Abstract
poliomavírus de células de Merkel (MCV) faz com que a maioria dos carcinomas humanos de células de Merkel (MCC) e codifica um antigénio pequena T (ST) que transforma fibroblastos de roedores imortalizadas
in vitro
. Para desenvolver um modelo do rato para a carcinogênese induzida sT MCV, geramos camundongos transgênicos com uma sequência MCV St-flox-stop flox recombinação homóloga no
ROSA
loco (
ROSA
sT
), permitindo Cre-mediada, condicional expressão MCV st. tamoxifeno padrão (TMX) administração a adultos
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos, em que
Cre
é expressa ubiquamente, resultou na expressão MCV St em vários órgãos que era uniformemente letal dentro de 5 dias. Por outro lado, a maioria de adultos
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos sobreviveram baixa dose de administração tamoxifeno mas desenvolveu hiperqueratose dérmica lóbulo da orelha e hipergranulose. Simultânea expressão MCV St e condicional deleção p53 homozigoto gerado multi-focais, mal diferenciadas tumores, altamente anaplásicas nos baços e fígados de ratos após 60 dias de tratamento TMX. Fibroblastos de rato embrionárias destes ratos induzidos a expressar MCV sT exibiu crescimento celular independente de ancoragem. Para examinar patologia de células de Merkel, expressão MCV St, também foi induzida durante meados de embriogênese em células de Merkel de
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
ratos, que levam a um aumento significativo do número de células de Merkel em cúpulas toque em idades embrionárias final que normalizaram após o nascimento. administração tamoxifeno para adultos
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
e
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
;
p53f
LOX /flox
ratos tiveram nenhum efeito sobre o número de células de Merkel e não induziu a formação de tumores. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que MCV sT estimula a proliferação de células de Merkel progenitor em ratinhos embrionárias e é uma oncoproteína viral de boa-fé que induz a transformação de células de câncer completo no
p53
configuração -null.
Citation : H Shuda, Guastafierro A, Geng X, Y Shuda, Ostrowski SM, Lukianov S, et al. (2015) Merkel celular Antigen Cancer Induz Polyomavirus pequeno T e Embryonic Merkel proliferação celular em um rato transgénico modelo. PLoS ONE 10 (11): e0142329. doi: 10.1371 /journal.pone.0142329
editor: Suzie Chen, da Universidade Rutgers, Estados Unidos
Recebido: 24 de junho de 2015; Aceito: 19 de outubro de 2015; Publicação: 06 de novembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Shuda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH NCI R01CA136806, CA136363, CA170354, e Professorships American Cancer Society para PSM e YC. MS foi apoiado em parte pela Universidade de Pittsburgh Skin Cancer SPORE CA12197305. SMM foi apoiado pelo NIH NIAMS R01AR05114, Richard King Instituto Mellon for Pediatric Research. SMO foi apoiado pela Fundação de Dermatologia e NIH NIAMS T32-AR007569. Este projecto utilizado as instalações centrais da Universidade de Pittsburgh Cancer Institute que são suportados em parte pela concessão P30CA047904
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
poliomavírus de células de Merkel (MCV) é clonal integrados em ~ 80% dos carcinomas de células de Merkel (MCC) e é atualmente o único poliomavírus humano conhecido por ser oncogénico [1, 2]. Este vírus foi o primeiro agente patogénico humano descoberto por um método RNA-Seq não dirigida chamada digital de subtracção transcriptoma [3], uma abordagem que é usualmente utilizada para descobrir e caracterizar os vírus humanos [4]. O locus antígeno MCV T codifica duas grandes transcrições de sobreposição para o grande T (LT) e pequena T (ST) oncoproteínas de antígenos [5, 6]. Todos os tumores MCV-MCC examinadas até à data não só transportar vírus clonalmente-integrado, mas também possuir mutações LT específicos de tumores clonais que truncar o C-terminal e interromper as funções helicase da proteína LT [5, 7, 8]. p53 segmentação através de um domínio de interacção bipartido do antigénio LT da vacuolar símio 40 (SV40), vírus estreitamente relacionados é essencial para a actividade de transformação de SV40 LT. No entanto, nenhum domínio p53 segmentação análoga foi identificado tanto para oncoproteínas MCV LT ou ST [9-11].
