Abstract

fuga Imune e metástase são as características de vários tipos de cancro, incluindo bexiga Câncer. Um dos mecanismos envolvidos nestes processos tem sido associada a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). Embora IDO é classicamente reconhecida por sua propriedade imunomoduladora, que apresentou efeitos IMUNOLÓGICA em alguns tumores. TGF-β1 é acreditado para contribuir para o desenvolvimento do carcinoma modulando moléculas imunossupressoras, incluindo IDO. Além disso, o TGF-β1 induz a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que é um passo crítico na capacidade de invasão de tumores e metástases. Investigou-se o papel de MT e IDO modulação na indução de EMT por TGF-β1 em células de carcinoma de bexiga T24 humana. Quando as células T24 foram incubadas com o inibidor da IDO (MT, 1-metil-D-triptofano), com TGF-β1, e com MT + TGF-β1, foi observada uma diminuição significativa da expressão e actividade IDO. Além disso, a regulação negativa de E-caderina e a regulação positiva de N-caderina e factores de transcrição EMT foram induzidos pelos tratamentos, confirmando a indução de EMT. knockdown mediada por siARN da IDO diminuição da expressão da E-caderina, mas não teve efeito sobre os factores de transcrição EMT. No ensaio de feridas-zero, o processo de migração acrescida foi intensificada quando as células foram incubadas com MT + TGF-β1. Estes efeitos foram associados a uma inibição da activação de Akt robusta. Após a inoculação de células T24 sob a cápsula do rim de ratinhos Balb /c nu, as células foram positivas para IDO no centro do infiltrado celular, sendo negativo na periferia, onde EMT é alta. Em conclusão, a inibição da IDO por TGF-β1 e MT é associado com EMT em células de carcinoma de bexiga T24 humana. MT tem efeito na potenciação EMT induzida por TGF-β1, independentemente da IDO. Este efeito IMUNOLÓGICA de MT deve ser considerada se IDO é o alvo para evitar a fuga imunológico no cancro da bexiga

Citation:. Brito RBO, Malta CS, Souza DM, Matheus LHG, Matos YST, Silva CS, et al. (2015) 1-Metil-D-triptofano Potencia Transição-TGF-β Induzida epitelial-mesenquimal em células cancerosas da bexiga T24 humanas. PLoS ONE 10 (8): e0134858. doi: 10.1371 /journal.pone.0134858

Autor: Michael Platten, Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha |

Recebido: 28 Janeiro, 2015; Aceito: 14 de julho de 2015; Publicação: 12 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Brito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa de são Paulo (FAPESP), concede-2012 /04423-0, https://www.fapesp.br/.

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

urinária câncer de bexiga é o tumor maligno mais comum do sistema urinário [1]. Embora a forma mais comum de cancro da bexiga humano é não-muscular invasiva (70% a 80%), 30% a 50% destes casos evolui para uma forma músculo-invasiva após ressecções repetidas, o que acaba por conduzir à morte específicas de cancro e metástase [2].

têm sido implicados na invasão tumoral e metástase de vários mecanismos, incluindo a transição epitelial-mesenquimal (EMT). Neste processo, uma célula epitelial polarizada assume um fenótipo mesenquimal, o que leva a uma perda de adesão celular à membrana basal, a activação da motilidade e invasividade e a produção de enzimas extracelulares de degradação da matriz-[3]. Diversas moléculas estão envolvidas na iniciação da EMT, incluindo as proteínas da superfamília TGF-β. TGF-β1 é um indutor importante de EMT em vários tipos diferentes de tumores [4], incluindo o cancro da bexiga [5]. Certas variações genéticas e aumento dos níveis plasmáticos de TGF-β são preditores potentes do risco de cancro da bexiga [6,7].

indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima que catalisa a degradação do aminoácido triptofano, o que leva à acumulação de metabolitos de triptofano, tais como quinurenina. Tal como descrito por Munn et ai., Ido tem um papel na interface e as funções materno-fetal de embriões para proteger contra o sistema imune materno [8]. Subsequentemente, IDO tem sido explorada para utilização como uma molécula imunomoduladora eficaz. Porque IDO é produzida por muitos tipos de células do sistema imune, incluindo as células dendríticas, macrófagos, e células T reguladoras, IDO tem sido implicada em desordens imuno-mediadas, tais como a rejeição de aloenxertos [9], doenças auto-imunes [10] e escapar imunidade anti-tumoral em câncer [11]. No que se refere o cancro, actividade IDO está presente em muitos tipos de tumores humanos, bem como os nódulos linfáticos de drenagem de tumores [11]; No entanto, o papel da IDO no crescimento do tumor é ainda mal compreendido. Enquanto expressão IDO está correlacionada com um prognóstico menos favorável para muitos tipos de câncer, incluindo colorretal [12], cervical [13], endométrio, mama [15], melanoma [16], ovário [17], e cancro do pulmão [14] uterino [18], expressão IDO está também associada a sobrevida livre de recidiva de pacientes hepatocelular [19] e a sobrevivência a longo prazo dos pacientes com carcinoma renal [20]. Embora não haja uma controvérsia sobre o papel do ido no cancro, moléculas que podem modular vias mediadas IDO têm sido vistos como promissor para o tratamento do cancro. Neste contexto, 1-metil-D-triptofano, um inibidor competitivo da IDO, tem sido intensivamente estudada como agente anticancerígeno. Actualmente, a associação de 1-metil-D-triptofano (MT) com docetaxel foi utilizado num ensaio clínico de fase I com doentes com tumores sólidos metastáticos [21]. No entanto, esta molécula pode actuar independentemente da actividade IDO [22], bem como para regular como triptofano via mTOR [23].

expressão da IDO foi encontrada não só em células do sistema imunológico que se infiltram no tumor e drenando-tumoral os gânglios linfáticos, mas também em células neoplásicas. No cancro da bexiga, a linha celular de carcinoma humano de transição T24 produz IDO constitutivamente em cultura [24], mesmo sem o envolvimento do sistema imunitário, que conduz à hipótese de que IDO pode ter um papel nos processos de não-imunes. Levina et al., Demonstraram que a sobre-regulação da IDO em células de cancro da mama aumentou a proliferação celular e a apoptose diminuiu de uma forma que foi independente dos efeitos imunológicos do ido [25]

.

Curiosamente, o TGF-β induz uma tolerogénico fenótipo em células dendríticas imunogénicas, e este efeito é mediado por IDO, através da activação da via PI3K /Akt [26]. Uma vez que o TGF-β induz o EMT em células de carcinoma da bexiga T24 [27, 28], a hipótese que a modulação de IDO podem ser associados com o TGF-β na indução de EMT em células de carcinoma T24. Neste estudo, analisamos o efeito de MT e o knockdown mediado por siRNA de IDO na EMT induzida por TGF-β em células de carcinoma da bexiga T24.

Materiais e Métodos

cultura celular

células T24 câncer de bexiga humana (HTB-4; American Type Culture Collection-ATCC, Manassas, VA, EUA) foram adquiridos a partir do banco de células da Universidade Federal do Rio de Janeiro. As células T24 foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com soro fetal bovino a 10% e penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e mantida a 37 ° C com 5% CO

2.

Para analisar o efeito de TGF-β1 na expressão IDO, células T24 foram cultivadas em placas de 6 poços (1X10

5 células por poço). As células foram incubadas com 1 ng /ml, 5 ng /ml ou 10 ng /ml de TGF-β1 (R D Systems Inc., Minneapolis, MN). Em meio isento de soro de McCoy 5A durante 48 horas (em triplicado)

Após a determinação da concentração óptima de TGF-β1 (5 ng /ml), células T24 foram cultivadas em placas de 6 poços e cultivadas até atingirem 75% de confluência. As células foram, então, mantidas em meio isento de soro de McCoy 5A durante 48 horas sob as condições seguintes quatro em triplicado: único meio (controlo); meio contendo triptofano mM metil-1 (MT; 1-metil-D-triptofano, gato 452483, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); meio contendo TGF-β1 (5 ng /ml); e meio contendo MT acrescido de TGF-β1. No final de 48 h, os sobrenadantes foram recolhidos para a medição da quinurenina, e as monocamadas celulares foram tratadas com tripsina para extracção de ARN. Esta experiência foi repetida para o isolamento de proteínas.

