Abstract

câncer de pulmão V-Raf do Sarcoma Murino Viral Oncogene homólogo B (BRAF) mutado é relativamente agressivo e é resistente ao momento terapias disponíveis. Em um recente estudo de fase II em pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células BRAF-V600E (NSCLC), BRAF inibidor V600E demonstraram evidência de atividade, mas 30% deste grupo selecionado progrediu durante o tratamento, o que sugere a necessidade de desenvolver estratégias alternativas. Foram testadas duas opções diferentes para aumentar a eficácia de vemurafenib (inibidor BRAF V600E) em BRAF mutante NSCLC. A primeira opção foi a adição de erlotinib para vemurafenib para ver se a combinação fornecida sinergia. O segundo era induzir inibição de MEK (a jusante do RAF) com trametinib (inibidor MEK). Descobrimos que a combinação de vemurafenib e erlotinib não foi sinergística para a inibição da sinalização de p-ERK em células BRAF V600E-. Vemurafenib causou apoptose significativa, a paragem em G1 e regulação positiva de BIM em células BRAF-V600. Trametinib foi eficaz como um agente único em BRAF células mutantes, quer V600E ou não-V600E. Finalmente, a combinação de vemurafenib e trametinib causou um aumento pequeno mas significativo na apoptose, bem como uma significativa supra-regulação de BIM quando comparado com qualquer agente único. Assim, insinuando a possibilidade de utilizar uma abordagem de combinações para a gestão deste grupo de pacientes. Importante, trametinib sozinho causou regulação positiva de p-AKT em BRAF células mutantes não-V600, enquanto este efeito foi anulado com a combinação. Esta constatação sugere que, a combinação de um inibidor MEK com um inibidor de BRAF será mais eficaz em ambiente clínico em doentes com NSCLC BRAF mutadas

citação:. Joshi H, SJ arroz, Liu X, Miller B, Belani CP (2015) Trametinib com ou sem Vemurafenib em BRAF Mutante Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10.1371 /journal.pone.0118210

Editor do Academic: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, United States |

Recebido: 10 Setembro, 2014; Aceito: 09 de janeiro de 2015; Publicação: 23 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Joshi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

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financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a maioria dos pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) são diagnosticados numa fase posterior e tratamentos actualmente disponíveis, incluindo quimioterapia e radioterapia parecem ser insuficientes em bater esta doença mortal. A presença de uma mutação activadora no receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) está associada com taxas elevadas de resposta e sobrevida livre melhorada progressão (SLP), com a utilização de inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI) [1-3]. O erlotinib e gefitinib são TKI de primeira geração que causam inibição reversível do domínio de tirosina quinase de EGFR. Erlotinib foi inicialmente aprovado para uso clínico em NSCLC avançado na segunda configuração de linha de base dos resultados positivos de ensaio BR.21 a fase 3 [4]. Fase 3 de testes, como ideal (erlotinib contra a quimioterapia como tratamento de primeira linha para pacientes com cancro do pulmão de não-pequenas células EGFR mutação-positivo avançado) [5] e IPASS (Iressa Pan Asia Study) [6], têm mostrado melhorias claras nas taxas de resposta e sobrevida livre de progressão (PFS) com TKI de primeira geração no primeiro cenário linha quando comparado com a quimioterapia baseada em platina tradicional. Isto levou já ao uso de TKI de EGFR como uma terapia de primeira linha para doentes com NSCLC ancorando uma mutação do EGFR sensibilizante em oposição à quimioterapia de combinação padrão. Da mesma forma, BRAF (v-Raf sarcoma murino oncogene viral homólogo B1) mutação também pode dirigir o desenvolvimento do tumor em NSCLC. Mutações no gene

BRAF

ter uma frequência de ~2-3% em NSCLC [7,8]. Uma mutação V600E no exão 15 compreende aproximadamente 50% de todas as mutações BRAF, enquanto mutações BRAF V600E não compõem o restante 50% [9].

