Abstract

pâncreas adenocarcinoma ductal é um problema de saúde sem solução, com quase 75% dos pacientes diagnosticados com doença avançada e uma taxa de sobrevida de 5 anos em geral perto 5%. Apesar da forte ligação entre mortalidade e malignidade, os mecanismos por trás disseminação do cancro do pâncreas ea metástase são mal compreendidos. cultura patológica e celular correlativa análises sugerem que o receptor de quimiocinas CXCR4 desempenha um papel biológico na progressão do cancro pancreático.

In vivo

papéis para o CXCR4 ligando CXCL12 na malignidade do câncer pancreático foram investigados. CXCR4 e CXCR7 foram consistentemente expresso no epitélio normal e canceroso pancreático ductal, linhas celulares estabelecidas, e as células cancerosas primário derivado do paciente. Relativa às condutas exócrinas saudáveis, expressão CXCL12 foi patologicamente reprimida em amostras de tecido de cancro do pâncreas e linhas celulares derivadas do paciente. Para testar as consequências funcionais de silenciamento CXCL12, linhas celulares de cancro pancreático estavelmente expressingthe quimiocina foram manipuladas. Consistente com um papel para a CXCL12 como um supressor de tumor, as células que produzem a quimiocina wereincreasingly aderente e migração deficiente

In vitro

e fracamente metastática

In vivo

, em comparação com células de controlo. o crescimento do tumor Além disso, CXCL12 reintrodução significativamente reduzida

in vitro, jogue com tumores significativamente menores

in vivo

, levando a uma vantagem de sobrevivência pronunciado em um modelo pré-clínico. Juntos, estes dados demonstram um papel supressor de tumor funcional para a expressão normal da CXCL12 em ductos pancreáticos, regulando tanto andcellulardissemination crescimento do tumor para sítios metastáticos

Citation:. Roy I, Zimmerman NP, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 quimiocinas Expressão suprime o crescimento do cancro do pâncreas humano e metástase. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10.1371 /journal.pone.0090400

editor: Jeffrey K. Harrison, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de novembro de 2013; Aceito: 29 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Roy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do uma saudável Wisconsin eo Cancer Center MCW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Temos os seguintes interesses. Dr. Dwinell é um destinatário de uma patente (# 8404640) para o uso de CXCL12 no tratamento de neoplasias malignas e é uma co-fundador da proteína Foundry, LLC. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores. O título da patente é: “método de diagnosticar e tratar o cancro do cólon”

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é anunrelenting forma de câncer humano, sem técnica eficaz para o diagnóstico precoce. ou tratamento, e uma incidência quase igual a mortalidade [1], [2]. A maioria dos pacientes, no momento do diagnóstico, já tem doença localmente avançado ou metastásico, fazer a ressecção cirúrgica do tumor primário de valor terapêutico limitado [3] terapias farmacêuticas para .Current PDAC são inadequados como a grande maioria dos doentes com cancro pancreático morrem de micro – ou doença metastática macro-[4]. É necessária uma melhor compreensão dos mecanismos biológicos subjacentes a agressividade de PDAC. Embora estudos recentes tenham determinados factores moleculares envolvidos na progressão da PDAC [5] – [7], pouco se sabe sobre os mecanismos biológicos que regulam a motilidade celular e, por sua vez, metástase. citocinas quimiotácticas ou quimiocinas, jogar keyroles na migração celular, e são capazes de coordenar os vários aspectos da maquinaria de migração celular. Através da activação dos seus receptores, chemokinesregulate várias facetas da fisiologia normal, incluindo o tráfico de leucócitos, a migração celular epitelial necessário para o fechamento da ferida, a vascularização dos tecidos, e do desenvolvimento de órgãos durante a embriogénese [8] – [10]. Anteriormente, o nosso laboratório revealedthe importância da expressão dupla da quimiocina CXCL12 e o seu receptor cognato CXCR4 na migração do enterócito, a cicatrização de feridas, angiogénese e [11] – [16]