MCV ST é um inibidor promíscuo ligase E3 [12, 13], e por si só é suficiente para transformar fibroblastos de roedor linhas de células [14]. transformação de células de roedores MCV sT não requer ativa proteína fosfatase 2A atividade (PP2A) liga�o ao [14]. Em vez disso, uma região chamada de domínio grande estabilização T (LSD) se liga e inibe diversas proteínas de reconhecimento ligase E3 incluindo Fbw7, CDC20 e CDH1 [12, 13]. As duas últimas proteínas são subunidades de reconhecimento para a anafase promover complexo /ciclossoma (APC /C) e a expressão sT promove prisão prometáfase mitótico [13]. Isto por sua vez aumenta a fosforilação dirigida-CDK1 de 4E-BP1 e activação de associados a mitose dependente do tampão de tradução (MACT) [14]. As mutações do MCV sT LSD eliminar transformação induzida por sT MCV, e knockdown de qualquer LT ou ST inicia a morte celular ou interrupção do ciclo celular de células MCC MCV-positivos [15, 16].
Recentemente, Spurgeon et al demonstraram que transgénico, queratina 14 promotor-driven expressão do antigénio T genómico MCC-derivado em pele de ratinho induz papilomatose [17]. Da mesma forma, Verhaegen et al demonstraram que a expressão transgénica MCV ST em ratos usando a 5 promotor de queratina (K5) induz lesões hiperproliferativas que imitam carcinoma epidermóide humano
in situ
[18]. Este hiperplasia é dependente de uma região intacta LSD MCV St. Até à data, no entanto, não há modelos de ratos demonstraram que transgénico expressão de antigénios MCV T induz neoplasia completo.
Geramos camundongos transgênicos que condicionalmente expressar MCV sT do
ROSA26
lócus para medir o potencial oncogénico de esta proteína virai. Confirmamos que a expressão MCV sT induz uma resposta hiperplásica em tecidos de pele, como descrito anteriormente. Demonstramos ainda que só prolongada expressão MCV St em um contexto de p53 nulo produz tumores malignos altamente anaplásico, pouco diferenciados em órgãos internos. Este requisito para contribuições múltiplas oncogénicos para transformação completa é semelhante ao observado para c-Myc, Wnt-1 e LT de SV40 [19-21]. Nós também descobrimos que a indução MCV St em células de Merkel de camundongos embrionárias levou a aumentos transitórios no número de células de Merkel, mas foi insuficiente para causar a proliferação ou tumorigênese nas populações de células Merkel adultos, independentemente do status p53.
Resultados
Geração de MCV sT rato transgénico
Um modelo de rato transgénico com expressão MCV sT inducible,
ROSA
São
, foi gerado na C57BL /6 genética fundo. Para expressar condicionalmente proteína MCV ST,-códon otimizado MCV St (sTco) cDNA foi vector clonado a jusante de um
loxP-
ladeado sequência de cDNA de neomicina-fosfotransferase com uma sequência de 5 ‘homóloga à do rato
ROSA26
lócus para gerar
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
(Fig 1A).
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
foi entregue por recombinação homóloga no locus ROSA26 de tronco embrionárias de rato células (ES) (ver detalhes em materiais e métodos).
(A) Projeto de
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
, um ROSA26 knock-in construção codificação códon-otimizado MCV st com flanqueando sequência de loxP-STOP Neo-loxP (LNL), recombinada com o locus genómico ROSA26.
