Abstract

Purpose

O impacto potencial das diferentes SNPs de

VEGF /VEGFR

caminho na evolução clínica de pacientes com CCRm que receberam Bev regimes contendo tem sido investigada em experiências retrospectivos com resultados contrastantes. Nós relatado anteriormente a associação de

VEGFA

rs833061 C /T variantes com PFS em pacientes com câncer colorretal metastático tratados com primeira linha FOLFIRI, além de bevacizumab. O objetivo principal deste trabalho foi validar prospectivamente esta constatação retrospectiva. A análise de confirmação de outros SNPs de

VEGF /VEGFR

pathway genes foi incluído.

O delineamento experimental

Para detectar uma HR para PFS de 1,7 para

VEGFA

rs833061 T /T em comparação com C- variantes em pacientes com câncer colorretal metastático tratados com primeira linha FOLFIRI mais bevacizumab, estabelecendo α frente e verso = 0,05 e β = 0,20, 199 eventos foram necessários.

rs699946 VEGFA

A /G, rs699947 A /C,

rs9582036 VEGFR1

A /C e rs7993418 A /G,

VEGFR2 rs11133360 C /T, rs12505758 C /T

e rs2305948 C /T e

EPAS1

rs4145836 A /G foram também testados. ADN da linha germinal foi extraído a partir de sangue periférico. SNPs foram analisados ​​por PCR e sequenciamento.

Resultados

Quatro-100-24 pts foram incluídos. Na análise univariada, não houve diferenças de acordo com o

VEGFA

rs833061 C /variantes T foram observadas em PFS (p = 0,38) ou OS (p = 0,95). Entre SNPs analisados, apenas

VEGFR2

variantes C- rs12505758, em comparação com T /T, foram associados à PFS mais curtos (HR: 1,36 [1,05-1,75], p = 0,015, modelo genético dominante) e OS, com uma tendência à significância (HR: 1,34 [0,95-1,88], p = 0,088). No modelo multivariado, esta associação apresentou significância (HR: 1.405 [1,082-1,825], p = 0,012) em PFS, que foi perdida através da aplicação de múltiplos correcção de testes (p = 0,14)

Conclusão

.

Esta experiência prospectivo não conseguiu validar o impacto preditivo hipótese de

VEGFA

variantes rs833061. resultados retrospectivos sobre diferentes SNPs candidatos não foram confirmados. Só

VEGFR2

variantes rs12505758, cujo prognóstico e não preditivo impacto foi relatado anteriormente, correlacionada com PFS. Dada a complexidade da angiogênese, que é bastante diferente de que uma única linha germinal SNP pode ser um bom preditor de beneficiar de bevacizumab

Citation:. Loupakis F, Cremolini C, Yang D, Salvatore L, Zhang W, Wakatsuki T, et al. (2013) Validação prospectiva de SNPs candidatos da

VEGF /VEGFR

Caminho no Metastático O câncer colorretal pacientes tratados com Primeiro-Line FOLFIRI, além de bevacizumab. PLoS ONE 8 (7): e66774. doi: 10.1371 /journal.pone.0066774

editor: Xiao-Ping Miao, MOE chave do Laboratório de Ambiente e Saúde, Escola de Saúde Pública, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia, China

Recebido: 30 de março de 2013; Aceito: 10 de maio de 2013; Publicação: 04 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Loupakis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inibição da angiogênese, através do bloqueio do VEGF /VEGFR caminho, é uma estratégia eficaz no tratamento de câncer colorretal metastático (mCRC). Não apenas o anti-VEGFA monoclonal bevacizumab anticorpo (BV) [1], [2] mas também, nas últimas meses, o VEGF e PlGF armadilha aflibercept [3] e o regorafenib inibidor multiquinase [4] demonstraram vantagens significativas em termos de sobrevivência.

