da mesma forma, nenhum aumento de fluorescência foi observada com a DCFH-DA corante por si só no meio de cultura (sem células). As observações indicam que as alterações na intensidade de fluorescência foram causa de intracelular ROS gerado apenas em células A549.
Geração
ROS foi detectada usando ‘2, 7-diacetato de dichlorofluorescin corante (DCFH-DA). (A) No grupo de curto prazo, as células foram pré-tratadas com um dos DMTU ou NAC durante 30 minutos, seguido de exposição do TiO
2-PN (10 50 ug /ml) durante 24 h. No grupo a longo prazo, as células estavam recebendo uma co-exposição (24 h) de DMTU /NAC e de TiO
2-PN (10 50 ug /ml). As células foram então analisadas para DMTU /NAC restauração mediada nos níveis de ROS intracelular, que foi induzida por exposição a do TiO
2-PN. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs TiO
exposição 2-PN). ## P 0,01 (TiO exposição
2-NPs Vs tratamento DMTU /NAC). O grupo controle positivo foi constituído por células A549 pré-tratada (1h) com 500 mm de H
2O
2. (B) No grupo de curto prazo, as células foram pré-tratadas com um dos DMTU ou NAC durante 30 minutos, seguida por exposição de MWCNTs (10 50 ug /ml) durante 24 h. No grupo a longo prazo, as células estavam recebendo uma co-exposição (24 h) de DMTU /NAC e MWCNTs (10 50 ug /ml). As células foram então analisadas para DMTU /NAC restauração mediada nos níveis de ROS intracelular, que foi induzida pela exposição de MWCNTs. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs exposição MWCNTs). ## P 0,01 (exposição MWCNTs Vs tratamento DMTU /NAC). O grupo controle positivo foi constituído por células A549 pré-tratada (1h) com 500 mm de H
2O
2.
Citocinese bloqueada ensaio de micronúcleos (CBMN-ensaio)
Os resultados de formação de MN em células A549 são mostrados na Figura 5-a b. A exposição de ambos TiO
2 e induz MWCNTs número significativo de MN em células A549 em 24 h de exposição. No caso de TiO
2-PN, a resposta era dependente da dose isto é, (12,66 ± 0,66 17,33 ± 0,33) a 10 50 ug /ml, respectivamente, enquanto que a dose mais baixa de MWCNTs (10 ug /ml) induziu mais MN (16,00 ± 0,57) do que a dose mais elevada (50 ug /mL), isto é (13,66 ± 0,33). Ambos DMTU e NAC foi encontrado para ser eficaz na redução MN significativamente (p 0,01). A resposta do DMTU foi maior contra TiO
2-NPs de MWCNTs, ao passo que, NAC tem mostrado melhores resultados contra MWCNTs. No entanto, o efeito de ambos DMTU e NAC foram estatisticamente significativas (p 0,01), mas os valores foram ainda maiores do que as células de controlo não expostas ao longo das concentrações de exposição (Figura 5 A B). A diferença na indução de MN foi insignificante entre eliminador de tratados contra grupos não-tratados sequestrante
(a) As células foram expostas ao TiO
2-PN (10 50 ug /ml)., Com ou sem DMTU (10 mM) e NAC (2 mM) durante 24 h. metanossulfonato de etilo (6 mM) foi utilizado como um controlo positivo. Cada ponto de dados representa a média de três lâminas. Um total de 1000 células nucleadas-bi (BN) com citoplasma bem definida foram marcados. conjuntos paralelos também foram realizadas sob condições idênticas, expondo as células somente com qualquer uma das DMTU ou NAC. Este grupo foi utilizado para comparar os dados entre sequestrante tratado vs células não tratadas limpador. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs TiO
exposição 2-PN). ## P 0,01 (TiO exposição
2-NPs Vs tratamento DMTU /NAC). (B) As células foram expostas a MWCNTs (10 50 ug /ml) com ou sem DMTU (10 mM) e NAC (2 mM) durante 24 h. metanossulfonato de etilo (6 mM) foi utilizado como um controlo positivo. Cada ponto de dados representa a média de três lâminas. Um total de 1000 células nucleadas-bi (BN) com citoplasma bem definida foram marcados. conjuntos paralelos também foram realizadas sob condições idênticas, expondo as células somente com qualquer uma das DMTU ou NAC. Este grupo foi utilizado para comparar os dados entre sequestrante tratado vs células não tratadas limpador. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências
** P . 0,01 (controle não exposto Vs exposição MWCNTs). ## P . (Exposição MWCNTs Vs tratamento DMTU /NAC) 0.01
Western blot análise
Em geral, a exposição de ambos (TiO
2-NPs MWCNTs ) a 50 ug /ml induzir a regulação significativa de proteínas marcadoras de genotoxicidade e estresse oxidativo, ou seja, P
53 (3,61 ± 0,40 . 3,24 ± 0,26 vezes), CYP2E1 (2,62 ± 0,30 2,02 ± 0,39 vezes) , HSP27 (1,69 ± 0,47 2,56 ± 0,34 vezes), respectivamente. Os níveis de expressão de P
de proteína 53 foram encontrados para ser reduzido de forma significativa (p 0,01) a seguir a tratamento de ambos DMTU e NAC. No entanto, a resposta foi mais intensa em células A549 que recebem a exposição do TiO
2-PN. Em caso de CYP2E1, as células expostas a MWCNTs mostrado melhor capacidade de resposta ao DMTU e NAC com efeitos mais intensos de NAC. Contrariamente a isto, o efeito de DMTU não foi significativa nas células expostas a TiO
2-PN. No entanto, tanto DMTU e NAC não podia restaurar a expressão da proteína HSP27 em células expostas de forma significativa para o TiO
2-PN /MWCNTs (Figura 6 um b).