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
cruzado com
Ubc
CreERT2
ou
Atoh1
CreERT2
ratinhos permite-induzida TMX recombinase Cre excisão da sequência de loxP-STOP neo-loxP que resulta na expressão MCV sT sob o promotor CAG. expressão (B) MCV ST é letal em
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
camundongos transgênicos. Curva de Kaplan-Meier da dose alta (0,2 mg /g) e dose baixa (0,02 mg /g) TMX ratinhos injectados. A dose alta TMX injecção rápida perda causada peso e ratinhos atingiram o critério eutanásia (perda de 20% do peso corporal) no prazo de 5 dias após a injecção (n = 4, sólido cor de laranja). Sobrevivência do controle
Ubc
CreERT2
ratos (n = 7, laranja pontilhada) não foi afetada pela injeção TMX.
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
camundongos injetados com dose mais baixa TMX apresentaram sobrevivência significativamente prolongada em comparação com altas doses TMX (n = 18, sólido vermelho) e ratinhos de controlo não foram afetados (n = 10, pontilhada vermelha) (C) multi-tecidos expressão da proteína MCV st em
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratos que morreram imediatamente após altas doses TMX injecção ( 5 dias). Baixa dose de TMX injecção induz menor expressão da proteína MCV St em um rato que morreu no dia 7 após a injeção, como detectado por imunotransferência utilizando um anticorpo criado contra MCV ST, CM8E6 [22]. ST MCV vector ou vector vazio transfectadas células HEK293 foram usadas como um positivo e um controlo negativo, respectivamente. Quantidades iguais de lisados celulares HEK293 St-transfectadas foram carregados para a normalização em diferentes borrões. Hsp70 /Hsc70 foi detectado como uma proteína de controlo de qualidade. a expressão da proteína (D) MCV St foi mantida em tecidos de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratos que sobreviveram mais de 70 dias após a dose baixa de injeção TMX. As imunotransferências foram realizados como em (C). lisados de tecido de
ROSA
São
foram utilizados como controle negativo.
Alto Nível Expressão da MCV St em tecidos é letal para ratos
para induzir condicionalmente cre-loxP recombinação e expressão st em múltiplos órgãos,
ROSA
São
camundongos foram acasalados com
Ubc
CreERT2
ratos que codificam humana ubiquitina C-driven promotor Cre recombinase fundida com uma forma mutante triplo da activ�el receptor de estrogénio humano por tamoxifeno (TMX). Nós examinamos a expressão sT em dois níveis diferentes de dosagem TMX: altas doses de activação TMX para promover difundida expressão St, e uma dose baixa de activação TMX em que uma fração estocástica de células na maioria dos tecidos que sofrem recombinação e expressão sT
.
Altas doses de activação CreERT2 por uma única intraperitoneal (ip) TMX (0,2 mg por grama de peso do corpo do rato) para adultos
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos induzidos a rápida perda de peso em todos os ratos testados (n = 4). Estes ratos tornou-se desidratado, menos activa no dia 3 após a injecção e atingiu o ponto final de perda de peso a eutanásia 20% no prazo de 5 dias. Nenhum dos ratinhos de controlo negativo para o
Ubc
CreERT2
transgene mostrou perda de peso apreciável após TMX injecção (Fig 1B).
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratinhos não mostraram perda de peso, na ausência de injecção TMX, e sua sobrevivência foi comparável ao
Ubc
CreERT2
e
ROSA
São
controle camundongos.
Baixa dose TMX, com 10% da dose mais elevada (0,02 mg /g), reduziu acentuadamente a letalidade, com 72% (13/18) dos ratinhos sobreviventes 10 dias ou mais (n = 18) (figuras 1B e 2B), apesar de uma perda de peso constante durante o curso da experiência. Um desses rato sobreviveu 144 dias após a injecção TMX antes de atingir o critério de eutanásia perda de peso de 20% e esta foi, então, considerado o ponto final para o período de estudo.