BRAF mutante NSCLC é pensado para ser agressivo e mostrar resistanceto terapias disponíveis atualmente [10]. Vemurafenibe é um inibidor selectivo de BRAF por via oral para a mutação V600E, e foi demonstrado ser eficaz no tratamento de pacientes com melanoma avançado com a mesma mutação. Há evidências para apoiar que os inibidores de BRAF, usado sozinho em NSCLC com mutação positiva do BRAF V600E-demonstram apenas uma benefício modesto sem respostas completas, 40% resposta parcial, e 30% com a progressão da doença durante o tratamento [11]. O efeito de inibição de MEK (MAPK /ERK-quinase) em BRAF mutante NSCLC não foi completamente investigada e um estudo recente mostrou que a combinação de um inibidor de BRAF (dabrafenib) e inibidor de MEK (trametinib) também foi eficaz no tratamento de melanoma avançado [12 ]. Trametinib é uma MEK oralmente disponível inibidor recentemente aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para utilização no tratamento do melanoma metastático em pacientes com BRAF-V600E e BRAF-V600K mutações, com base nos resultados de um ensaio clínico por Flaherty

et ai.

, mostrando um benefício significativo em ambos os sobrevida livre e global de progressão [13].

na configuração pré-clínico, receptor tirosina quinase (RTK) inibição tem um efeito dominante sobre a supressão de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K ) via de sinalização. Um dos mecanismos de resistência para a inibição RTK em linhas de células mutante KRAS é através da activação da via de sinalização RAS [14]. Uma linha de células de cancro do cólon com uma mutação BRAF V600E foi mostrado para escapar vemurafenib inibição por activação do receptor do factor de crescimento epitelial (EGFR); No entanto, o tratamento destas células com vemurafenib e um inibidor de EGFR impedido vemurafenib e resistência a apoptose induzida por [15]. Nós supomos que a mutação na via BRAF provoca hiper-activação de ERK e, portanto, a combinação de inibição de EGFR com inibição BRAF seria de benefício. Nós também estabelecidos para determinar se o trametinib inibidor MEK seria sensibilizar células do BRAF tipo selvagem mutado (WT) EGFR NSCLC à inibição BRAF por vemurafenib. Colocámos a hipótese de que as células BRAF V600E-têm limitado de sensibilidade ao inibidor BRAF por causa da activação da via de MAPK [12]. Assim, trametinib poderia aumentar a eficácia de um inibidor de BRAF em BRAF mutante NSCLC. A resistência a inibidores de BRAF é mediada através de vários mecanismos que induzem a reactivação de MAPK via [16-19]. Trametinib alvo da MEK, que é a jusante de BRAF na via de MAPK. Assim, combinando trametinib com um inibidor de BRAF, quer vemurafenib ou dabrafenib, seria mais eficaz. Nosso objetivo foi investigar se trametinib e vemurafenib poderiam cooperar para suprimir a via de sinalização /MAPK ERK em linhas de células BRAF mutante NSCLC. Comparou-se a eficácia do único agentes, vemurafenib ou trametinib, para que da combinação de vemurafenib mais trametinib em BRAF mutante linhas celulares de NSCLC, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] e H1755 [non-V600E, G469A BRAF mutante, WT EGFR ].

Materiais e Métodos

As linhas celulares, reagentes e anticorpos

A549, H460, H1755 foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manasses, VA). Considerando que, a linha de células HCC364 foi obtido a partir laboratório de pesquisa do Dr. Adi F. Gazdar, University of Texas, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, estreptomicina e penicilina a 37 ° C com 5% de CO

2. V600E no gene BRAF e G469A mutações em células HCC364 e H1755, respectivamente, foram confirmados utilizando um método de análise do fragmento SNaPshot de acordo com o protocolo desenvolvido por Su et al. (S1 Fig.) [21]. Os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). O erlotinib, vemurafenib e trametinib foram obtidos a partir de Selleckchem (Houston, TX).

proliferação celular e ensaios de crescimento de longo prazo

As células foram semeadas a 1×10

4 culas por po em 96 um -bem placa de cultura de tecidos. No dia seguinte, as células foram tratadas com erlotinib, trametinib, vemurafenib, ou combinações como indicado na figura lendas. Dimetilsulfóxido (DMSO) foi usada como um controlo do veículo. A proliferação celular foi medida 48 ou 72 horas após o tratamento da droga utilizando um Cell Titer 96 ensaio não radioactivo aquoso a proliferação celular (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo dos fabricantes. viabilidade relativa foi calculada para cada cavidade subtraindo a absorvância de fundo antes de a normalização para o controlo tratado com veículo poços.