pequeno RNA de interferência (siRNA) transfecção

A fim de knockdown IDO endógena, as células T24 foram transfectadas com siRNA para IDO (Silencer Select inventariados 4.392.420, Ambion, Carlsbad, CA) ou com um siRNA de controlo não-direccionamento para o controlo de transfecção (Silencer Select controlo negativo inventariados 4.390.843, Ambion, Carlsbad, CA), utilizando Lipofectamine 3000 Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). Resumidamente, as células foram cultivadas em 6 bem-placas, e depois foram mantidas em meio de McCoy isento de soro contendo (por poço) 1? G de siRNA, 5 ul de P3000 Reagente, e 5 ul de Lipofectamina 3000 Reagente, durante 24 h. Após a transfecção, o meio foi removido e as células foram cultivadas durante 24 h em meio 5A de McCoy suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C com 5% de CO

2. Após este tempo de recuperação, as células foram incubadas com TGF-β1 (5 ng /ml, durante 48 h, em meio de McCoy isento de soro), exactamente como anteriormente descrito. Foram realizadas as seguintes quatro condições em triplicado: células T24 previamente transfectadas com controle siRNA (si-Control), sem TGF-β 1; células T24 previamente transfectadas com ARNsi IDO incubadas sem TGF-β 1 (siIDO); células T24 previamente transfectadas com ARNsi de controlo incubadas com TGF-β 1 (TGF-β); e as células T24 previamente transfectadas com IDO siRNA incubadas com TGF-β1 (siIDO + TGF-β).

RT-qPCR

O RNA total foi extraído utilizando PureLink RNA Mini Kit (Ambion Inc, Carlsbad , CA), de acordo com as instruções do fabricante, e a primeira cadeia de ADNc foi sintetizada por M-MLV (Promega, Madison, WI), após o tratamento de DNase (Promega, Madison, WI). PCR em tempo real foi realizada usando Green Power PCR Master Mix SYBR (Applied Biosystems, CA). primers específicos para TBP (

TATA caixa de ligação às proteínas

; encaminhar 5′-TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA-3 ‘e reverso 5′-TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC-3′; número de acesso NM003194), IDO (forward 5’-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3 ‘e reversa 5’- ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘; adesão número NM002164), e-cad (forward 5′-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3′ e reverso 5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘; o número de acesso Z18923), N-cad (forward 5’-TGCCCGGTTTCATTTAGGGG -3 ‘e reverso 5′-TCCCTCAGGAACTGTCCCAT-3′; número de acesso X57548), TWIST (forward 5’-AGAGATGCAACTAAGCCCTCT-3 ‘e reverso 5′-AAGCAGCTACTGACAGGCAC-3′; número de acesso Y11177), Caracol (forward 5’-ACCACTATGCCGCGCTCTT -3 ‘e inverso 5′-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3′; número de acesso NM005985), e espaçador (directo 5’-TGTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3 ‘e inverso 5′-GACCCTGGTTGCTTCAAGGA-3’; número de acesso NM003068) foram usadas. Em triplicado de cada amostra foram aquecidos a 95 ° C durante 5 min e, em seguida, submetido a 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 60 segundos e extensão a 60 ° C durante 60 seg. Estas reacções foram realizadas utilizando um Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, EUA). Depois de PCR em tempo real, o limiar de ciclo (C

T) foi determinada para o gene doméstico (TBP), bem como genes alvo utilizando as condições da linha de base e auto limiar automático. dados de expressão de genes normalizados, utilizando ΔΔC

t (ôc

t ôc referência-

t-alvo) e a fórmula 2

-ΔΔCt, foram utilizados para análise posterior.