(A) fenótipo Hyperplastic na pele da orelha de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratos. tecidos da pele da orelha de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratos foram submetidos a H E coloração. (B) fenótipo hiperproliferativa da pele da orelha de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
ratos. H E seções da pele da orelha manchada de baixa dose TMX injetados
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
e
ROSA
São
ratos foram randomizados e avaliados de forma cega por dois patologistas para hiperqueratose /hipergranulose na epiderme e aumento de anormalidades celularidade /apêndice. N /A: Não disponível desde tecidos do ouvido eram normais e não colhidas. . NT: não testado
Independentemente da dose TMX, immunoblotting tecido de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
camundongos revelaram expressão generalizada MCV St em músculo, baço, pulmão, fígado, rim, intestino, coração e cérebro tecidos de ratos que morreram dentro de 10 dias após a injecção TMX Considerando dose baixa TMX induzida menos expressão tecidual da proteína st (Fig 1C e S1A Fig). Nenhuma expressão St foi detectado em
ROSA
São
controle camundongos ninhada. Para os ratos injectados com uma dose baixa de TMX e sobreviver 10 dias, no entanto, a expressão da proteína MCV St em vários tecidos foi reduzida em comparação com os que sobrevivem 10 dias, com proteína sT detectada apenas em tecidos do ouvido, pele, músculo e cérebro por imunotransferência (Figura 1D). expressão MCV sT não era detectável, exceto no músculo para
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos sacrificados no dia 144 de pós-dose baixa TMX injeção. Aumento do número de células epiteliais positivas TUNEL foram detectados no intestino de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratinhos que receberam múltiplas doses elevadas de TMX (uma vez por dia durante 3 dias), em comparação com
ROSA
sT camundongos de controle
(S1 FIG). Outros órgãos, incluindo o baço, pulmão e rim mostrou resultados semelhantes (dados não mostrados).
Baixa Dose MCV sT Expressão Induz dérmico e epidérmico Hiperplasia em tecidos do ouvido
de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos que sobreviveram mais de 42 dias após a injecção TMX (n = 12), o exame externa bruta mostrou impressionante espessamento difuso e bilateral das aurículas. sT MCV proteína foi detectada por imunotransferência de tecidos do ouvido em 77,8% dos ratinhos (09/07, três tecidos do ouvido não foram colhidas), e indução St foi associada com a hiperproliferação da epiderme e da derme por microscopia em 61,1% (11/18) de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
camundongos (Fig 2A). Os níveis de expressão de proteína MCV sT, no entanto, não foram associados com este fenótipo. Dois ratos que sobreviveram durante mais de 117 dias (9F 9M) e exibiram um fenótipo orelha hiperplásico apesar da falta de expressão da proteína detectável sT nos ouvidos. Nem
ROSA
São
nem
Ubc
CreERT2
controle camundongos demonstraram este fenótipo orelha. Hematoxilina eosina (H E) de coloração de tecido da orelha espessada mostrou hiperqueratose epiteliais (90,9%, 10/11) e hipergranulose (81,8%, 9/11) (Figura 2). Outros do que as alterações macroscópicas e microscópicas de ouvido, detectamos nenhuma outra lesão hiperproliferativa neste grupo de ratos St-expressam.
MCV sT Expressão induz aumento do Proliferação em embrionárias de camundongos Fibroblastos
Para investigar a fibroblastos dérmicos proliferação e para determinar se MCV sT afeta a proliferação celular neste modelo de ratinho, foram isoladas fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São Comprar e
ROSA
São
embriões.
In vitro
tratamento com 500 Nm 4-hidroxi tamoxifeno (4-OHTMX) expressão MCV sT induzida em
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
MEFs (n = 8 embriões), mas não
ROSA
São
MEFs (n = 2 embriões) (Figura 3A). Alguns MEFs mostrou gotejante expressão MCV sT mesmo na ausência de 4-OHTMX tratamento (Fig S2A). a expressão de c-Myc, o qual tem sido mostrado a ser estabilizado por MCV st [12], também foi aumentada por expressão MCV St (Figura 3 e Figura S2B). WST-1 ensaio de proliferação celular demonstraram que o crescimento acelerado ocorreu em
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
mas não
ROSA
São
MEFs (Fig 3 e S2B Fig).