ensaios de crescimento de longo prazo foram realizadas por células de sementeira em 1500 células por cavidade em uma placa de 12 poços. Os medicamentos foram adicionados directamente a cada poço no dia seguinte, e meio fresco com fármaco foi adicionado após 4 dias. Após 7 dias, as células foram lavadas com PBS, fixadas em paraformaldeído a 2% durante 20 minutos à temperatura ambiente (RT), incubadas com 70% de etanol durante 5 minutos, e depois coradas com 0,1% de azul de tripano durante 60 minutos à TA. Após descoloração em PBS três vezes, os poços foram digitalizados. Depois disso, o corante foi solubilizado em 1% SDS e a absorvância foi medida a 590 nm durante três alíquotas de 100 ul a partir de cada cavidade num leitor de placas Synergy HT (BioTek, linha costeira WA). absorvância de fundo de um poço sem células foi subtraída dos valores experimentais e valores experimentais foram normalizados ao tratamento com veículo.

Immunoblot ensaio

Proteínas foram colhidas a partir de células num tampão de lise contendo 40 mM Tris.Cl pH 7,6, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato, NaCl a 150 mM mais de protease e fosfatase cocktail de inibidor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 4 ° C durante 30 min. A proteína total foi quantificada com um kit BCA (Thermo Scientific, Waltham MA), e quantidades iguais de proteína foram divididos através de géis de 10% de SDS-PAGE, electro para PVDF, e bloqueadas com 5% LPM. As membranas bloqueadas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários, com anticorpo secundário conjugado com HRP apropriados, antes da detecção quimioluminescente.

A citometria de fluxo

A apoptose foi determinada por coloração das células com FITC anexina-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) e ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) antes da análise num citómetro de fluxo Calibur (BD Biosciences, San Jose CA). As células foram semeadas em triplicado para uma placa de 6 poços, e as células seguintes dias foram tratadas com os fármacos indicados. O paclitaxel foi utilizado como um controlo positivo para as experiências de apoptose. Vinte e quatro e 48 horas após os tratamentos, as células flutuantes e as células aderentes foram colhidas depois coradas com anexina-V-FITC e 7-AAD em tampão de ligação da anexina V 1x (BD Biosciences) durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. A fluorescência foi medida com um citómetro de fluxo, e os dados resultantes foram analisados ​​com o software 2.8 WinMDI (O Scripps Institute, https://facs.scripps.edu/software.html).

análise do ciclo celular foi realizada por meio de etídio coloração com brometo de. As células foram semeadas em triplicado para uma placa de 6 poços um dia antes do tratamento com drogas. Após 24 horas, os núcleos foram colhidas e coradas numa solução de lise hipotónico (citrato de sódio 7 mM, 0,2% de Triton X-100) com brometo de etídio (50 ng /mL) e RNase A (50 ug /ml) durante 30 minutos no escuro. A fluorescência foi medida num Calibur citómetro de fluxo. Os dados adquiridos foram analisados ​​utilizando software ModFitLT 3,2 (Verity Software House, Topsham ME).

A análise estatística

A significância estatística das diferenças entre os dois grupos ou entre vários grupos foi analisada com frente e verso testes t de Student não pareado (para variâncias iguais) como implementadas pelo Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Todos os dados apresentados são a média SEM dos valores em triplicado a partir de três experiências separadas. * P 0,05, ** p 0,01 e *** p 0,001 em comparação com o grupo de controlo. testes t de Student independente ou one-way ANOVA foram usados ​​para comparar as variáveis ​​contínuas entre os dois grupos ou mais de dois grupos. Os resultados foram considerados como sendo estatisticamente significativa a p 0,05. A sinergia citotóxica foi analisada e representada graficamente com o uso de software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) e foi expresso como o índice de combinação na LC99 (isto é, a concentração letal para 99% das células). Outra confirmação foi obtida com em uma matriz 5×5 usando um ensaio CellTiter-Glo e Bliss aditivo análise do modelo.