Western blot

análise de Western blot foi realizada para analisar a expressão de IDO e Akt /pAkt sinalização ativação da via. Resumidamente, a proteína total foi extraído a partir de células T24 de tampão de lise (50 mM de base Tris, EDTA 1 mM, PMSF a 0,5 uM, com 0,001% de Triton X-100, AEBSF 0,1 mM, 0,08 uM de aprotinina, 4 uM de bestatina, 1,4 uM E- 64, 2,0 uM de leupeptina e pepstatina 1,5 ^ M). Cem microgramas de proteína total foram desnaturadas e carregado sobre um sulfato de dodecilo de sódio a 12% (SDS) electroforese em gel de poliacrilamida e, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose por electrotransferência semi-seco (Trans-Blot SD celular de transferência semi-seco; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Após o bloqueio com leite não gordo, as membranas foram incubados com 1: 250 de rato IDO anti-humano (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, MA) ou 1: 1000 de coelho anti-humano fosfo-Akt (MAB 2965; Cell Signaling Technology Inc ., Danvers, MA). Após detecção por (sistema de detecção de ECL; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) de quimioluminescência aumentada, as membranas anti-ido e anti-fosfo-Akt foram retirados com tampão de extracção (Tris-HCl 62,5, 2% de SDS, 0 , 1 M de 2-mercaptoetanol), e incubadas com 1: 5000 de rato β-actina anti-humano (A1978, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 1: Akt (MAB 4685 1000 coelho anti-humano; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), respectivamente. Para a detecção, 1: IgG anti-coelho conjugado com HRP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 1: 5000 de cabra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) anticorpos secundários 5000 de cabra anti-IgG de ratinho conjugados com HRP foram utilizados.

quinurenina medição

a HPLC foi realizada para medir a quinurenina nos sobrenadantes de cultura de células. As amostras foram desproteinizadas por centrifugação a 5000 g (15 min a 4 ° C) com ácido tricloroacético a 10% (1: 1, v /v). Em paralelo, uma curva padrão foi construída com as seguintes concentrações: 0,5 uM, 1,0 uM, 2,0 uM, 4,0 uM, 8,0 uM, e 16,0 uM. Após centrifugação, os sobrenadantes e os padrões foram filtrados através de um filtro carregado-seringa de 0,22 um e resolvido com uma fase móvel de acetonitrilo mais de sódio tampão de etilo (4:96, v /v), pH 4,7. Foram utilizados; Uma pré-coluna de 12.5X4.6 mm e uma coluna de 250×4,6 mm (Agilent Hypesil ODS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA 5 uM). O pico representando quinurenina foi detectada com o software Chemstation Agilent (G2170AA, Agilent Technologies, Santa Clara, EUA).

migração ferida-zero e transpo� ensaios de invasão

Para os ensaios de scratch-ferida, T24 As células foram semeadas em placas de 24 poços (5×10

4 por poço) e cultivadas até atingirem 80% de confluência (24-30 h). As células foram mantidas em meio isento de soro 5A de McCoy durante 24 h e depois tratou-se com o seguinte (em triplicado): TA (1 mM), o TGF-β1 (5 ng /ml), e TGF-β1 + MT. As células mantidas em meio isento de soro representado o controlo. Após uma incubação de 24 h com o tratamento, os sobrenadantes foram removidos e foi adicionado meio fresco (10% de FBS). Um zero por poço foi realizada utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL e quatro imagens por poço foram tomadas a ampliação de 40X de um microscópio invertido (Ti-S; Nikon Corp., Tóquio, Japão). Depois de três horas, imagens adicionais foram adquiridos. Cada área da ferida-risco foi calculado usando a ImageProPlus 6.0 do programa (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD).

Também foram realizados ensaios de invasão

Transwell. Transwells foram equipados com membranas (6,5 mm de diâmetro, tamanho de poro 8,0 | iM, Inc. Corning, NY) revestidos com Matrigel BD membrana basal da matriz (BD Biosciences, San Jose, CA) a uma concentração de 3 mg /ml, e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 2 horas. As células foram tratadas tal como descrito para o ensaio de feridas-zero, e em seguida semeadas em cima do revestimento de Matrigel com meio isento de soro (em triplicado). As células foram deixadas migrar durante 6 h e 24 h para uma câmara contendo um meio de McCoy suplementado com soro fetal de bovino a 20%. Após a incubação, as membranas foram fixadas em metanol e coradas com hematoxilina. O número de células que migraram foi determinada sob a ampliação do microscópio (400X).