(a) indução de MCV sT em várias células de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) da ninhada por 4 OHTMX. MEFs extraído de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
e
ROSA
São
embriões foram cultivadas na presença ou ausência de 500 nM de 4 OHTMX durante 7 dias. MCV St e c-Myc a expressão da proteína foi detectada por imunotransferência. a expressão da proteína Hsp /Hsc70 foi detectado como um controlo de carga. expressão (B) MCV sT acelera a proliferação de células em células MEF. A proliferação de células MEF tratados com ou sem 4-OHTMX foi avaliada por ensaios Wst1.
MCV sT Expressão em p53 Mice Null Produz anaplásico, mal diferenciadas Neoplasia Expressando marcadores de linhagem mista no baço e fígado
Para contornar a letalidade produzida pela expressão MCV sT como refletido por altos índices de tunel em tecidos e morte rápida de perda de peso de ratos experimentais, atravessamos
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos com
p53
Flox /Flox
ratos para gerar
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos. Nesses camundongos, a administração TMX induzida simultaneamente expressão MCV St e
p53
gene eliminação. No entanto, quando a dose alta (0,2 mg /g) TMX foi entregue IP, expressão MCV St foi detectado em vários tecidos e todos os ratinhos morreram no prazo de 5 dias (n = 9), sugerindo que
p53
supressão não resgatar letalidade induzida por níveis elevados de expressão st (S3A Fig). Tal como acontece com p53 camundongos selvagens, as taxas de sobrevivência de curto prazo para
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
camundongos foram maiores para baixa dose em comparação com altas doses de TMX tratados ratos (S3A FIG) e 42,3% (11/26) ratos morreram no prazo de 10 dias de baixa dose de injeção TMX. a expressão da proteína MCV sT generalizada também foi detectado em vários tecidos de estes ratos que morreram dentro de 10 dias de uma dose baixa de TMX de injeção (Fig S3B).
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos também exibiu a hiperqueratose /hipergranulose fenótipo pele de orelha de visto em p53 do tipo selvagem, os ratos (S4 FIG) St-expressar.
Cerca de 19% do
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos (5/26) sobreviveram 60 ou mais dias de pós-dose baixa de tratamento TMX (Fig 4A). Quatro destes ratos cinco (80%) desenvolveram tumores de alto grau em órgãos internos visíveis na necropsia; três ratinhos tinham tumores tanto no baço e no fígado, e um tinha nódulos tumorais detectáveis grosseiramente no baço sozinho (Figura 4B). Por microscopia de luz, as células tumorais tinham núcleos altamente pleomórficas que variaram drasticamente em tamanho e forma com múltiplos nucléolos e hipercromatismo. Mitoses foram numerosas e as células tinham limites citoplasmáticos indistintas. Uma pesquisa immunoblotting de tecidos (Fig 4C e S5 FIG) demonstrou que a ST foi fortemente expressa nestes tumores enquanto que a expressão sT não era geralmente detectáveis em baços e fígados de longa duração
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
ratos ou o tumor negativo
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
rato (Fig 1D e S5 Fig). a expressão da proteína St em tumores esplénicos era detectável em 75% (04/03) dos ratinhos portadores de tumores (Fig S5). sT expressão foi também detectada por imunotransferência de um nódulo fígado representativa feita a partir de um ratinho afectado (p53.7F, Figura 4C). Para alguns destes ratos (2/5), MCV St, também foi expressa em tecidos renais e exame histopatológico mostrou marcada alterações proliferativas em epitélios tubulares que variam de