Vários estudos têm implicado um papel de quimiocina. receptores, em particular, CXCR4 e CCR7, em progressão e metástase de câncer [9], [17] – [22]. expressão de CXCR4 tem sido associada com a doença maligna mais 20different de cancros [17], [23]. Foi anteriormente demonstrado que a CXCL12 é expressa em células epiteliais normais no intestino e glândulas mamarias, mas é epigeneticamente silenciado em cancros da mama humano e cancro colorrectal [24], [25] .Esta padrão de repressionresults CXCL12 gene nas células de tumor cuja quimiocina – receptor profilesmirror que de leucócitos altamente móveis, que expressam os receptores CXCR4 e CXCR7 mas não o ligando. Nós mostramos que re-expressão de CXCL12 diminuiu a capacidade das células da mama e cancro colorectal de metástase [24] – [26] estudos .Several haveextended essas conclusões seminais para mostrar efeitos benéficos da CXCL12 autócrina em mama, pulmão, gástrico e cabeça e cancros cervicais [27] – [30]. Perda de CXCL12expression no osteossarcoma e câncer de mama tumor paciente specimenswas correlacionados com pior prognóstico [31] – [34]. No cancro do pâncreas, relatórios conflituosos e incompletos sugerem que a expressão quer CXCL12 é elevado ou CXCL12 que não é expresso na grande maioria dos pacientes [35], [36]. Assim, enquanto um crescente corpo de evidências sugere um papel tumor-supressora de CXCL12 na malignidade do câncer humano, seus papéis mecanicistas em PDAC continuam a ser mal compreendido.

O modelo predominante de metástase do câncer é que os tumores malignos espalhou para tecidos distantes através a sobre-expressão de CXCR4 [22], [37], [38], assim sensibilizar células malignas para espalhar, em resposta a gradientes de CXCL12 distantes produzidos por órgãos de destino metastáticas. Este modelo também foi utilizado para explicar PDAC metástase, como vários relatórios documentar a expressão de CXCR4 por linhas celulares de carcinoma do pâncreas e tecidos humanos [39] – [42]. No entanto, nenhum desses estudos foram rigorosamente paralela examinaram a expressão de CXCL12 ou CXCR7 no contexto de CXCR4 ou definido expressão de qualquer um dos três componentes deste eixo de quimiocina em objectivos epithelium.The pancreáticas normais do nosso estudo foram determinar o perfil de expressão e papel funcional do eixo CXCL12-CXCR4-CXCR7 em ambos os pâncreas normais e malignas saudáveis. Nisto, os nossos dados demonstram que, embora a expressão do receptor é aumentada, CXCL12 expressão é significativamente diminuída no tecido ressecado PDAC e uma bateria de linhas de células de cancro em comparação com ofpancreatic pâncreas normal. expressão CXCL12 foi transitoriamente restaurado usando inibidores da reintrodução repression.Stable epigenética de CXCL12 em células PDAC impediu dirigido a migração celular e metástase hepática e retardou o crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

, resultando em aumento sobrevivência em modelos pré-clínicos.

declaração de Ética Materiais e Métodos

pancreata identificou-de normais, amostras de tecido PDAC e células derivadas de pacientes isentos, únicas PDAC foram obtidos a partir o Surgical Oncology biorrepositório usando um Medical College of Wisconsin (MCW) InstitutionalReview Board # 4 protocolo aprovado. Tecidos e células dentro do biobanco foram obtidos de pacientes após consentimento informado escrito, assinado e são codificados e de-identificados, com informações de identificação pessoal não compartilhadas com investigadores de pesquisa. estudos rato de xenotransplante pré-clínicos foram concluídas usando protocolos e procedimentos documentados em uma Uso de Animais de aplicação estabelecida (AUA076) aprovado pelo Comitê Animal Care e Use o MCW Institucional e em conformidade com as orientações fixadas pelo Office of Laboratory Animal Welfare e de acordo com o Guia para o Cuidado e utilização de LaboratoryAnimals. Todos os ratinhos foram alojados sob condições isentas de agentes patogénicos, receberam alimento e água ad libitum, e mantidos num 10hr: 14-h luz /escuro no ciclo de uma sala com temperatura controlada (25 ± 2 ° C) .Animals foram eutanizados na conclusão do estudo ou na sequência de sinais de sofrimento ou baixa condição corporal, avaliada por profissionais de laboratório treinados e confirmado por veterinários pessoal MCW Biomedical Centro de Recursos para melhorar a dor e angústia associada à formação do tumor.