A (i) Avaliação da alteração expressão das proteínas envolvidas na indução do stress oxidativo (HSP27 e CYP2E1) e genotoxicidade (P
53) em células A549 expostos ao TiO
2-PN (50 ug /ml) durante 24 h. GAPDH foi utilizada como controlo interno para normalizar os dados. Lane (1) de controlo não exposta (2) 50,0 ug /ml de TiO
2-PN (3) 50,0 ug /ml de TiO
2-PN + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml de TiO
2-PN + NAC (2 mM). (II) A quantificação relativa (dobre mudança) de proteínas envolvidas na indução de estresse oxidativo (HSP27 e CYP2E1) e genotoxicidade (P
53) em células A549 expostos ao TiO
2-NPs por 24h. GAPDH foi utilizada como controlo interno para normalizar os dados. A quantificação foi realizada em sistema de documentação de gel (Alpha Innotech, EUA) com a ajuda de AlphaEase
TM FC StandAlone V.4.0 software. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs TiO
exposição 2-PN). ## P 0,01 (TiO exposição
2-NPs Vs tratamento DMTU /NAC). b (i) Avaliação da expressão alterados de proteínas envolvidas na indução do stress oxidativo (HSP27 e CYP2E1) e genotoxicidade (P
53) em células A549 expostos a MWCNTs (50 ug /ml) durante 24 h. GAPDH foi utilizada como controlo interno para normalizar os dados. Lane (1) de controlo não exposta (2) 50,0 pg /ml MWCNTs (3) 50,0 ug /ml + MWCNTs DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml MWCNTs + NAC (2 mM). (III) A quantificação relativa (dobre mudança) de proteínas envolvidas na indução de estresse oxidativo (HSP27 e CYP2E1) e genotoxicidade (P
53) em células A549 expostos a MWCNTs para 24h. GAPDH foi utilizada como controlo interno para normalizar os dados. A quantificação foi realizada em sistema de documentação de gel (Alpha Innotech, EUA) com a ajuda de AlphaEase
TM FC StandAlone V.4.0 software. Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs exposição MWCNTs). ## P (exposição MWCNTs Vs tratamento DMTU /NAC) 0.01
atividade CYP2E1 dependente n- nitrosodimethylamine-demethylase (NDMA-d)
Os dados do CYP2E1 atividade catalítica dependente. são apresentados na Figura 7. a actividade catalítica mostra uma tendência similar como foi observado na análise de western blot para a expressão da proteína para CYP2E1 em células expostas a TiO
2-NPs e MWCNTs (50 ug /ml). Estas mudanças foram significativas (p 0,001), quando comparado com o grupo de controlo não exposto, bem como de células tratadas com DMTU /NAC única isto é, 7,54 + 0,86 + 1,20 e 10,96 nmol /mg de proteína, respectivamente. Embora, ambas as sequestrantes mostram reversão significativa da actividade enzimática em células expostas a TiO2-NPs e MWCNTs, mas a eficácia foi o mais magnitude no caso do tratamento de NAC. Tratamento de DMTU ou NAC isoladamente não apresentou qualquer efeito sobre a atividade enzimática quando comparado com o grupo controle não exposto. Etanol (10 mM), um conhecido indutor de CYP2E1 mostra altamente significativa (p 0,001). Aumentar a actividade NDMA-d (Figura 7)
Todos os valores são média ± E.P. de 3 experiências.