Resultados

Expressão de sinais de p-ERK e p-AKT em células NSCLC

a desregulamentação tanto do RAF /MAPK e AKT /MTOR vias de sinalização é pensado para desempenhar um papel crítico na carcinogênese e progressão tumoral em NSCLC [22]. Numerosos componentes destas vias de sinalização pode agir como alvos moleculares para a terapêutica do cancro, mas é essencial saber a presença dessas aberrações em células cancerosas por implicação clínica [23]. Em primeiro lugar, determinou-se a expressão da linha de base de fosforilada (p) -Akt e p-ERK 1/2 nas nossas linhas celulares (Fig. 1A). sinal de ERK fosforilado foi detectado em todas as linhas celulares utilizadas-4 nas nossas experiências, sugerindo que a via de ERK desempenha um papel importante no desenvolvimento do cancro nas células KRAS ou BRAF mutadas. Drogas que alvejam este caminho pode ser eficaz. No entanto, p-AKT foi fracamente detectada em células BRAF mutante, HCC364 H1755 e quando em comparação com células A549 e H460 linhas, como mostrado na Fig. 1A. Isto pode sugerir que a via de sinalização AKT não pode desempenhar um papel crucial em células BRAF mutantes

A:. Western blot de AKT fosforilada e sinalização ERK em linhas de células não tratadas nativas ([+] mutação; [-] tipo selvagem). Todas as pistas são a partir do mesmo gel e ruptura foi criada para incluir apenas relevante linhas celulares B: A549, linhas de células H460, H1755 e HCC364 tratados com D (DMSO) ou fármacos indicados, E (erlotinib), V (vemurafenib), e EV (erlotinib-vemurafenib) foram analisados ​​depois de 72 h por um ensaio de MTS. O IC50 para Vemurafenibe em HCC364 foi de 0,8 uM. C: transferência de Western de diferentes linhas celulares de NSCLC, que mostra mudanças na p-ERK, p-AKT e PARP com veículo D (DMSO), E (erlotinib) 1.6 uM, V (vemurafenib) 1.6 uM, EV (erlotinib + vemurafenib) 1,6 /1.6, uM 24h após o tratamento. D: A apoptose por citometria de fluxo 48 h pós-tratamento com D (DMSO), E (erlotinib) 1.6 uM, V (vemurafenib) 1.6 uM, EV (erlotinib /vemurafenib 1,6 /1,6? M). western blot, pós 48h, apoiando clivagem PARP com V e EV em HCC364 mas não H1755 células.

Erlotinib e vemurafenib

A eficácia da terapia de combinação com erlotinib e vemurafenib. A combinação de um EGFR alvo anticorpo monoclonal (cetuximab) e BRAF (vemurafenib) inibição tinha mostrado eficácia em células cancerígenas do cólon com a mutação BRAF [15]. Procurou-se determinar se um conceito semelhante de se combinar BRAF e EGFR inibições poderia ser eficaz em linhas celulares de NSCLC. A549, H460, H1755 e HCC364 células foram tratadas com concentrações variáveis ​​de erlotinib, vemurafenib, ou a combinação de erlotinib e vemurafenib (5 diluições em série para os agentes individuais e 2,5 diluições de 1: 1 proporção da combinação). Os ensaios de proliferação celular demonstraram que apenas HCC364 células foram sensíveis a Vemurafenibe e a combinação de vemurafenib e erlotinib não foi eficaz (Fig. 1B). células H1755 foram menos sensíveis à Vemurafenibe e há sinergia significativa foi observada com a combinação de erlotinib e vemurafenib. Vemurafenib foi ineficaz nas células KRAS mutado (A549, H460). Além disso, a falta de sinergia entre erlotinib e vemurafenib foi confirmada pelo método de BLISS (S2 Fig.) [24].