linhas celulares de cancro pancreático humano

Panc1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420), as linhas celulares Capan2 (HTB-80), e HPAFII (CRL-1997) foram adquiridas a partir do ATCC. linhas de células MiaPaCa2 Panc1 e foram mantidas em DMEM suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS). As linhas celulares Capan2and HPAFII foram mantidas em 10% (v /v) de FBS suplementado 5Aor meio MEM de McCoy, respectivamente. Em algumas experiências, as células cultivadas em meio normal foram tratados diariamente com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza) ou tricostatina-A (Merck Biosciences). linhas celulares MiaPaCa2 foram transfectadas com Firefly-luciferase sob seleção zeocina. células MiaPaCa2 que expressam luciferase resultantes foram subsequentemente transfectadas com plasmídeos que codificam quer eGFP ou CXCL12 humana, e os clones cultivados sob condições de selecção de neomicina [26]. As linhas celulares foram de-identificada de todos os parâmetros de identificação de pacientes Anuentes individuais com câncer de pâncreas e foram confirmados como sendo de origem PDAC seguinte cariótipo DNA e análise de expressão proteica.

tissuespecimens pancreático humano

ductos normais e lesões pancreáticas intraepiteliais foram isolados exclusivamente a partir de devoluções de tecidos normais adjacentes de transplante de órgãos ou de operações pancreáticas que não envolvam PDAC ou outras doenças malignas exócrinas. estado da doença desses tissueswas normais e tumorais confirmados por um pathologist.A total certificado de bordo de 25 tecidos de 21 pacientes diferentes foram utilizados para análises normais. Um total de 82 tecidos a partir de 29 doentes diferentes foram usados ​​para análises de tumor. Dos 29 pacientes que fornecem tecido PDAC, 11 pacientes tinham recebido terapia neo-adjuvante.

RT-PCR

O ARN foi isolado a partir de células e de espécimes de tecidos usando o kit RNAeasy (Qiagen) e tratada com ADNase (Ambion), convertido em ADNc, e CXCL12, CXCR4, CXCR7, e a expressão de GAPDH transcrição analisados ​​tal como definido anteriormente e optimizado para a eficiência de uma gama linear [24], [43] .A região da região 5 ‘não traduzida de o gene da lectina de ligação a manose foi amplificado para detectar contaminantes de ADN genómico [12]

Immunoanalyses

lâminas não coradas foram gerados a partir de amostras de tumor pancreático e CXCL12 imunocoradas usando um anticorpo a partir de R . D Systems (mab350 ). Citoqueratina-19 (CK19) (ab7754), CXCR4 (ab2074), CXCR7 (ab38089 ab72100), e Ki-67 (ab15580) foram detectados usando anticorpos de Abcam.Visualization foi feito utilizando anticorpos secundários-peroxidase de rábano conjugada e o 3,3′-diaminobenzidinePeroxidase Substrato Kit (Vector Labs). Para evitar a interferência de diapositivos de fundo não foram contra. os níveis de expressão da proteína foram avaliadas usando uma escala de 4 pontos padrão [0 = ausente, 1 = fraco, 2 = mista, e 3 = forte intensidade de coloração] [44]. As análises foram independentemente completado por um investigador cego para o estado da doença e protocolo de imunocoloração. proteína CXCL12 secretada a partir do sobrenadante de células de cancro do pâncreas cultivadas em meio isento de soro foi detectado pelo sanduíche ourpreviously estabelecida método ELISA usando anticorpos a partir de R D Systems (monoclonal de ratinho e CXCL12 humana (MAB350) e de cabra CXCL12 anti-humano (BAF310) [24 ] .Cell CXCR4 superfície ou CXCR7was detectado utilizando os anticorpos acima mencionados (Abcam) ao longo de anticorpos secundários conjugados withFITC utilizando o nosso método previamente estabelecida [43]. Resumidamente, as células foram cultivadas em meio de crescimento normal, suspenso por meio de tampão de dissociação isento de enzima, lavou-se usando gelada PBS estéril, e, em seguida, incubadas numa solução de bloqueio contendo BSA e soro de anticorpo secundário. Após o bloqueio, as células foram primeiro incubadas com anticorpo primário e depois com anticorpo secundário conjugado com FITC. Finalmente, as células foram fixadas e analisadas por citometria de fluxo ( LSR II, BD Biosciences).