Modelo animal para análise invasão

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use a Universidade Nove de Julho Institucional.

foram utilizados três BALB ratos pelados /c macho (5-6 semanas de idade). Os ratos foram mantidos em gaiolas ventiladas individualmente sob ar filtrado (ALESCO, Capivari, São Paulo, Brasil) com livre acesso a água e comida. A injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg /kg; cetamina-S, São Paulo, Brasil) e xilazina (10 mg /kg; Rompun, Bayer, Leverkusen, Alemanha) foi utilizado para alcançar a anestesia geral. Uma incisão de 10 milímetros lombar foi realizada para aceder ao rim esquerdo. células T24 (1X10

6) foram ressuspensas em 10 microlitros de PBS e inoculou-se sob a cápsula renal utilizando uma agulha 21G-100 ligado a um pi-seringa Hamilton (Hamilton Company, Reno, Nevada). Após a inoculação cuidadosa, a incisão capsular foi subsequentemente cauterizado. Os ratinhos foram monitorizados diariamente durante 28 dias. Em 28

th dia, os ratos foram anestesiados com cetamina /xilazina e laparotomia e toracotomia para verificar a metástase. Para cada rato, uma seção midcoronal do rim esquerdo foi fixado em solução Duboscq-Brasil durante 60 minutos, seguido de pós-fixação em solução de formol a 10% tamponado até parafina. As secções (3 mm de espessura) foram corados com hematoxilina e eosina e, em seguida, utilizado para imuno-histoquímica. A análise histológica foi utilizado para verificar a presença de células T24 no espaço subcapsular e parênquima renal.

A imuno-histoquímica

As secções de parafina foram submetidos a irradiação de microondas em tampão de citrato para aumentar a recuperação de antigénios. Biotina o bloqueio do sistema (X0590, Dako Co, Dinamarca) e bloqueio de leite sem gordura foram usadas antes da incubação do anticorpo primário. IDO rato anti-humano (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, MA) (01:25) foi usado como o anticorpo primário para a análise de expressão IDO. Para completar a sanduíche, as secções foram incubadas com reagentes LSAB + System-HRP (Dako; K0690 Co, Dinamarca). Finalmente, DAB substrato-cromogénio foi usada para completar a reacção (K346811; Dako Co, Dinamarca)

Análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± SEM.. Para dados paramétricos, análise de uma via de variância com comparações de pares foi realizada de acordo com a formulação de Newman-Keuls. Para dados não-paramétricos, Kruskal-Wallis ou Wilcoxon foi aplicado. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

TGF-β1 e MT inibir a expressão de IDO

A incubação de células T24 com TGF-β1 significativamente menor expressão IDO (Figura 1), para todas as concentrações testadas. Tal como ilustrado na figura 2A, o tratamento com expressão MT e MT + TGF-β1 significativamente reduzido de IDO em células T24 (expressão relativa de 0,16 ± 0,18 vs 1,00 ± 0,01). Este efeito também foi observado nos resultados de transferência de Western para a proteína IDO (Fig 2B). Para avaliar a actividade de IDO, quinurenina foi medida no sobrenadante das células T24 usando HPLC. A concentração de quinurenina foi marcadamente diminuída após incubação com MT, TGF-β1, e MT + TGF-β1 (0,59 ± 0,12 ^ M, 0,29 ± 0,02 ^ M, e 0,38 ± 0,06 pM, respectivamente, vs 3,45 ± 0,16 ^ M no controle ; p . 0,0001) (Figura 2C)

expressão IDO é regulada negativamente por TGF-β em células T24

(a) expressão IDO por PCR em tempo real, (B. ) Western blot para IDO, e (actividade C) IDO avaliada por medição quinurenina no sobrenadante.