As alterações da sinalização oncogênicos após o tratamento durante 24 horas com a combinação de vemurafenib mais erlotinib (1,6 mM /1.6 uM) foram analisados ​​por ensaio de imunotransferência (Fig. 1C). Vemurafenib diminuiu a fosforilação de ERK em HCC364 células só que sem um aumento subsequente da AKT activada. Esta constatação sugeriu que a falta de sinergia entre erlotinib e vemurafenib visto em ensaios de proliferação é devido à relação de ERK-AKT visto no cancro do cólon e não está presente nas células HCC364. Isto, provavelmente, não está relacionada com a escolha do inibidor de EGFR (cetuximab vs erlotinib). Vemurafenibe sozinho induziu activação de sinalização de ERK em não-BRAF mutante células, A549 e H460. Nenhuma mudança significativa no ERK activada foi observado em células H1755 seguintes vemurafenib tratamento. Curiosamente, observou-se que a combinação de vemurafenib e erlotinib resultou numa diminuição da AKT activado em KRAS células mutadas (Fig. 1C).

Finalmente, avaliou-se as alterações na apoptose após erlotinib e Vemurafenibe tratamentos isolados ou em combinação . células HCC364 foram sensíveis à apoptose e clivagem PARP vemurafenib-induzido, enquanto H1755 células eram resistentes (Fig. 1D). O mecanismo de apoptose foi avaliada por ensaios de imunotransferência após 48 horas de tratamento com vemurafenib e causou um aumento de BIM (pró-apoptótica), quando em comparação com DMSO. Uma diminuição no MCL-1 (anti-apoptótica) foi também observada com vemurafenib mas nenhuma alteração foi observada no BCL-XL (anti-apoptótica), BCL-2 (anti-apoptótica), BAK (pró-apoptótica), e BAX ( pró-apoptótica) quando comparado com o DMSO (S3 Fig.).

Efeito do vemurafenib agente único em linhas celulares de NSCLC BRAF mutadas. Usando um longo prazo vemurafenib ensaio de crescimento foi encontrado para ser eficaz em BRAF V600E-mutada HCC364 células e não em não-mutado BRAF V600E H1755 células (Fig. 2A). Em seguida, queria para avaliar melhor o mecanismo molecular por trás desta actividade anti-tumoral. Analisou-se a evolução do ciclo celular 24 horas após o tratamento com vemurafenib em ambas as células H1755 e HCC364. Em HCC364 células, vemurafenib causou um aumento significativo no número de células G1, com uma redução subsequente em células em fase S, apoiando a paragem em G1 em células mutadas V600E. Vemurafenibe, no entanto, não foi eficaz em causar um bloco G1 em células H1755 (Fig. 2B). Immunoblotting mostrou alterações nas proteínas do ciclo celular em células HCC364, após o tratamento vemurafenib inclusive, a regulação negativa da expressão CDK2 e regulação positiva de p21 e p27 expressões (Fig 2C.)

A:. Longo prazo ensaio de crescimento, 7 dias pós tratamento com veículo-D (DMSO), vemurafenib 50 nM, 500 nM, 5000 nM em ambos HCC364 e H1755 células. HCC364 células foram mais sensíveis ao vemurafenib. * P 0,05; *** P 0,001 quando comparado com o DMSO. B: ciclo celular análises por citometria de fluxo tratamento pós 24h com DMSO, V (vemurafenib) em células HCC364 e H1755. fases do ciclo celular mostradas são G1, S e fase G2. V induz a paragem do ciclo celular em células HCC364, como evidenciado por um aumento em G1 e uma diminuição significativa da fase S. C: Western blot às 48 horas pós tratamento apoiar a evidência para a paragem em G1, que mostra o aumento de P27 e diminuição da CDK2 com V (vemurafenib) quando comparadas com a D (DMSO). Nenhum efeito foi observado em células H1755. Todas as pistas para HCC364 e todas as pistas para H1755 são provenientes do mesmo gel. A ruptura foi criado para remover pistas tratados erlotinib.