por um ponto de vista clínico, o relativamente pequeno benefício absoluta é fornecida por estes novos agentes, bem como a disponibilidade de um número cada vez maior de opções terapêuticas fazer a identificação de biomarcadores preditivos uma necessidade essencial, a fim de optimizar a utilização de agentes anti-angiogénicos. Infelizmente, até hoje, esta necessidade é ainda não resolvido

No que respeita à BV, apesar de várias tentativas que vão desde a farmacodinâmica com a abordagem de imagem [5] -. [6], foram identificadas há biomarcadores de benefício ou resistência tão longe. Olhando para a biologia da angiogênese, aumentando evidências destacar a contribuição de microambiente do tumor para a progressão do câncer. O assim chamado “nicho” [7] – [8], incluindo células endoteliais e mesenquimais, desempenha um papel central no crescimento de novos vasos, que é, por conseguinte, uma grande parte acolher-mediada, além mediada por tumor, fenómeno. Com base nestas considerações, a abordagem farmacogenética, avaliando o impacto da variabilidade da linha germinal sobre a eficácia das drogas, ganhou sucesso como uma ferramenta promissora para revelar potenciais preditores de benefício. No entanto, até hoje, várias experiências retrospectivos têm oferecido inconclusivos e até mesmo resultados contrastantes [9] – [14].

O nosso grupo investigados retrospectivamente a associação de 4

VEGFA

SNPs com parâmetros de sobrevivência em um coorte de 111 pacientes com CCRm tratado com FOLFIRI adiantado acrescido BV e em um histórico, não-randomizado, coorte de 107 pacientes com CCRm tratados com FOLFIRI inicial isolado [10]. A associação significativa da

VEGFA

rs833061 C /variantes alélicas T com PFS e OS foi relatado no BV-grupo, mas não no grupo de controle. Quando tratados com BV, os pacientes tendo

VEGFA

rs833061 genótipo T /T tinham PFS significativamente menor em comparação com aqueles que transportam pelo menos um alelo C-, tanto no uni e no modelo multivariado. Além disso, o significado de um teste de interação exploratória, embora afetado pelo viés de não-randomização, sugeriu que esta associação poderia ser realmente relacionados com o efeito do BV.

Nosso objetivo foi validar prospectivamente a associação deste SNP com o resultado de um ensaio clínico concebido e desenvolvido para confirmar a SNP como um biomarcador preditivo em uma população de mCRC não tratados previamente receber de primeira linha FOLFIRI além BV, assim como a população incluída no coorte retrospectivo.

no Enquanto isso, novos resultados atraentes foram fornecidos pelo maior análise farmacogenética relacionado a BV ea evolução de pacientes com diferentes tumores sólidos, randomizados para receber ou não o medicamento antiangiogênico em ensaios de fase III de primeira linha randomizados [15]. Entre 158 SNPs investigados em genes potencialmente relevantes, Lambrechts et al. identificou alguns SNPs promissores em

VEGFA, VEGFR1 /2

e

EPAS1

. Nós, portanto, incluídos como parâmetros secundários do nosso estudo prospectivo a avaliação de todos os SNPs que mostraram uma possível correlação com o resultado do estudo retrospectivo apresentado por Lambrechts et al.

Aqui nós apresentamos a primeira avaliação prospectiva do candidato SNPs de VEGF /VEGFR via como potenciais preditores de evolução clínica em uma coorte grande e clinicamente homogêneo de pacientes com CCRm tratados com primeira linha FOLFIRI além BV. evidências atualmente disponíveis sobre o potencial preditivo e /ou poder prognóstico de SNPs investigados estão resumidos na Tabela 1.