In vitro

ensaios tumorigênese

as células foram colocadas para o bem superior, com quimio-atrativos adicionados ao poço fundo e transpoço migração ou quimioinvasão enumeradas num conjunto representativo de imagens tiradas após a coloração fluorescente, tal como descrito anteriormente [43], [45]. A membrana bem superior foi revestida com colagénio em ensaios de migração e com Matrigel (BD Biosciences) na invasão assays.Panc1 e migração de células HPAFII foi medida após a estimulação de 24 horas em transwells durante a migração de células MiaPaCa2 foi medida após 6 horas.

proliferação inicial e apoptose de linhas celulares PDAC foi definida utilizando o ensaio de citometria de fluxo Viacount (Millipore), ou /7 ensaio Glo (Promega) .Briefly, as células foram colocadas em placas em 10% (v /v) de soro contendo a caspase-3 forma, e uma vez aderente (durante a noite) foram mudadas para meio isento de soro. análise do ciclo celular foi realizada utilizando coloração com iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo, como foi feito anteriormente [43]. Em algumas experiências, as células foram cultivadas em 1% (v /v) de meio contendo soro após 24 horas de starvation.Gemcitabine soro (GEM), uma droga quimioterapêutica bem estabelecida em doentes com cancro do pâncreas, foi utilizado como um controlo positivo para o crescimento diminuiu e aumento da apoptose.

In vivo

estudos e imagem de bioluminescência

Um heterotópico modelo de injeção interna do baço estabelecida [46] foi usedto avaliar homing metastático e extravasamento no fígado. Foram anestesiados murganhos SCID imunocomprometidos seis semanas de idade e 1 × 10

6MiaPaCa2luciferasecells foram injectados no spleenthrough uma excisão da parede lateral e o crescimento de tumores e metástases monitorizada utilizando imagem de bioluminescência cada 7 dias, utilizando uma abordagem descrita previamente [26]. Após 28 dias, os ratinhos foram sacrificados e a formação do tumor no fígado e baço medido

ex vivo

utilizando imagiologia de bioluminescência. Um modelo ortotópico foi empregado como estabelecido anteriormente [47], com 1 × 10

6 células injetadas no pâncreas de ratos SCID e progressão da doença monitorados. Os ratinhos foram retirados do estudo quando thetumor tamanho atingido 1000 milímetros

3 e 1 volume de 10 ×

9P /seg /cm

2 /steradianradiance.Three ratos enxertados com células que expressam CXCL12 foram removidos para não veterinária razões estudo devido a gaiola-luta interna.

análises estatísticas

As comparações múltiplas entre os grupos foram analisadas usando uma ANOVA one-way e uma análise Dunnett

post-hoc

usado para identificar diferenças de pares (GraphPad Prism 4). análises emparelhadas foram calculados usando um Mann-Whitney ou teste log-rank quando apropriado. A significância estatística foi definida como

P

≤0.05.

Resultados

recíproco CXCL12, expressão CXCR4, e CXCR7 no adenocarcinoma ductal pancreático

As funções do CXCR4 , CXCR7 ou CXCL12 na progressão do cancro pancreático permanecer baseado em limitado analisa sem análise simultânea de todos os três componentes quimiocinas, tanto tissue.Immunostaining normais e doentes de anticorpos específicos de tecido de série sectionswith, coloração CXCL12 revealedrobust em células epiteliais ductais normais de sinalização, com os mesmos epitheliaalso a coloração positiva para a CXCR4 e CXCR7 (Fig.1A a Fig. 2A). expressão CXCL12 quimiocina foi especificamente restringida ao compartimento de ductal e ausente das células acinares e do sistema endócrino, ambos os quais coradas para os receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR7 (dados não mostrados). A incubação das secções paralelas com anticorpos de controlo de isotipo confirmedspecificity (Fig. 2A). A seguir, examinou expressão em lesões pré-malignas do pâncreas, conhecidos como pâncreas Neoplasias intra-epiteliais (PanINs) [48] – [51]. Tal como mostrado na Figura 2C-D, CK19 + PanINsexpressed tanto CXCR4 e CXCR7. Por comparação, variável CXCL12 coloração wasmore, com tomarkedly misturado diminuição da expressão em comparação com PanINs ductos pancreáticos normais (Fig.2C-D). Em uma análise limitada, não houve diferenças significativas na expressão de CXCL12 pode ser detectado entre lesões PanIN1, PanIN2 e PanIN3.