Trametinib e vemurafenib

Efeito do tratamento combinado com trametinib e vemurafenib. O tratamento com a combinação de inibidor de inibidor de MEK e BRAF tem sido eficaz em pacientes com melanoma avançado com mutação BRAF-V600, mas o efeito do inibidor MEK ou esta combinação semelhante não tem sido explorado em NSCLC BRAF mutante [12]. Analisamos se a adição de trametinib para vemurafenib iria mostrar qualquer eficácia em células mutantes BRAF, H1755 e HCC364. Trametinib foi mais eficaz na inibição do crescimento ao fim de sete dias em ambas as linhas celulares, em comparação com vemurafenib, no entanto, a combinação das duas drogas não foi significativamente diferente do trametinib sozinho (Fig. 3A, B). Foram avaliadas as diferenças de ciclo celular para ambas as células NSCLC mutante BRAF após um tratamento de 24 horas, com DMSO, vemurafenib, trametinib ea combinação (Fig. 3C). Ambos vemurafenib e trametinib foram eficazes em provocar a paragem em G1 como evidenciado por um aumento significativo na fase G1 e uma diminuição em células em fase S em comparação com o tratamento de DMSO. No entanto, a combinação não foi mais eficaz do que qualquer dos agentes individuais isoladamente. A paragem do ciclo celular observada com a citometria de fluxo nas células HCC364 foi confirmada por ensaio de imunotransf erência de proteínas do ciclo celular após 24 horas de tratamento com os respectivos agentes. Ele mostrou a regulação negativa de CDK2 com a regulação positiva de p21 e p27 com vemurfenib, trametinib e a combinação, quando comparado com o DMSO (Fig. 3D). No entanto, não houve diferença observado nas células tratadas com trametinib, vemurafenib, ou a combinação de trametinib mais vemurafenib nas expressões de CDK2, p21 ou p27 nestas células (Fig. 3D). Além disso, não observamos qualquer diferença no pJAK2 e expressões pSTAT3 (S4 Fig.) Curiosamente, as células H1755 não apresentaram uma tendência semelhante em CDK2 ou p21 e p27, apesar da prisão G1 e diminuição na fase S visto com citometria de fluxo ( Fig. 3D). Isso nos faz acreditar que há um outro mecanismo envolvido na prisão G1, que é independente da CDK2 downregulation nestas células

A, B:. Ensaio de crescimento a longo prazo, 7 dias após o tratamento com veículo de DMSO (D ), V (vemurafenib) 1 uM, t (trametinib) 1 fiM e TV (trametinib + vemurafenib, 1 uM de cada) em HCC364 (A), e células H1755 (B). C: ciclo celular análises por citometria de fluxo em células H1755 HCC364 e após 24 horas de tratamento com D, V de 0,5 uM, 0,5 uM t, TV 0,5 /0,5 uM. D: Western blot após 24h de H1755 e HCC364 tratados como em C. (*** p 0,001 quando comparado com DMSO)

Nós exploramos mais o efeito apoptótica da combinação vemurafenib e trametinib in. BRAF mutante células NSCLC. Trametinib apoptose induzida em ambas as linhas de células mutantes BRAF. A combinação de vemurafenib e trametinib causou apoptose significativamente maior do que qualquer agente isolado em HCC364 e H1755 (Fig. 4A). Apoptose após várias doses de tratamento trametinib foi confirmada pela presença de clivagem de PARP em HCC364 células, ao passo que uma diminuição da PARP foi visto em células H1755 sem a presença de PARP clivada (Fig. 4B). A ocorrência de apoptose foi ainda apoiada por regulação positiva de proteína pro-apoptótica, BIM, em ambos os HCC364 e H1755 células após tratamento com trametinib. A combinação causado maior aumento de BIM quando comparado com trametinib sozinho. Esta observação sugere que a combinação de vemurafenib e trametinib é melhor do que a promoção de apoptose trametinib sozinho em células mutantes BRAF (Fig. 4C). Não foram observadas alterações significativas na expressão de BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BAX e BAK

A:. A apoptose por citometria de fluxo, 48h após o tratamento com o veículo-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 uM), t (trametinib 1 uM), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 ^ M) e em células HCC364 H1755. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001). B: Western blot de PARP clivada em HCC364 e H1755, o tratamento 48h post com D (DMSO) e várias doses de vemurafenib (0,25, 0,5, 1? M) e trametinib (0,25, 0,5, 1? M) C: blot mostrando mudanças ocidentais em ERK, AKT, BIM, a clivagem de PARP, 48 h após o tratamento com veículo D (DMSO), V (vemurafenib 1 uM), t (trametinib 1 uM), TV (trametinib vemurafenib + 1/1 uM) na HCC364 e H1755 células. Quatro pistas foram tratados em duplicata para cada linhas celulares e apenas os restantes 4 faixas de cada linhas celulares foram mostrados na figura.