Pacientes e Métodos

critérios de elegibilidade e procedimentos do estudo

os pacientes com diagnóstico histológico de diagnóstico de adenocarcinoma colorretal metastático foram incluídos no estudo se fossem mais de 18 anos de idade, tinha pelo menos uma lesão mensurável de acordo com RECIST 1.0 e nunca tinham sido tratados para a doença metastática. Anterior oxaliplatina adjuvante foi permitido se mais de 12 meses decorrido entre o final da terapia adjuvante e recaída. medula óssea adequada, função hepática e renal foram necessários. Todos os sujeitos envolvidos assinaram seu consentimento informado por escrito ao tratamento do estudo e procedimentos relacionados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (Comitato Ético Sperimentazione Farmaco – Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana) e investigação clínica foi realizada de acordo com a Declaração de Helsinki

tratamento do estudo consistiu em administrações quinzenais de BV 5 mg /. kg EV no dia 1, seguido de Irinotecano 165 mg /metros quadrados EV, infundiu simultaneamente com G-leucovorina 200 mg /metros quadrados EV, seguido de 5-fluorouracilo 400 mg /EV metros quadrados e 5-fluorouracilo 2400 mg /metros quadrados como uma 48-h o início da perfusão contínua no dia 1. O irinotecano foi administrado durante um máximo de 12 ciclos ou até doença progressiva, toxicidades inaceitáveis ​​ou recusa do paciente. 5-fluorouracil, L-Leucovorin e BV foram continuou até a evidência de doença progressiva, toxicidades inaceitáveis ​​ou a recusa dos pacientes.

A resposta foi avaliada por meio de tomografia computadorizada, que foi repetida a cada 8 semanas. RECIST critérios v1.0 foram aplicadas.

Amostras de sangue

Seis ml foram coletadas em tubos de EDTA e armazenadas a -20 ° C.

delineamento estatístico

Com base em nosso anterior retrospectiva achados, foi elaborado um estudo prospectivo de fase II. De acordo com o projeto Schoenfeld, a fim de detectar um efeito negativo de

rs833061 VEGFA

variante T /T em comparação com C- variantes igual a uma HR para PFS de 1,7, a adoção de dois lados α = 0,05 e β = 0,20 respectivamente, e assumindo uma prevalência da variante T /T de 25%, estimou-se a exigir 199 eventos.

a associação de polimorfismos com PFS e oS foi analisada utilizando curvas de Kaplan-Meier eo teste de log-rank.

PFS foi definido como o tempo desde a primeira administração do tratamento do estudo até que a primeira documentação da progressão da doença objectivo de acordo com RECIST 1.0, ou morte por qualquer causa, o que ocorrer primeiro. Pacientes submetidos à ressecção radical secundária das lesões metastáticas foram censurados no momento da cirurgia.

OS foi definido como o tempo desde a primeira administração do tratamento em estudo até a data de morte por qualquer causa.

as associações entre polimorfismos e RR foram examinadas usando tabelas de contingência eo teste Cochran-Mantel-Haenszel.

Desde 9 SNPs foram testados, o método Benjamini e Hochberg foi usado para controlar a taxa de descoberta de falsas (FDR) de teste de hipóteses múltiplas. Polimorfismos que foram significativamente associados com o desfecho clínico com um valor P FDR-ajustado de 0,15 foram escolhidos para incluir no modelo multivariado

Na análise de regressão multivariada de Cox para PFS e OS, os modelos foram ajustados para mucinoso. histologia, ECOG PS, nível de LDH linha de base, número de sítios metastáticos e local do tumor primário. Utilizou-se o modelo de regressão de Cox por etapas para escolher co-variáveis ​​que foram contabilizadas no modelo multivariado. Co-variáveis ​​que permaneceram significativas a um nível de 0,1 na análise multivariada foram retidos.

Ao aplicar correção de testes múltiplos para o número de SNPs analisados, a associação de

VEGFR2

12.505.758 C /T variantes com clínica resultado não foi significativa (p = 0,14).

Todas as análises foram realizadas com a SAS estatística pacote da versão 9.2.

Este estudo foi concluído e está registrado no ClinicalTrials.gov, com o número NCT01363739. tratamento do estudo não foi emitido para efeitos deste julgamento; pacientes teriam recebido o mesmo regime independentemente da sua inscrição.