Cortes seriados de tecido pancreático normal e doentes foram coradas para CXCL12, CXCR4, CXCR7 e CK19. coloração CXCL12 aparente nas condutas exócrinas normais foi diminuída em tecido PDAC. CXCR4 coloração aumentada em PanIN e PDAC em relação ao epitélio ductal normal. expressão CXCR7 foi variável no epitélio normal, lesões Panin e PDAC. (A) tecido normal de um único paciente com pâncreas saudável representa observações de 25 tecidos normais diferentes de 21 pacientes individuais. (B) do tecido PDAC de um paciente representa observações de 82 diferentes tecidos de 29 pacientes diferentes. 1000 × ampliação representa a caixa de inserção em 200 ×. (C) A coloração foi quantificada por pontuação cego de secções em série em relação à coloração de CK19. (***) Denota

P

≤0.001.

representativos 200 × imagens da mesma (A) Normal ou (B) adenocarcinoma ductal (PDAC) tecidos pancreáticos mostrados em 1000 ampliação × na Figura 1. imagens da seção de série representativos de uma lesão pancreática neoplasia intestinal (PanIN) a (C) 200 × ou (D) 1000 × ampliação. secções de tecido em série foram imunocoradas com anticorpos a CK19, CXCL12, CXCR4, e CXCR7, ou os controlos de isotipo. n = 25 tecidos normais diferentes de 21 pacientes individuais, 82 tecidos diferentes de 29 pacientes PDAC diferentes, ou 19 lesões pancreáticas intraepiteliais patologicamente confirmado.

Análise do tecido tumoral PDAC revealeda mais e mais acentuada, de extinção de CXCL12 em CK-19 + células tumorais (Fig.1b, Fig.2B). No tecido tumoral heterogénea contendo glândulas tanto malignas e normais, CXCL12 coloração foi diminuída em células malignas, butpreserved em células ductais normais adjacentes (dados não mostrados). Análise de tecido de série sectionsrevealed que o tecido maligno com baixos níveis de CXCL12had um aumento recíproco em CXCR4, bem como CXCR7, coloração (Fig. 1B, A Fig. 2B). A quantificação da intensidade da imunocoloração CXCL12, CXCR4, e CXCR7 confirmada a diminuição significativa na expressão de CXCL12 durante progressionfrom normal precursor PanIN de tecido pancreático maligno (Fig. 1C). Em contraste, a expressão de CXCR4 foi elevada em comparação com PanINsand PDAC condutas normais (Figura 1C). Scoring de expressão CXCR7 revelou um padrão bifásico com menor expressão que ocorre na fase PanIN e maior expressão recorrente em PDAC (Figura 1C) .Quando os pacientes foram subdivididos em grupos dependentes da terapia neo-adjuvante ou não tinham recebido, os pacientes que receberam regimes padrão de cuidados de gemcitabina ou terapia folfirinox [52] – [54] tinham significativamente (

P

≤0.05) pontuações mais altas para a expressão de CXCL12 (0,82 ± 0,18) em comparação com pacientes que não receberam terapia neoadjuvante (0,43 ± 0,09)

expressão CXCL12 e regulação epigenética em linhas celulares de cancro pancreático