Trametinib como um agente único em BRAF mutação CPNPC. O inibidor de MEK, selumetanib foi mostrado para infra-regular a sinalização de ERK em modelos pré-clínicos de pulmão com NSCLC KRAS mutado, mas um efeito semelhante não tem sido demonstrada em NSCLC BRAF mutante [25]. Quisemos comparar as alterações de sinais oncogénicos resultantes da introdução de um inibidor de BRAF, um inibidor MEK ou a combinação de ambos em BRAF mutante NSCLC. As alterações nos sinais oncogénicos foram avaliados através da realização de um ensaio de imunotransferência para avaliar alterações nos sinais de apoptose em ambas as células com vemurafenib trametinib vs vs a combinação às 48 horas de tratamento com uma dose de uM de agentes isolados e 1: 1 proporção da combinação, 1: 1 uM doses de cada. Observou-se que o tratamento com trametinib causou uma supressão significativa da fosforilação de ERK, quando comparado com o DMSO ou Vemurafenibe sozinho em ambos HCC364 e H1755 células (FIG. 4C). A combinação de trametinib e vemurafenib não era melhor do que sozinho trametinib. Além disso verificou-se que não foi pAKT elevados em células HCC364 com a utilização quer de agentes isolados ou em combinação (p-AKT foi fracamente detectada na HCC364 células e a expressão não se alterou-o imunoblot não é mostrado). No entanto, observou um aumento da expressão de p-AKT com o uso de um único trametinib agente em BRAF não-V600E mutante H1755 células e curiosamente a combinação de trametinib e vemurafenib não mostraram um aumento em p-AKT, quando comparado com o DMSO, o que sugere que talvez via p-AKT pode desempenhar um papel na resistência ao tratamento com um único agente trametinib. Trametinib também é eficaz em causar a apoptose em ambas as células H1755 (Fig. 4a) e HCC364. Além disso, trametinib também causou a paragem em G1 em células de BRAF mutadas (Fig. 3C). Embora as alterações nas proteínas do ciclo celular, a regulação negativa de CDK2 e regulação positiva de expressões p21 e p27, só foram vistos em HCC364 células.

Discussão

via BRAF desempenha um papel importante na tumorigênese em NSCLC, inibidores de BRAF, vemurafenib e dabrafenib ter mostrado apenas eficácia modesta em cancros mutante BRAF V600E-[11,13]. Apesar voltadas para esta mutação específica, a utilização de dabrafenib, em NSCLC com mutação BRAF V600E-resultou em apenas uma taxa de resposta de 40%, juntamente com uma progressão da doença desapontante de 30% [11]. Esses resultados refletem que BRAF inibição por si só não é uma opção de tratamento ideal e estratégias mais recentes para tratamento otimizado e eficaz deste seleto grupo de pacientes são necessários. Esta hipótese é também apoiada por um estudo clínico em melanoma mostrando uma vantagem significativa na sobrevida livre de progressão com a combinação de dabrafenib mais trametinib vs. dabrafenib sozinho [12]. As nossas experiências in-vitro confirmaram que vemurafenib é eficaz na inibição do crescimento, diminuindo a sinalização ERK, e indução de apoptose na linha celular mutante V600E no gene BRAF HCC364, enquanto na linha não-mutante V600E BRAF célula, H1755, não era tão sensível. Prahallad

et al.

, Demonstraram atividade aumentada por tratamento combinado do cetuximab inibidor EGFR com vemurafenib, ligando ERK e AKT sinalização através do Cdc25C intermediário nas células cancerígenas do cólon BRAF mutação [15]. No entanto, os nossos resultados indicam que a combinação de erlotinib e vemurafenib não é eficaz em células NSCLC. Embora não fomos capazes de detectar Cdc25C nas linhas de células mutante BRAF HCC364 (V600E) e H1755 (não-V600E), estas células não respondem à inibição de ERK com activação AKT reforçada sugerindo que ERK e sinalização AKT não estão ligados através de cdc25C nestes células.