A genotipagem

O DNA genômico foi extraído de sangue periférico usando o Kit QIAamp (Qiagen).

VEGFA

rs833061 C /T, rs699946 A /G e rs699947 A /C,

rs9582036 VEGFR1

A /C e rs7993418 A /G,

VEGFR2 rs11133360 C /T

, rs12505758 C /T e rs2305948 C /T e

EPAS1

rs4145836 A /G SNPs foram gentyped por meio de PCR e sequenciamento. Os investigadores que realizam análises genéticas foram cegados a características do paciente e os resultados clínicos.

Resultados

De abril de 2006 a maio de 2011, 424 pacientes com CCRm foram inscritos em 35 Italian Oncology Units. características e correlações com a evolução clínica ‘Principais pacientes estão resumidos na Tabela 2 e 3.

Em um seguimento médio de 24 meses, 292 pacientes foram progrediu e 164 morreram. Na média geral da população PFS e OS foram de 10,5 e 29,9 meses, respectivamente. Two-100-19 (53%) e 25 (6%) dos 417 pacientes avaliados apresentaram parcial ou competir resposta. One-100-31 (31%) pacientes apresentaram estabilização da doença, enquanto 42 (10%) pacientes evoluíram. A taxa de resposta objetiva foi de 59% ea taxa de controlo da doença foi de 90%. Quarenta e seis (11%) pacientes foram submetidos a ressecção R0 secundária das lesões metastáticas.

primária Endpoint

VEGFA

rs833061 C /T SNP foi genotipados com sucesso em 423 casos. Nenhuma associação de

VEGFA

rs833061 C /T variantes com a evolução clínica foi observada (Tabela 4 e 5). Os pacientes homozigotos para T /T (N = 147) mostrou uma PFS mediana de 10,2 meses versus 10,0 meses para os pacientes portadores de pelo menos um alelo C- (N = 276) (HR: [IC 95%: 0,91-1,50] 1,17, p = 0,218) (Figura 1). Também em termos de OS, os pacientes homozigotos para T /T mostrou uma sobrevida média de 32,1 meses versus 29,9 meses para os pacientes tendo pelo menos um alelo C- (HR: [IC 95%: 0,70-1,33] 0,96, p = 0,733) ( Figura 2).

endpoints secundários

Conforme relatado na Tabela 6 e 7, nenhuma associação significativa de

VEGFA

rs699946 A /G e rs699947 A /C,

rs9582036 VEGFR1

A /C e rs7993418 A /G,

VEGFR2

rs11133360 C /T e rs2305948 C /T e

EPAS1

observou rs4145836 a /G variantes alélicas com o resultado clínico.

Uma associação significativa de

VEGFR2

12.505.758 C /T variantes com o resultado clínico foi encontrado em termos de PFS ( p = 0,045), mas não RR (p = 0,50) ou OS (p = 0,12) utilizando um co-dominante modelo genético.

Os pacientes com pelo menos um alelo C- (N = 118) apresentaram um PFS mediana de 9,5 meses em comparação com 10,9 meses de pacientes homozigóticos para T /T (n = 306) (RH: [IC 95%: 1,06-1,75] 1,36, p = 0,015, modelo genético dominante) (Figura 3). Pacientes com pelo menos um alelo C- mostrou uma OS mediana de 23,5 meses em comparação com 32,1 meses de pacientes homozigotos para T /T (N = 306) (HR: 1,34 [IC 95%: 0,95-1,88], p = 0,088) ( A Figura 4). No modelo multivariado, incluindo histologia mucinoso, ECOG PS, os níveis de HDL de linha de base, número de sítios metastáticos, e local do tumor primário como co-variáveis,

VEGFR2

12505758 C- variantes foram ainda associados a PFS mais curtos em comparação com T /T variante (RH: 1,405 [1,082-1,825], p = 0,012). (Tabela S1).