em lesões in situ
para lesões malignas totalmente com invasão através de membranas basais. Apesar de evidências microscópicas de neoplasia renal, tumores renais discretas não eram detectáveis pelo exame bruto a necropsia. A imuno-histoquímica demonstrou forte expressão de MCV sT de localizações para as lesões malignas do fígado e baço, e em lesões epiteliais hiperproliferativas e malignos do rim (Figura 4D). Estes resultados foram reproduzidos em TMX injecção meia dose baixa (0,01 mg /g). sobrevivência do ratinho foi inversamente relacionada com TMX dosagem de 0,01, 0,02, e 0,2 mg /g (figura S3). 87,5% (7/8) de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
; p53
Flox /Flox
ratos que sobreviveram mais de 60 dias com 0,01 mg /g TMX também desenvolveram tumores de alto grau no baço e /ou tecidos do fígado (dados não mostrados). Nós não observamos tumorigênese por deleção do gene p53 sozinho em
Ubc
CreERT2
; p53
Flox /Flox
ratos até 140 dias após a 0,02 mg /g TMX tratamento (Fig 4A). Enquanto linha germinal eliminação de p53 neste modelo de ratinho promove a formação de tumores tão cedo quanto 50 dias, demonstrou-se que pós-natal deleção do gene de p53 conduz a uma incidência tumoral de apenas 3% até 600 dias após a transdução recombinase Cre, indicando que o tempo de perda de p53 é um factor determinante para a incidência do tumor [23, 24].
(a) p53 ablação não resgatar ratos de letalidade induzida sT MCV. Kaplan-Meier curva de dose baixa (0,02 mg /g) TMX injetados
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
; p53
Flox /Flox
ratos (linha azul sólida, n = 26) e
Ubc
CreERT2
; p53
Flox /Flox
ratos (linha pontilhada azul, n = 10). rosa linhas indicam a sobrevivência de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
(linha sólida) Comprar e
Ubc
CreERT2
(linha pontilhada) ratos com tipo selvagem p53, como mostrado na Fig 1B para comparação com o fundo p53 nocaute (linhas azuis). (B) a expressão MCV sT produz tumores
in vivo
em
p53
ajuste nulo. 80% (05/04) dos ratinhos que sobreviveram mais de 60 dias após a injecção do tumor grosseiramente TMX desenvolver visível no baço e no fígado. Representativos de baço e no fígado com nódulos tumorais de p53.7F são mostrados com os correspondentes tecidos normais a partir de um ratinho de controlo C57BL /6. (C) Immunoblotting da expressão da proteína MCV St em tecidos do fígado e do baço de rato p53.7F) com tumores macroscópicos. Baço, músculos e tecidos do ouvido consistentemente mantido expressão sT mais de 60 dias após a injecção TMX. expressão St foi detectável em tecidos do fígado por immunoblotting apenas a partir de fígado com nódulos visíveis (p53.7F do mouse). sT MCV proteína foi detectada utilizando anticorpo CM8E6, e expressão Hsp /Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (D) O painel superior mostra a neoplasia anaplásico no baço e no fígado. Uma variedade de alterações proliferativas se observou no rim, onde o epitélio tubular distal são mais gravemente afectado, mas glomérulos (seta preta), células do epitélio tubular proximal (*), e intersticiais tecidos são relativamente poupadas de alterações proliferativas. O painel do meio mostra uma coloração imuno-histoquímica representante da expressão da proteína St em tumor do fígado, tumor baço e tecidos de rim de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
; p53
Flox /Flox
ratos. As amostras de tecido foram imunocoradas com MCV sT anticorpo (CM5E1). (E) O painel superior mostra um tumor no fígado ST induzidas, com imunorreatividade para a-actina de músculo liso (ASMA) eo painel inferior mostra K14 positividade em células tumorais dispersas.