MT potencializa a expressão do gene EMT

Uma diminuição significativa foi observada na expressão de Ecad com MT e tratamentos TGF-p1 (Fig 3A). Em contraste, a expressão NCAD aumentou significativamente com o tratamento com TGF-β1 (Fig 3B), um efeito que foi potenciado pela combinação de TGF-β1 com MT (mais do que 8 vezes versus TGF-β1 sozinho). Além disso, a expressão de factores de transcrição de EMT-associados (torção, Snail e espaçador) foi aumentada por TGF-β1, e o tratamento com TGF-β1 em combinação com MT intensificado este efeito (Fig 3C, 3D e 3E).

os níveis de mRNA relativas de (A) a e-caderina (marcador epitelial), (B) N-caderina (marcador mesenquimais), e (CE) factores de transcrição associada-EMT (torção, Snail e espaçador). Associação de MT e TGF-β1 potenciada EMT em células T24, diminuindo a expressão de E-caderina e upregulating genes indutores de EMT. * P 0,05 versus Controlo;

# p 0,05 vs. MT;

† p 0,05 vs. TGF-β

knockdown mediado por siRNA de IDO e expressão de marcadores de EMT

O uso de siRNA foi efetividade em silenciar a expressão do gene IDO. . Como demonstrado na Figura 4, siIDO diminuíram significativamente a expressão da IDO em células T24. Observou-se uma redução significativa da expressão IDO após estímulo com TGF-β1, efeito que foi intensificada quando associada a siIDO (Fig 4). Com relação aos marcadores de EMT, siIDO reduziu significativamente a expressão Ecad, e sua associação com TGF-β1 potencializa este efeito, no entanto, não houve significância estatística (Fig 5A). Embora o siIDO mostrou efeito na expressão Ecad, siIDO não teve nenhum efeito na expressão de N-caderina e fatores de transcrição EMT (Twist, caracol, e Slug) (Fig 5).

Foi utilizado um controle negativo siRNA para as condições de TGF-beta si-Controle e. Observou-se uma redução significativa da expressão em células IDO siIDO, e em células TGF-estimularam-p. A associação de siIDO e TGF-β induziu uma redução mais pronunciada da expressão IDO.

os níveis de mRNA relativas de (A) a E-caderina (marcador epitelial), (B) N-caderina (mesenquimais marcador), e (CE) fatores de transcrição associada a EMT (twist, Caracol e Slug). knockdown mediado por siRNA de IDO foi eficaz na diminuição da expressão de E-cad, e sua associação com TGF-β potenciou este efeito. No entanto, knockdown da IDO sozinho não teve qualquer efeito na expressão de N-CAD, assim como na expressão dos factores de EMT-transcrição. Apenas TGF-β agiu induzir a expressão de N-cad e fatores EMT-transcrição, e sua associação com siIDO não se alterou este efeito. * P 0,05 versus Controlo;

# p . 0,05 vs. MT

Risco-ferida e transpo� ensaios de invasão

No ensaio de ferida-zero, a capacidade de migração das células T24 foi avaliada por medição da área ocupada pelas células migrantes. Tal como demonstrado na Figura 6, 3 horas após a introdução do zero-ferida, MT e TGF-β1 induziu uma migração mais rápida das células T24 em comparação com células não tratadas. Este processo de migração acrescida foi intensificada quando as células foram incubadas com TGF-β1 mais MT (Figura 6A e 6B).

(A) As imagens foram capturadas a ampliação de 40X de um microscópio invertido, três horas depois da formação de zero. (B) o fechamento da ferida foi significativamente mais rápido em MT + TGF-β em relação ao controle.

invasão de células T24 foi estudada usando reconstituído Matrigel em transpo� câmaras. Após 6 horas de incubação, a actividade invasão elevada foi observada quando as células foram incubadas com TGF-β1 mais MT, embora o resultado não era estatisticamente significativa (Figura 7). Após 24 h de incubação, não foi detectada nenhuma diferença observável entre os diferentes grupos (Fig 7).

Embora um maior nível de capacidade invasiva foi observada em células T24 após 6 horas de TGF-β e MT + TGF- β tratamento, não se observou qualquer significado estatístico. Depois de um período de migração de 24 horas, não foi encontrada diferença.