Discussão

Nos últimos anos, a busca de biomarcadores capazes de predizer beneficiar BV tem sido uma das áreas de pesquisa translacional mais competitivos. Apesar de muitos esforços e alguns candidatos promissores, há marcadores têm fornecido resultados confiáveis ​​e reprodutíveis, tornando assim este desafio sem solução extremamente intrigante. A questão permanece Por que tem sido tão difícil de identificar marcadores preditivos relevantes clínicos para BV.

Uma das razões mais fortes é a complexidade biológica da angiogênese tumoral que é reconhecida como uma das marcas de câncer. Nos últimos anos, os dados sugerem o papel de múltiplas vias no crescimento de novos vasos tumorais, conduzindo a investigar a inibição simultânea de múltiplos alvos angiogénicos, como uma estratégia potencialmente eficaz [16]. O papel dos vários tipos de células no desenvolvimento de tais uma intrincada rede de sinais também surgiram e a contribuição de ambas as células estromais e células progenitoras vasculares da medula óssea derivados, recrutado e estimulado por condições de hipóxia, foi evidenciado [17]. A relevância do microambiente do tumor como um ator crucial no crescimento e estabilização de novos vasos e a implicação crítica da matriz extracelular no apoio neoangiog�ese estão agora bem estabelecida, confirmando assim a contribuição de ambos os fatores em host e relacionados ao tumor ao chamado “equilíbrio angiogénico”.

Todos os mecanismos de acção da terapia anti-VEGFA permanecem obscuros já que o bloqueio de VEGFA circulante pode ter impacto não apenas tumores, mas também estroma e a proliferação e a maturação de células endoteliais ‘. Enquanto BV propriedades anti-angiogénicos foram em primeiro lugar atribuída à inibição de células endoteliais ‘proliferação, hoje vários efeitos biológicos diferentes são reconhecidos, tais como a inibição de células progenitoras derivadas de medula óssea, a normalização de navios »estrutura, o vascular” constrição “, e o perturbação do nicho células estaminais cancro », o efeito directo sobre as células tumorais e a interacção com o sistema imune do hospedeiro. Como consequência destes múltiplos mecanismos de ação, a tradução de

in vitro

e

in vivo

descobertas no modelo humano não é imediato e várias dificuldades fazem o desenvolvimento de modelos pré-clínicos eficazes extremamente complicado .

Outro fator complicador na identificação de biomarcadores de BV é que, como um único agente tem efeito antitumoral muito limitada, de modo que o efeito de confusão de quimio-backbone ofusca o efeito BV. Além disso, os pacientes não respondem de acordo com RECIST também conseguir o benefício em termos de tempo prolongado para a progressão do tumor [18].

Apesar desses desafios, alguns candidatos potenciais surgiram a partir de diferentes estudos clínicos retrospectivos. Embora estes marcadores foram muitas vezes considerado digno de uma investigação mais aprofundada, nenhum deles foi validado e entrou prática clínica.

O nosso grupo demonstrou recentemente a associação promissora de

VEGFA

rs833061C /variantes alélicas T com o resultado clínico . No entanto a nossa biomarcador foi identificado retrospectivamente em uma coorte clínica, o que não foi aleatória, e é influenciado pela abordagem de múltiplos testes [10].

Este ensaio clínico representa nossa tentativa de assumir o desafio de validação, afirmou por estatísticos e especialistas em metodologia desde a introdução de medicamentos direcionados para a prática clínica [19]. A necessidade de validar os resultados retrospectivos, através da realização de estudos prospectivos é hoje uma questão de fato. Embora estudos randomizados com um design de interação ou a chamada “estratégia baseado marcador” iria fornecer o mais alto nível de evidência, eles também exigiria um número extremamente grande de eventos [20]. Uma proposta mais pragmática, mas metodologicamente correta é a abordagem “retrospectiva prospectivo”, no qual a hipótese gerado pela experiência retrospectiva é prospectivamente desafiado em uma nova coorte [21]. Até hoje, apesar do elevado número de marcadores potencialmente interessantes emergentes da série retrospectiva, nunca foram conduzidos potenciais ensaios com uma hipótese estatística formal. Para o melhor de nosso conhecimento, nosso trabalho representa a primeira prova de conceito sustentar esta abordagem no campo da oncologia colorectal.