** P 0,01 (controle não exposto Vs TiO
2 -NPs /exposição MWCNTs). ## P 0,01 (TiO
2 PN /MWCNTs exposição Vs tratamento DMTU /NAC). A actividade específica é expressa em nmol HCHO proteína /min /mg. Etanol (100 mM), um indutor conhecido da CYP2E1, foi utilizado como controle positivo.
Discussão
espécies reativas de oxigênio (ROS) estresse oxidativo mediado foi sugerido um entre a chave eventos desencadeia a nanopartículas induzida cito-genotoxicidade [25]. Observou-se também uma produção ROS dependente da dose em células A549 seja exposto a TiO
2-PN ou MWCNTs a 10 50 ug /ml durante 24 h. O ROS mais importante na sinalização redox é pensado para ser H
2O
2 /OH
• radical. Assim, para confirmar a sinalização ROS redox, as células foram expostas a H
2O
2 (500 uM) durante 1 h sob condições idênticas, que foi serviram como controlo positivo também. H
2O
2 respostas semelhantes induzidas para a produção de ROS, como no caso das nanopartículas, sugerindo implicação de vias de transdução de sinal similares. A redução da ROS com pre /co-tratamento de DMTU e NAC em células A549, ainda confirmar o envolvimento de ROS no processo de toxicidade e está de acordo com estudos anteriores [4], [8]. NAC, um precursor de glutationa (GSH), é um antioxidante importante celulares e desempenha um papel importante na protecção das células contra o stress oxidativo e inibe a formação de H
2O
2
In vitro
[ ,,,0],23], [26]. NAC tratamento provoca a melhoria do nível de GSH celular por dirigir cistina em que a via de síntese de GSH, porque cistina é um precursor comum de ambos NAC e GSH [24]. Enquanto a grande reatividade da molécula DMTU direção OH
• é devido às características dadores de electrões extremamente favoráveis do grupo sulfidrila [22].
No presente estudo, a citotoxicidade de TiO
2-NPs e MWCNTs verificou-se ser da dose e dependente do tempo. No caso de TiO
2-PN, o tratamento com DMTU e NAC reduz o efeito citotóxico, sugerindo que tanto o OH
• radicais (ROS) geração e redução no sistema de defesa antioxidante são responsáveis pela diminuição da viabilidade. Enquanto no caso de MWCNTs a citotoxicidade foi significativamente reduzida por tratamento com NAC. Vale ressaltar que DMTU, um limpador radical hidroxila mais específico, não foi eficaz na eliminação de radicais hidroxila em nossas medições. Este, simplifica que MWCNTs provoca toxicidade, alterando /hampaering do sistema antioxidante enzimático e não induzindo diretamente OH
• radicais nas células A549. Os resultados sugerem que a fracção de ROS que é inibido por NAC, mas não por DMTU, poderia ser uma espécie diferente de radicais livres e também a diferença no comportamento de ambos (TiO
2 e MWCNTs) pode ser devido à sua diferença na estrutura de superfície [27], length [28], e na presença de catalisador de metal [29] etc. Nós também relataram anteriormente que MWCNTs reduziu significativamente os níveis de glutationa em dose eo modo dependente do tempo [15]. Postulou-se que a perda de GSH podem comprometer as defesas antioxidantes celulares e levar à indução de ROS [30].
Além disso, o tratamento com NAC fornecida suficientemente forte sistema de defesa antioxidante, resultando o aumento da viabilidade celular de células expostas ao TiO
2 e MWCNTs. Semelhante tipo de efeito foi observado com epiteliais do pulmão humano e do epitélio das vias aéreas (2-HEP) A linha de células, quando co-tratados com antioxidante e NAC Resverartrol contra ZnO e nanopartulas de CuO, respectivamente [19], [21].
ambos os tipos de nanoparticulas (TiO
2 e MWCNTs) são conhecidos por induzir micronúcleos (MN) em forma dependente da dose, o que é bem biomarcador definido para o ensaio de genotoxicidade [31]. As nossas descobertas de indução MN são bem consistente com estudos anteriores usando nano-TiO
2 em células linfoblastóides [32], e em células epiteliais do pulmão de rato expostos a MWCNTs [33]. O efeito protector de DMTU (10 mM) e NAC (2 mM) na indução de MN pode ser observado claramente no âmbito do presente investigações (Figura 5 A B). Nossos estudos MN reforçar o papel do estresse oxidativo na genotoxicidade induzida por TiO
2-NPs e MWCNTs em células A549. Nos crocidoloite investigação e de amianto crisotila fibras anteriores também foram relatados para induzir MN, que diminuem significativamente após o tratamento com NAL, um sal sintetizado de N-acetilcisteína (0,2 mM) e DMTU (20 mM) em células mesoteliais humanos [34].