Vemurafenib foi capaz de modular proteínas relacionados à apoptose e ciclo celular [26,27]. Nós descobrimos que o tratamento com vemurafenib resultou na diminuição dos níveis de proteína anti-apoptótica níveis elevados da proteína BIM pró-apoptótico em linhas celulares de NSCLC LCM-1 e. MCL-1 derrota, juntamente com o aumento do BIM [28-30], leva a indução de apoptose e aumento dos níveis de BIM também pode iniciar a apoptose [31-33]. Além disso, a proteína relacionada com o ciclo celular, CDK2, foi regulada negativamente enquanto que as proteínas do ciclo celular, inibidores de p21 e p27, foram regulados positivamente após tratamento vemurafenib em HCC364 células, resultando na paragem do crescimento. Nós especulamos que essas mudanças de expressão de proteínas são provavelmente relacionadas com a atividade reduzida de ERK [34,35], uma vez que efeito semelhante foi observado no tratamento com trametinib (Fig. 3D). Isto reforça a nossa hipótese de que a modulação do BIM e MCL-1 está relacionado com a reduzida actividade de ERK em células HCC364. Infelizmente, H1755, as células BRAF-não-V600E, mostrou celular G1 ciclo dependente de regulação negativa da ERK por tratamento com trametinib prisão. parada do ciclo celular ocorreu sem alteração do proteínas do ciclo celular, CDK2, p21 e p27. Isto sugere que as células H1755 pode ter um diferente mecanismo envolvido na paragem em G1 independente do ponto de verificação CDK2 no ciclo celular.

Os nossos resultados mostram trametinib é eficaz em causar a apoptose tanto em BRAF V600E e células mutantes não-V600E. Trametinib era potente em diminuir a sinalização ERK em células mutantes BRAF, e essa supressão é mais pronunciada com trametinib quando comparado com vemurafenib mesmo em BRAF V600E células mutantes. Os resultados a longo prazo ensaio de crescimento também demonstram que trametinib tem uma melhor eficácia como um agente único, em comparação com células Vemurafenibe em BRAF V600E, mas este pode ser como um resultado de uma meia-vida mais curto de vemurafenib [36,37]. Curiosamente, o tratamento com agente único trametinib causada supra-regulação da sinalização de AKT em apenas células não-V600E BRAF, sugerindo um mecanismo de escape potencial para desenvolvimento de resistência ao tratamento com inibidor de MEK sozinho. Isto pode proporcionar uma visão ao desenvolvimento de resistência aos inibidores de MEK. A Akt não pareceu ser regulada quando as células não-V600E BRAF foram tratados com a combinação de trametinib e vemurafenib, sugerindo que a terapia de combinação pode ser superior a cada um dos dois agentes isolados neste grupo assim. A relação mecânica entre a inibição de ERK e activação AKT em BRAF mutante NSCLC por inibidor MEK precisa ser melhor avaliadas. Também mostraram pela primeira vez que o tratamento de combinação provocou um aumento significativo na regulação positiva do BIM em ambas as células e não-V600E V600E, desempenhando assim um papel significativo na apoptose [31]. O tratamento de combinação também causou pequeno, mas um aumento significativo da apoptose em células BRAF mutante quando comparado com um único agente, sugerindo a razão para o uso de combinação de BRAF e MEK inibidor nesse seleto grupo. Além disso, a combinação de trametinib e vemurafenib poderiam superar a resistência à trametinib sozinho e, portanto, melhor do que o único agente trametinib. Lupin et ai. puseram em evidência o possível mecanismo por trás da resistência em células NSCLC BRAF V600E-mutadas contra o inibidor de BRAF [38]. Os dois mecanismos moleculares distintos para adquirir resistência aos inibidores de BRAF incluem a perda de todo o comprimento em BRAF-V600E juntamente com a expressão de uma forma aberrante de BRAF-V600E que retém a dependência da RAF via e constitutiva de sinalização de EGFR autócrino impulsionado por c-Jun mediada expressão do ligando de EGFR. Os nossos resultados apoiam a hipótese de activação independente mutação BRAF- de MAPK percurso que conduz ao desenvolvimento de resistência ao inibidor de BRAF no tratamento de BRAF V600E mutante-NSCLC. Além disso, o efeito colateral e perfil de toxicidade (19% de carcinoma de células escamosas cutâneo no braço inibidor BRAF

vs

. 7% no braço de combinação em pacientes com melanoma) favorece a terapia de combinação [12].