O julgamento, concebido com base em nossos resultados retrospectivos, atesta o fracasso da

VEGFA

rs833061C /T SNP como um preditor potencial de beneficiar de BV e não confirma resultados anteriores sobre outros SNPs candidatos.

No que respeita à

VEGFR2

12.505.758 C /T SNP, cujas prognóstico e não o impacto preditivo foi previamente sugerido [16], devemos reconhecer que a importância da correlação com PFS foi perdido quando aplicar a correcção de testes múltiplos. No entanto, desde VEGFR2 está adquirindo crescente relevância como consequência da afirmação de outros agentes direcionados a interferir com a sua função, como aflibercept e regorafenib, estes resultados podem merecer uma investigação mais aprofundada.

O resultado encorajador relatada em termos de OS ( oS mediana 29,9 meses) provavelmente reflete a acessibilidade destes pacientes, matriculados entre abril de 2006 e maio de 2011, a todos os citotóxicos e agentes direcionados indicados para o tratamento de mCRC, bem como a melhoria das técnicas loco-regionais e da crescente especialização dos cirurgiões comprometidos.

em conclusão, embora reconhecendo a relevância de experiências retrospectivos preliminares como pontos de partida essenciais para gerar novo trabalho-hipóteses, o presente estudo confirma a importância absoluta da validação prospectiva como um passo essencial no caminho ‘biomarcadores para a aplicação clínica .

Além disso, com base na complexidade da biologia angiogénese tumoral e o envolvimento de múltiplos intervenientes nesse processo, parece bastante diferente daquela de um único SNP de linha germinal pode explicar a eficácia da BV por si só. O fracasso da “estratégia de SNP candidato” abre o caminho para novas questões sobre a possibilidade de realmente explorar a abordagem farmacogenética para identificar preditores de beneficiar de BV. Acreditamos que as direções futuras nesse campo de pesquisa deve necessariamente incluir abordagens mais abrangentes, para fornecer uma ampla visão geral de todo o genoma. Um estudo do genoma ampla associação (GWAS) está actualmente em curso, para avaliar a correlação de perfis genéticos com o resultado clínico em uma ampla população de pacientes com CCRm que receberam quimioterapia inicial acrescido BV. Um programa biostatistical ampla também está previsto, a fim de implementar a interpretação dos dados provenientes do elevado número de SNPs investigados nesta análise GWAS exploratória. Em particular, os instrumentos estatísticos adequados, tais como a redução multifactorial dimensionalidade (MDR) e a classificação e regressão árvore (CRT) analisa vai ser aplicada para estimar e identificar interacções gene de gene tal como anteriormente descrito com precisão [22] – [23]. Dois grupos independentes de pacientes randomizados para receber ou não o antiangiogênico servirá de validação define para verificar o impacto preditivo de perfis identificados.

Apesar dos resultados decepcionantes relatados neste campo, o desafio de identificar preditores de beneficiar de drogas antiangiogênicas ainda representa um tema quente, com o aumento consequências na prática clínica. Na verdade, dois ensaios de fase III randomizado, ML18147 [24] e BEBYP [25], demonstraram recentemente a eficácia da repressão BV além progressão da doença em pacientes com CCRm, tornando este campo ainda mais complicada. Essas conquistas abrir o caminho para novas questões sobre o sentido da progressão clínica tradicional e os seus mecanismos biológicos, enquanto sublinhando a necessidade de biomarcadores de resistência adquirida à BV.

Informações de Apoio

Tabela S1. modelos de regressão multivariada

Cox para PFS e OS

doi: 10.1371. /journal.pone.0066774.s001

(DOCX)