nos presentes inquéritos, análise de western blot foi feito para avaliar a expressão alterada de proteínas como a HSP27 e CYP2E1, indicadores de estresse oxidativo e P
53 como um biomarcador de genotoxicidade. As proteínas de choque térmico (HSPs) compreendem várias famílias diferentes de proteínas que são induzidos em resposta a uma grande variedade de insultos fisiológicas e ambientais. Uma dessas proteínas é HSP27, que é altamente induzida durante condições de stress. HSP27 é conhecida para interferir com os principais componentes de ROS induzidas via de sinalização apoptótica, e está correlacionada com a sobrevivência aumentada em resposta a estímulos citotóxicos [18]. O nosso estudo revela que a concentração de 50 ug /ml, ambas as nanopartículas (TiO
2-PN e MWCNTs) induziu a expressão de HSP27 significativa, sugerindo que as células eram sob stress. O tratamento da DMTU e NAC não mostraram alterações significativas nas nanopartículas expressão de HSP27 induzidas. Ele indica que a utilização de células ainda estão sob condições de estresse ou DMTU e NAC reduzir o estresse oxidativo por alguma outra rota sob nossas condições experimentais. Outros experimentos com diferentes gama de pontos de tempo, as concentrações de exposição, etc. estão sendo realizados para explorar a importância de níveis elevados de HSP27 em presença de DMTU e NAC em células expostas a essas nanopartículas.
A regulação positiva na a expressão da proteína de CYP2E1 tem sido correlacionada com formação induzida de ROS, elevação de peroxidação lipídica e os danos citotóxicos em álcool Hepatotoxicidade induzida [35], [36]. Relatamos o TiO
2-NPs e MWCNTs induzida indução na atividade específica CYP2E1 NDMA-d catalítico e restauração significativa por dois scavenges-DMTU e NAC no cancro do pulmão de células-A549 humano. Para o conhecimento, as nanopartículas induzidas expressões de proteínas e atividade da CYP2E1 e subsequentes níveis induzidos de ROS estão sendo apresentadas pela primeira vez no cancro do pulmão de células A549 humano. níveis induzidos de expressão da proteína CYP2E1 e atividade NDMA-d em investigações presentes também suportam a nossa conclusão anterior nas mesmas células que MWCNTs induzem a produção de ROS por actividade função oxidase mista em vez de perturbação mitocondrial [15]. Após a exposição do TiO
2-NPs e MWCNTs, foram observados expressão e actividade de CYP2E1 induzida, o que pode ser correlacionado com a indução de ROS e stress oxidativo. Como nossos dados de geração de ROS medida pelo DCFH-DA estão bem corroborative com a indução CYP2E1. O mesmo tipo de correlação entre a produção de ROS e CYP2E1 após a exposição do monocrotofos, um dos pesticidas organofosforados, em células PC12 também tem sido relatado recentemente [37]. Temos uma redução significativa nos níveis de MWCNTs induzidas estresse oxidativo e CYP2E1 (expressão e atividade) na presença de DMTU e NAC, o que confirma o papel do CYP2E1 em MWCNTs induziu respostas tóxicos. Enquanto no caso de TiO
2-NPs, apenas a NAC foi encontrado eficaz na redução da expressão e actividade de CYP2E1. Ele indica que TiO
2-NPs exerceu o estresse oxidativo predominantemente por H
2O
2 de produção em vez OH radicais. Como DMTU é conhecido para eliminar o OH
• radicais formados pela conversão de O
2
– na presença de ferro por uma reacção de Haber-Weiss modificadas [38]. Efeitos semelhantes também foram relatados na presença de dialil-sulfureto (outro grupo tiol contendo composto) em etanol mediada expressão de CYP2E1 em células hepáticas polarizadas WIF-B [39].