Akt activação

Para analisar ativação da via Akt, foram realizados experimentos de transferência Western. Como demonstrado na Figura 8, a incubação de células T24 com MT, TGF-β1 ou MT + TGF-β1 promoveram a inibição da activação de Akt robusta.

PI3K /Akt activação foi avaliada por transferência de Western para Akt e fosfo- Akt em lisados ​​de células T24. Após 48 horas de incubação com MT, TGF-β, e MT + TGF-β, uma diminuição do nível de fosfo-Akt foi observada. A inibição da via PI3K /Akt está associada a EMT em células T24.

In vivo

análise

Para analisar a expressão de IDO

in vivo

, as células foram inoculados T24 sob a cápsula do rim de ratinhos nus. Quatro semanas após a inoculação, foram identificadas células T24 sob a cápsula renal. Além disso, as células T24 foram encontrados infiltração do parênquima renal para a medula renal (Fig S1). análise imunohistoquímica da expressão IDO revelou que subcapsular e infiltração de células T24 foram positivos para IDO. No entanto, a expressão da IDO foi especificamente localizada no centro do infiltrado celular (figura 9).

células ido-positivas foram encontradas no centro da infiltrado (seta), enquanto que as células ido-negativo foram predominantemente encontradas no a periferia do infiltrado (ponta de seta). IDO imunomarcação não foi observada no parênquima renal (asterisco).

Discussão

No presente estudo, investigamos o papel não imunológico de MT e IDO na progressão e disseminação do câncer , particularmente em EMT. Bexiga células de carcinoma T24 constitutivamente expressam IDO, mesmo na ausência de um sistema imune. Fomos capazes de induzir a EMT em células T24 com TGF-β1, e esse efeito se correlaciona com a regulação negativa da IDO. Quando usamos MT ou IDO siRNA, a EMT foi potenciada, especialmente por MT.

EMT é um processo em que as células epiteliais adquirir um fenótipo invasivo, levando a uma difusão sistémica das células malignas. Durante EMT, genes específicos são expressos que, finalmente, funcionar para desregulamentar vias bioquímicas intracelulares, o que contribui para o estabelecimento de um fenótipo maligno. Em nosso estudo, avaliamos o processo de diminuição da expressão de E-caderina seguido por aumento da expressão N-caderina, um processo chamado de “comutação caderina,” para caracterizar EMT em células T24 [29]. EMT desempenha um papel importante no cancro da bexiga, em que são necessárias motilidade, invasão e mecanismos anti-apoptóticos para a metástase [30].

TGF-β1 é um potente indutor de EMT em certos tipos de tecidos, incluindo o da bexiga Câncer. células T24 expressar TGF-β receptor 1, e a inibição à base de ARNsi de receptor de TGF-β 1 suprime a motilidade e invasividade de estas células [27]. Em nosso estudo, as células T24 adquiriu características mesenquimais, como expressão mesenquimais marcador e motilidade, após estímulo TGF-β1. Curiosamente, o tratamento TGF-β1 induzida EMT e expressão IDO inibida em células T24. Além disso, MT, que também diminuiu a expressão IDO, intensificou a EMT TGF-β-driven.

O knockdown mediado por siRNA de IDO reduziu significativamente a expressão da caderina-E, mas os marcadores mesenquimais não foram alterados. Porque MT aumentou significativamente a expressão de marcadores mesenquimais, estes resultados indicam que a Ido percurso possivelmente participa na EMT de células T24, mas TA tem um efeito potenciador EMT induzida por TGF-β1 independentemente da IDO. Metz et ai demonstraram que a MT tem efeito sobre as células dendríticas independentemente da IDO induzir a via mTOR (Metz). É importante notar que a mTOR está fortemente associado com EMT no cancro da bexiga [31]. É possível que medeia MT via mTOR em células T24, mas este mecanismo não foi avaliada em nosso estudo.