Para determinar a histogênese de São neoplasia induzida, os tumores de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos foram imunocoradas com os marcadores para várias linhagens: CD45 (pan-linfócito), CD68 (macrófagos), actina de músculo α-lisa (músculo ASMA-lisa ), citoqueratina 14 (epitelial), citoqueratina 8 (epitelial), molécula de adesão neuronal (NCAM). As células tumorais foram uniformemente ASMA positivo. células tumorais dispersas positivos para o CK14 e MACN (figura 4E). Não vimos qualquer coloração com os outros marcadores, incluindo CD68 e CD45 (S6 Fig).
Ablation p53 é exigido para a transformação completa de MEFs por MCV sT
Dado que MCV ST é uma transformação oncoproteína em ratos sem p53, foram realizados ensaios de transformação utilizando MEFs isoladas de
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
,
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
,
Ubc
CreERT2
;
p53
Flox /Flox
e
ROSA
São
ratos. No momento do tratamento de 4 OHTMX, clones de MEFs isolado de dois independentes
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos formado colónias de 4 semanas após a semeadura célula única na cultura de agar mole (Fig 5A-5C). Nem a expressão MCV sT sozinho (
Ubc
CreERT2
;
ROSA
São
), nem p53 knockout sozinho (
Ubc
CreERT2
;
p53
Flox /Flox
) a formação de colónias induzida (Fig 6B). Estes resultados são consistentes com os nossos
In vivo
resultados Tumorigênese.
(A) MCV sT induz macia formação de colónias de agar na ausência de p53 em células MEF. células MEF isolado forma
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
,
ROSA
São
,
Ubc
CreERT2
; p53
Flox /Flox
e dois
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
; p53
Flox /Flox
embriões de ninhada foram tratadas com 500 nM 4OHTMX mais de 7 dias, e as células foram submetidos a ensaio de formação de colónias em agar mole. Asteriscos (*) indicam significância estatística
p . 0
05
. (B) as colónias em agar mole induzido por ablação p53. p53 ablação por si só não deu origem a formação de colónias. (C) Expressão da MCV St em MEFs de
Ubc
CreERT2
; ROSA
São
; p53
Flox /Flox
.
Wholemount, pele imunocoradas-K8 mostrando cúpulas toque de ninhada de controlo (A, C, F, H, K),
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
(B, D, G, I) e
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
(L) ratos que receberam TMX pelo P28 (A-D) ou E14.5 (F-I, K, L). Idade no momento da colheita de tecidos é mostrado para cada par de painéis. (E, J, M) Os gráficos que mostram a contagem de células de Merkel por cúpula toque para acompanhar painéis. * P 0,05, *** p 0,001. Barra de escala:. 10 um
MCV sT Expressão Aumenta Embryonic Merkel célula precursora Proliferação mas não afeta números de celular Adulto Merkel ou causa Tumorigênese
MCC expressa marcadores fenotípicos mais semelhantes às expressas pelo , pele residente células normais Merkel. Para examinar o efeito de S. neste tipo específico de célula, nós alvo ST para células de Merkel por meio de cruzamento
ROSA
São
ratos para
Atoh1
CreERT2 /+
ratos [25]. Atoh1 é um grupo fator Atonal proneural básico helix-loop-helix transcrição com função anti-oncogénica [26], que desempenha um papel crítico no desenvolvimento de células de Merkel [27]. O
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
ratos e controle
ROSA
São
ninhada receberam uma única dose de tamoxifeno (0,25 mg /g ) através de sonda oral no dia pós-natal 28 (P28) para activar a expressão sT especificamente em células de Merkel [28]. pele de volta foi colhida 7 dias ou 12 meses mais tarde e histoquímica para a Merkel marcador de células de queratina 8 (K8). Em ambos os pontos de tempo, o número de células de Merkel por cúpula toque foi menor no
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
ratinhos comparada com
Atoh1
+ /+
;
ROSA
São
controle camundongos, consistentes com efeitos reportados anteriormente de heterozigosidade no
Atoh1
lócus [28] (Fig 6A-6E). Em nenhum momento encontramos cúpulas toque com o número de células excepcionalmente elevados Merkel, células de Merkel ectópica ou evidência de formação de tumor. Estes dados sugerem que a expressão sT sozinho em células de Merkel adultos não induz a divisão celular ou carcinogênese.