para caracterizar ainda mais quimiocinas -. a expressão do receptor e identificar um modelo adequado para estudar a função de CXCL12 no PDAC,-paciente primário derivada e linhas celulares de cancro pancreático estabelecidos foram analisados ​​por meio de RT-PCR utilizando os nossos conjuntos de iniciadores previamente otimizadas para CXCL12, CXCR4, e CXCR7 [24], [43]. RT-PCR indicaram consistente falta de CXCL12 transcrição no primário derivado do paciente, bem como Panc1, MiaPaCa2, Capan2, e linhas celulares HPAFII (Fig.3-B). De acordo com a análise imuno-histoquímica, CXCR4 ARNm foi mantido em 7of as 8 linhas celulares PDAC, enquanto que a expressão foi mais variável CXCR7 (Fig.3-B). A citometria de fluxo confirmou a localização na superfície celular de CXCR4 e CXCR7 em linhas celulares representativas (Fig.3C). Para determinar se a falta de expressão CXCL12 reflectida silenciamento epigenético, as células foram tratadas com doses tituladas de o inibidor da metiltransferase de ADN 5-aza. O inibidor resgatado expressão CXCL12mRNA em linhas celulares representativas (Fig.3D). O tratamento com o inibidor de histona desacetilase tricostatina-Aalso restaurado de expressão em células de CXCL12 Capan2 (Fig. 3E). Com base em nossas investigações anteriores que examinaram os mecanismos específicos de hipermetilação do promotor CXCL12 em colorretal e de mama [24], [25], estes dados sugerem que a expressão CXCL12 é regulada através de mecanismos epigenéticos no câncer de pâncreas como well.Cumulatively, thesedata indicam CXCL12 gene repressão em tissueand humana uma bateria de nova linha e estabeleceu celular PDAC lines.The celular MiaPaCa2 foi identificado como um modelo ideal, como os seus CXCL12-CXCR4-CXCR7 imita padrão de expressão que observadas no tecido PDAC humano maligno.

RT- A análise de PCR revelou que (A) derivado de paciente linhas celulares de cancro pancreático (# 1, # 2, # 3, # 4) ou (B) As linhas celulares estabelecidas faltava expressão de CXCL12 e mantida a expressão de CXCR4. CXCR7 ARNm estava presente em 3 de 8 a detecção de citometria de PDAC lines.Flow (C) de CXCR4 ou a expressão da proteína de superfície CXCR7. As linhas celulares treatedseven dias com uma curva de concentração de (D) de 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza) restaurado expressão de CXCL12.Linestreated 4 dias com uma curva de concentração de (E) Tricostatina-A (TSA) restaurado expressão de ARNm de CXCL12 em células Capan2.

CXCL12 re-expressão em células PDAC disruptedchemotaxis humanos, aumento do potencial adesiva, e diminuiu a metástase hepática

O paradigma convencional para quimiocinas mediada metástase das células cancerosas é que a expressão de CXCR4 é pró-metastática. Este modelo deriva da capacidade de CXCL12 exógena para estimular a migração de células cancerosas

em

vitro [13], [45], [55]. Como esperado, a medição do potencial de migração nativa de várias linhas de células pancreáticas CXCL12 deficiente revelou que as células que expressam o CXCR4 PDAC migram em direcção a estimulação CXCL12 aguda (Fig. 4A). É importante ressaltar que as células Panc1 e MiaPaCa2 migraram em direção CXCL12 em bifásico da concentração maneira dependente consistentes com o entendimento atual da migração quimiotática [55], [56]. A linha celular HPAFII que faltava a expressão de superfície de ambos os CXCR4 ou CXCR7 era incapaz de migrar em resposta ao tratamento CXCL12 (Fig. 4A). Panc1 cellsalso invadido uma matriz extracelular em resposta à estimulação exógena CXCL12 aguda (Fig. 4B).

(A) células MiaPaCa2 Panc1 e migraram em direcção gradientes exógenas de CXCL12, numa gama de 1 nM a 1000 nM sob sérica condições livres (*), (**) e (***) denote

P

≤0.05,

P

≤0.01, e

P

≤0.001, respectivamente , em comparação com células não estimuladas (NS). células HPAFII receptores nulo não migraram em resposta a CXCL12. (B) CXCL12 dirige quimioinvasão Panc1 célula em um tampão de Matrigel tridimensional. O controlo positivo (+) foi de 10% de meio contendo soro. (*), (**) E (***) denote

P

≤0.05,

P

≤0.01, e

P

≤0.001, respectivamente, em comparação com células não estimuladas (NS).