Nosso estudo é o primeiro a examinar a relação entre TGF-β1 e IDO em células T24. Contudo, existem estudos que demonstram que o TGF-β1 podem modular a expressão IDO em certos tipos de células. Yuan et al. demonstraram que enquanto que a expressão de IDO podem ser induzido nos fibroblastos humanos, após a estimulação com IFN-gama, TGF-β1 revoga este efeito, sem afectar a expressão de IFN-gama [32]. Em contraste, o TGF-β1 expressão induzida em células dendríticas IDO via PI3K /Akt e noncanonical vias NFK-p, que conduz a um fenótipo tolerogénico [26]. Os mecanismos de ligação a TGF-β e IDO não foram completamente elucidados, mas um mecanismo mais plausível foi descrito por Pallotta Grohmann e [33]. Seus estudos suportam a teoria de que TGF-β confere efeitos reguladores na síntese de IDO. Além disso, IDO pode exercer seus efeitos através de um mecanismo que é independente da sua actividade enzimática [33].

Em nosso estudo, avaliamos PI3K /Akt ativação da via utilizando Western blot para Akt /fosfo-Akt. O tratamento com TA e TGF-β1 diminuíram significativamente os níveis de fosfo-Akt, o que indica que o TGF-β EMT-impulsionado em células T24 está associada com a infra-regulação desta via. Em muitos tipos de células, EMT induzida por TGF-β está associado a via PI3K /Akt sobre-regulação; No entanto, em células T24 que permanece obscura. Al-Azayzih et ai. analisados ​​fosfo-Akt em células T24 após incubação com TGF-β1 (tal como utilizado nas nossas experiências, 5 ng /ml), e eram incapazes de determinar uma diferença nos níveis de fosfo-Akt [34]. A ausência de efeito sobre os níveis de fosfo-Akt pode ser devido à duração do tratamento TGF-β1. Enquanto eles usaram um período de incubação de 24 horas, foram utilizados 48 horas. Além disso, Iliopoulos et ai. usados ​​Akt – /- células para mostrar que Akt1 knockdown promovido EMT induzida por TGF-β em células MCF10A. Este efeito mostrou ser dependente da expressão de microRNAs específicos [35]. Neste contexto, o papel da Akt na EMT pode ser diferente, dependendo do sistema modelo.

Além de caderina comutação e aumentou significativamente a expressão de fatores de transcrição relacionados com o EMT (Twist, caracol, e Slug), células T24 tratados com TGF-β mais MT demonstrou aumento da capacidade de migração e invasão. Além de

in vitro

experimentos, as células T24 foram inoculados no espaço subcapsular renal de camundongos BALB /c nus. Após 4 semanas, as células T24 foram observados no parênquima renal para a medula. A análise imuno-histoquímica demonstrou que as células T24 no centro do infiltrado foram positivos para IDO, enquanto que as células periféricas foram IDO-negativo. É possível que as células periféricas do infiltrado perdido expressão IDO para adquirir um fenótipo invasivo. Mais estudos são necessários para esclarecer este mecanismo.

Em conclusão, MT e regulação negativa da IDO estão associados a EMT em células de carcinoma de bexiga humana T24, e este efeito pode ser desencadeada por TGF-β1. Embora a inibição IDO é atraente como terapia anti-câncer, porque IDO promove a tolerância aos tumores, os efeitos IMUNOLÓGICA mediadas por MT e outros moduladores IDO merecem consideração no cancro da bexiga. Como perspectiva, inibidores de IDO deve ser combinada com outras classes de medicamentos na terapia anti-câncer para minimizar possíveis efeitos adversos causados ​​por esses agentes.

Informações de Apoio

S1 Fig. Histologia do tecido renal após a inoculação subcapsular de células T24.

Analisar a invasão de células T24

in vivo

, nós inoculados 1X10

6 células sob a cápsula renal. Histologia (hematoxilina e eosina) foi avaliada 28 dias após a inoculação. (A) células T24 sob a cápsula renal (ponta de seta), e células B () T24 que se infiltram no parênquima renal para a medula renal (seta). parênquima renal é indicado com asterisco

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134858.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Estamos sinceramente grato a Angela Batista Gomes dos Santos e Samara para a sua assistência técnica.