Na presente investigação, os níveis de a expressão da proteína de P
53 foram bem correlativo com os dados obtidos para micronúcleos (MN) de indução. P
53 é um dos marcadores moleculares que desencadeiam importantes para a avaliação de genotoxicidade em caso de danos no ADN induzida estresse oxidativo [10]. danos celulares por ROS está positivamente relacionada com P
53 ativação e expressão induzida de P
53 proteína tem sido sugerida como uma ferramenta para detectar o estresse oxidativo induzido cito-genotoxicidade [10]. Assim, os níveis elevados de P
53 proteína é uma indicação de TiO
2-NPs e MWCNTs induzida estresse oxidativo mediado genotoxicidade. Tratamento de DMTU e NAC foi encontrado para ser eficaz significativamente para reduzir os níveis elevados de p
53 proteína em células TiO
2 e MWCNTs exposta. Este efeito pode ser correlacionado com a forte anti-oxidante e actividade anti-ROS de DMTU e NAC observado no presente investigações, bem como em outros estudos [34]. Em uma descoberta semelhante, Mroz et al. [40] demonstrou também que a NAC bloqueada partículas impulsionado p-ser15-p
53 de resposta em células A549.
Em conclusão, as investigações actuais revelam que TiO
2-em NPS (10, 50? G /ml) e MWCNTs (10, 50 ug /ml) durante 24 h a exposição induz os marcadores de stress oxidativo e cito-genotoxicidade em células A549. TiO
2-PN respostas tóxicas induzidas foram mediados principalmente através H
2O
2 geração, ea redução no sistema de defesa antioxidante. Enquanto, no caso de MWCNTs, efeitos adversos eram principalmente devido à alteração /dificultando o sistema antioxidante enzimática. DMTU e NAC foram encontrados para ser eficaz significativamente na redução dos níveis de marcadores de estresse e de genotoxicidade oxidativas, exceto HSP27.
Materiais e Métodos
Todos os produtos químicos e reagentes especificados foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Company Pvt. Ltd. St. Louis, MO, EUA, salvo indicação contrária. Todos os produtos químicos e reagentes utilizados eram de alto grau de pureza disponível
Nanopartículas preparação
TiO
2-PN (d . 25 nm, área superficial específica de 200-220 m
2 /g, com base pura de vestígios metálicos 99,7%, tetragonal no sistema cristalográfica, de forma esférica) sem qualquer revestimento foram adquiridos a Sigma Aldrich, EUA, (N ° Cat. 637254), ao passo que os MWCNTs utilizados neste estudo foram generosamente oferecida por Dieter L . Weiss, professor do Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Biologia celular e Tecnologia Biosystems, Universidade de Rostock, na Alemanha. Esterilização de nanopartículas foram realizadas por aquecimento a 120 ° C durante 2 h e em seguida suspensas em meio DMEM-F12 completo. As soluções de reserva (1 mg /ml) de nanopartículas foram sonicadas para assegurar a suspensão uniforme antes de ser diluída com meio de cultura usado para a exposição de células [15], [41]. Antes utilizando nas experiências, tanto as nanopartículas foram analisados quanto à presença de endotoxina bacteriana utilizando Lisado de Limulus Amebocyte teste (LAL).
Caracterização das nanopartículas
microscopia electrónica de transmissão.
A caracterização ultra-estrutural incluindo textura, tamanho e internalização foi feito por Ludwig Jonas, Professor, no Departamento de Patologia, Electron microscópica Center, Faculdade de Medicina da Universidade de Rostock, na Alemanha. Em resumo, TiO
2-NPs e MWCNTs foram suspensas em água destilada e caiu em grades de cobre de carbono película revestida de Microscopia Eletrônica de Transmissão. O diâmetro do TiO
2-PN e comprimento /diâmetro de MWCNTs foram medidos utilizando TEM Libra 120 (Carl Zeiss Oberkochen, Alemanha) equipado com o software de análise morfométrica (ponto OSIS Münster Alemanha). conjuntos paralelos de as células foram expostas ao TiO
2-NPs e MWCNTs durante 24 h a 37 ° C, fixo em glutaraldeído (4% em PBS) e transformadas para o estudo da fagocitose e pinocitose usando microscopia electrónica de transmissão (TEM). As imagens foram tomadas em diversas ampliações pela 2K câmera Proscan usando o item de software (OSIS Münster, Alemanha).
espalhamento de luz dinâmico.
distribuição de tamanho e potencial zeta de TiO
2-NPs e MWCNTs, por si só, bem como na presença de NAC e DMTU, foram determinados usando dispersão dinâmica de luz e dispersão de luz análise de fases (PALS) num Zetasizer Nano ZS-, Modelo ZEN3600 equipado com 4.0mW, laser de 633 nm (Malvern Instruments Ltd. , Reino Unido), conforme descrito anteriormente por nós [15]
cultura celular
células de câncer de pulmão humanos -. A549 (ATCC No. CCL-185TM) utilizados no estudo foram originalmente adquiridos do Centro Nacional de