acreditamos que a resposta pro-metastática de células PDAC é devido ao silenciamento de expressão de CXCL12. Para testar essa expressão da quimiocina foram-introduzido, usando a integração do plasmídeo doublestable, em células MiaPaCa2. As células foram primeiro estavelmente transfectadas com luciferase do pirilampo-e, em seguida, transfectadas com os genes adicionais usando uma segunda selecção de clones que expressam reagent.Several CXCL12 foram gerados ao longo com um clone de controlo transfectadas com eGFP, cada um exibindo níveis equivalentes de actividade de luciferase (Fig.5a-B ). Mais importante, a falta de produção de quimioquina foi confirmedby ELISA em Panc1, MiaPaCa2, Capan2, e linhas celulares HPAFII (Fig. 5C). produção de quimioquina funcional em clones que expressam CXCL12 em comparação com os clones que expressam GFP Para se das células MiaPaCa2 foi validado por ELISA andtranswell migração de células U937 (Fig.5C-D), as células que segregam .MiaPaCa2 CXCL12demonstrated uma redução significativa da resposta migratória a CXCL12 TGF-pou , ambos os pilotos conhecidos de

in vitro

migração celular PDAC (fig.6a-D). Dada a importância do potencial adesiva nas habilidades metastático de células cancerosas, adesão celular foi próxima medida. CXCL12 células positivas foram significativamente mais aderente para cultura de tecidos plasticcompared a quimiocina células nulos (Fig. 6E). Estas

In vitro

dados indicam que o potencial maligno total de células de cancro do pâncreas, tanto na capacidade destas células para migrar e evitar a adesão do substrato, é reduzido na sequência de reintrodução do transcrito em células CXCL12 PDAC.

os níveis de luciferase em GFP de controlo ou três diferentes (31, # 2, # 3) CXCL12-clones que expressam MiaPaCa2 como medido por espectrofotometria (A) ou 100 IVIS-Imager biofotônica (B). Os níveis de CXCL12 foram medidos por ELISA (C) em linhas de células estabelecidas PDAC bem como GFP e os clones MiaPaCa2-luciferase-expressando CXCL12. (D) CXCL12-secretado pelos clones MiaPaCa2-luciferase transfectados # 1 e # 2 U937 estimuladas quimiotaxia. As células tratadas com o anticorpo neutralizante para CXCL12 (αL12) confirmou a especificidade de U937 quimiotaxia. Valores em A, C, e D são a média ± SEM, n = 2-3.

ensaios de migração (A) Transwell revelou reduziu significativamente a quimiotaxia de clones que expressam CXCL12 (# 1 e # 2) em comparação com as células ligando nulos (GFP). Atractivos eram meio isento de soro (-), 10% de soro (+), ou 10 nM CXCL12 (L12) em meio isento de soro. denotam

P

≤0.01 e

P

≤0.001, respectivamente, em comparação com 10 células GFP estimulada pela CXCL12 nm n = 5. (B) CXCL12 re-expressão diminuída de TGF-β (5 ng /mL) induzida por quimiotaxia em relação às células CXCL12-nulo. (##) Indica a

P

≤0.01 em comparação com as células GFP TGF-p estimulada por, n = 4. (C) (D) Imagens representativas de experiências em (A) e (B), respectivamente. (E) células que expressam CXCL12 foram significativamente mais aderente ao plástico de cultura de tecidos em comparação com as células CXCL12-nulo. As células não tratadas = (-), o anticorpo de neutralização para a actividade CXCL12 = (αL12), e um controlo positivo = 1 ng /mL de EGF (+). (##) Indica a

P

≤0.01 em comparação com células de controlo estimuladas com soro a 10%. (*), (**) E (***) denote

P

≤0.05,

P

≤0.01 e

P

≤0.001, respectivamente, em comparação com GFP células não estimuladas, n = 7.

a seguir, procurou determinar se o aumento adesiva simultânea e diminuiu migratoryphenotypes em células PDAC seria suppressmetastatic espalhar

in vivo

usinga mouse modelo de xenotransplante heterotópico. células CXCL12-nulo expressando CXCL12-e foram injectados no baço de ratinhos SCID. Mais de 28 dias, a

in vivo

rastreamento de células indicou que, em comparação com células de controlo, houve uma alteração significativa na capacidade das células MiaPaCa2 expressando CXCL12 para disseminar longe do local inicial de inoculação (Fig.7A -B).

ex vivo

análise indicou que a luminescência no local da inoculação do baço não foi alterada, enquanto que os ratinhos injectados com PDAC que produzem CXCL12had carga de tumor hepático significativamente menor do que os ratinhos injectados com células de controlo de GFP (Fig.7C-E). Estes dados sugerem que CXCL12 altera especificamente a capacidade das células de câncer de pâncreas de casa para o fígado, um órgão com alta expressão de CXCL12 e um destino metastático comum dos pacientes PDAC.