mitótico
células Atoh1
+ progenitoras produzir células de Merkel maduros durante a embriogênese tarde [28]. Para estudar os efeitos da expressão sT sobre esta população, administrou tamoxifeno para represas grávidas em E14.5 e colhidas de embriões em E18.5 ou aos 5 meses de idade. Descobrimos que E18.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
ratos tiveram ~ 50% mais células de Merkel do que os controles da mesma ninhada, enquanto os 5 meses de idade
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
ratos tiveram ~ 30% menos células de Merkel do que seus controles da mesma ninhada (Fig 6F-6J). Não foram encontrados tumores em qualquer idade. Estes dados são consistentes com a expressão sT promover a mitose em populações de células em divisão ativa, e demonstrar que dome toque o número de células Merkel são regulados mesmo em face desse aumento de divisão. Como em animais adultos, expressão MCV sT não transforma essas células.
Para determinar se a expressão sT combinados e perda de p53 seria promover a proliferação de células de Merkel, administrou TMX para E14.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
São
;
p53
Flox /Flox
ratos e pele colhidas no P28. Nós não encontrou um aumento no número de células de Merkel e nenhuma evidência de desenvolvimento de neoplasias (Fig 6K-6M). Ao contrário de neoplasia fígado e baço induzida ST, estes dados sugerem que a expressão sT juntamente com
p53
eliminação é insuficiente para promover sustentada divisão celular Merkel ou tumorigênese.
Discussão
sT MCV transforma fibroblastos de roedores imortalizadas, tais como células NIH3T3 Rat1 e [14] e expressão sT virai é necessária para o crescimento de linhas celulares de cancro da MCV-positivos MCC [15, 16]. Os nossos dados actuais sugerem que a expressão de MCV no contexto de p53 promove a perda de lesões neoplásicas em ratinhos totalmente. Nós achamos que MCV sT induz a proliferação de células de Merkel embrionárias, mas é insuficiente para recapitular totalmente carcinoma de células de Merkel, independentemente do status p53.
Recentemente, Verhaegen et al demonstraram que a expressão sT específico do epitélio usando um promotor K5 em C57BL /6 ratos induzida lesões hiperplásicas que assemelham-se carcinoma de células escamosas
in situ
[18]. Este efeito proliferativo foi mediado através do domínio MCV sT o LSD, o que tem sido encontrado para segmentar várias proteínas de ligase E3 supressores de tumor [12, 13]. Em contrapartida, verificou-se que a indução pós-natal onipresente de expressão MCV sT era uniformemente letal para ratos após altas doses de injeção TMX. O nosso modelo de ratinho transgénico emprega um MCV sT ADNc com codões optimizados, o que resulta na expressão da proteína mais elevada do que a sequência de ADNc sT naturais (dados não mostrados), e os efeitos citotóxicos de aumento dos níveis de expressão sT MCV pode ser responsável por esta diferença. Orelha, pele, músculo e cérebro tecidos mantida expressão ST longa depois de uma dose baixa de injecção TMX, sugerindo que os ratos podem tolerar expressão quimérico de MCV St.
Spurgeon et al. também relataram que, quando o antigénio T genómico derivado de tumor (tanto ST e LT-MCC derivado truncado) é expresso sob um promotor constitutivo K14 em ratinhos FVB /N de fundo (
K14-MCPyV168
), dois terços de murganhos são viáveis, ao passo que o resto dos ratinhos morreram ou foram eutanizados em idade precoce, devido à subnutrição [17]. Obtivemos resultados semelhantes em nosso modelo.