(A) imagens bioluminescência representativos de ratos xenoenxerto com GFP ou células a implantação expressando CXCL12 (dia 0) ou final do estudo (dia 28). (B) de corpo inteiro

in vivo

radiância ao longo do tempo da GFP e CXCL12-ratos. (C)

ex vivo

radiância do baço excisados ​​(C), que reflecte as células de tumor no local da injecção, ou o destino metastático (D), refletindo diminuição metástases hepáticas de células que expressam a CXCL12 relativa células GFP . (**) Denota

P

≤0.01, n = 4-5. (E) Representante H . E imagens mostrando massa tumoral pronunciada no fígado de controle (GFP), em relação ao experimental (CXCL12) ratos xenoenxerto proliferação celular

concomitante CXCL12, expressão CXCR4 e CXCR7 diminuiu tumor e metástases e sobrevivência prolongada em um modelo pré-clínico PDAC

Anteriormente, havia observado que re-expressão de CXCL12 em células de câncer colorretal levar a um aumento anoikis, apoptose descolamento base [24], [43]. Testamos se re-introdução de CXCL12 em células PDAC mudaria sua apoptose ou potenciais de proliferação. Em condições livres de soro, um aumento da apoptose foi detectada em células de cancro do pâncreas que expressam CXCL12 aderentes quando comparados com os controlos que expressam GFP, embora esta resposta foi atenuada com a adição de soro (Fig. 8A-B). Usando um modelo estabelecido para o estudo da apoptose induzida por desprendimento, as células foram cultivadas em poli-HEMA [43]. Tal como acontece com as células aderentes, a apoptose foi aumentada em células PDAC CXCL12-positivo não-aderentes comparação com os controlos, mas mais uma vez a adição de soro resultou em nenhuma alteração na apoptose (Fig.8C-D). número de células manteve-se inalterada entre as populações CXCL12-positivos e negativos de células não-aderentes (Fig. 8C-D).

A apoptose de células GFP e MiaPaCa2 expressando CXCL12 foram avaliados utilizando a caspase 3/7 assay.Cells glo foram deixados em jejum durante 24 horas e cultivadas em 0% de soro (a, C) ou 1% de soro (B, D) contendo meio. (A-B) A apoptose em células que expressam CXCL12 aderentes foi elevada em comparação com quer os clones que expressam GFP em condições isentas de soro, sem qualquer alteração visto no soro 1%. GFP-células werestimulated com gemcitabina 100 uM como um controlo. (C-D) para medir o número de células e desprendimento apoptose base de células em suspensão, as células MiaPaCa2-luciferase foram cultivados em poli-HEMA. Utilizando o reagente Viacount e fluxo de contagem de células por citometria de, não houve diferença no número de células vivas observada em não-aderente CXCL12-nula (GFP) ou células expressando quer quando cultivadas em 0% (C), ou 1% de soro (D). A apoptose de células de cultura com poli-HEMA revelou um aumento na em caspase-3 activa /7 restrita a células em cultura em condições isentas de soro única (C) com nenhuma variação observada no soro de 1% (D). Gemcitabina (GEM) foi utilizado como um controlo para a diminuição da contagem de células e aumento da apoptose. (*), (**), E (***) denotam

P

≤0.05,

P

≤0.01, e

P

≤0.001, respectivamente, em comparação com células de controlo (GFP). Os valores são média ± SEM, n = 4-5.

Dada a alteração mínima da anoikis-sensibilidade em células PDAC expressando CXCL12 em condições de soro contendo, nós próxima testado seu potencial de crescimento. Em contraste marcante com os nossos dados no colo ou de mama humanos [24] – [26], [43], o crescimento da população de CXCL12 expressar PDAC diminuiu significativamente em comparação com células deficientes quimiocinas (fig.9). Mais lento o crescimento das células que expressam CXCL12 foi observada em ambas as condições contendo soro e isento de soro (Fig.9A-B).