Abstract

C-reativa (PCR) é um estabelecida marcador de inflamação com as atividades do receptor-like de reconhecimento de padrões. Apesar da estreita associação entre o nível sérico da PCR com o risco e prognóstico de vários tipos de câncer, ele permanece indefinida se a PCR contribui diretamente para a tumorigênese ou apenas representa um marcador espectador. Recentemente, identificou mutações recorrentes na posição do SNP -286 (rs3091244) no promotor de

gene PCR

em diversos tipos de tumores, sugerindo que, em vez de PCR produzido localmente é um controlador de potencial de tumorigénese. No entanto, desconhece-se se o site -286 é a posição SNP sola do

CRP

gene alvo de mutação e se existe alguma associação entre o

CRP

mutações SNP e outros genes frequentemente mutados em tumores . Aqui, nós examinamos os genótipos de três comum

CRP

SNPs não-codificantes (rs7553007, rs1205, rs3093077) no tumor pares de amostras /normais de 5 tipos de câncer (n = 141). Sem mutações somáticas recorrentes são encontrados nestas posições SNP, o que indica que as mutações SNP -286 são preferencialmente seleccionados durante o desenvolvimento do cancro. Uma análise mais aprofundada revela que os -286 mutações SNP de

CRP

tendem a co-ocorrer com mutado

APC

particularmente no cancro rectal (

p

= 0,04; n = 67) . Por outro lado, mutações do

CRP

e

p53

ou

K-ras

parecem ser independentes. Há resultados assim sublinhar a importância funcional do -286 mutação do

CRP

na tumorigênese e implicam uma interação entre PCR e via de sinalização Wnt

Citation:. Su HX, Zhou HH, Wang MEU, Cheng J, Zhang SC, Hui F, et al. (2014) Mutações do

proteína C-reativa

(

CRP

) -286 SNP,

APC

e

p53

no câncer colorretal: Implicação para um CRP-Wnt Crosstalk. PLoS ONE 9 (7): e102418. doi: 10.1371 /journal.pone.0102418

editor: Qing Song, Morehouse School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de março de 2014; Aceito: 18 de junho de 2014; Publicação: 15 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Ministério da Ciência e Tecnologia da China [número de concessão 2011CB910500]; o National Natural Science Foundation da China [números de subvenção 30930024, 31222015, 31270813, 31170696]; o Ministério da Educação da China [números de subvenção PCSIRT: IRT1137, 121.108]; Província de Gansu [número de concessão: 1011FKCA089]; e da Universidade de Lanzhou [números de subvenção: lzujbky-2013-BT05, lzujbky-2014-86]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inflamação é essencial para o desenvolvimento de cancro [1], [2]. Como um importante reagente de fase aguda humano, proteína C-reactiva (CRP) é amplamente utilizado como um marcador não específica da inflamação [3], [4]. No entanto, o acúmulo de evidências revelou uma estreita associação entre o nível sérico de PCR e o risco e prognóstico de câncer [5]. Dadas as funções presumidos de CRP na defesa do hospedeiro e imunidade inata [6], [7], é plausível que a PCR pode desempenhar um papel direto na tumorigênese. Com efeito, a PCR foi reportado para impedir a apoptose das células do mieloma [8] e para facilitar a capacidade de invasão de células de cancro da mama [9]. Além disso, a PCR pode contribuir para o estabelecimento de um microambiente tumoral favorável através da promoção da angiogénese [10], através da inibição da activação destrutiva do complemento [11], [12], e pela indução de citocinas pró-inflamatórias a partir de células imunitárias e endoteliais [3], [ ,,,0],13], [14].

por outro lado, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que se associam com concentrações geneticamente elevados de CRP não conferem um risco aumentado de câncer para a população em geral [15]. Isto sugere que a PCR em circulação não é causalmente envolvidos na tumorigênese. Curiosamente, em contraste com as actividades pró-cancerosas acima mencionados, os primeiros estudos foram também documentados acções anti-cancro de PCR através da activação de macrófagos /monócitos [16] – [18]. Consequentemente, tem sido difícil definir se a PCR é apenas um marcador passivo ou um jogador ativo no câncer, ou para dissecar a contribuição exata de CRP na tumorigênese

CRP soro é produzido por hepatócitos do fígado.; no entanto, evidências acumuladas também revela uma produção local de PCR por células extra-hepática [3], [19]. Curiosamente, verificou-se recentemente que o promotor de

PCR é especificamente mutada na posição do SNP (rs3091244) 286 pb a montante do local de início da transcrição em 109 de 453 amostras de tumor, mas não nos controlos normais correspondentes [19 ]. Estas mutações estão associadas com Enhanced local,

CRP

indução em tumores prováveis ​​através de ruptura do motivo conservado metilação CpG. Além disso, a maioria dos tipos de cancro examinados abrigar a mutação -286 e a fracção do alelo mutado é alta (0,487, IC de 95%: 0,477-0,517). Estes achados, assim, apoiar o papel do CRP produzida

in situ

como motorista de câncer potencial que provavelmente está envolvido em mecanismos gerais favorecendo tumorigênese [19].

Além do -286 SNP, existem vários SNPs não-codificantes adicionais comuns que afetam significativamente os níveis basais de PCR sérica. Os representantes incluem rs7553007, rs1205 e rs3093077 [15], [20], [21]. É, portanto, de interesse se esses locais SNP também são alvo de mutação em tumores. Mostramos aqui por genotipagem de 141 pares de amostras tumorais /normais que há mutações recorrentes ocorrem no 3

CRP

locais SNP, destacando que os -286 mutações são altamente específicos para tumorigênese. Nós ainda determinar se existe alguma correlação entre os -286 mutações do

CRP

e outros genes frequentemente mutados em tumores. A associação observada entre o -286 e

APC

mutações implica uma interação de CRP com a sinalização Wnt.

Materiais e Métodos

tumor congelado /pares de amostras de tecidos normais foram obtidos a partir de o banco de tecidos do Hospital Gansu Provincial do tumor. O ADN genómico foi isolado a partir de tecidos ou amostras de sangue usando DNAiso reagente ou sangue genoma de DNA Extraction Kit (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Para a identificação de mutações genéticas, o DNA genômico foi amplificado com primers específicos (humanos

CRP

: frente: 5′-AGGGGGGAGGGATAGCATTAGAA-3 ‘; reversa: 5′-CGTCCTGCTGCCAGTGATACAAG-3’; humana

p53

: para a frente: 5′-CTGTCCCTTCCCAGAAAACCT-3 ‘; reversa: 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTC-3’; humana

APC

: frente: 5′-TAATACCCTGCAAATAGCAGAAATA-3 ‘; reversa: 5’-GTGGCAAAATGTAATAAAGTATCAG-3 ‘; humanos

K-ras

: frente: 5′-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA-3′; reversa: 5′-CAACACCCTGTCTTGTCTT-3 ‘) seguida de sequenciação. Genotipagem de 24 SNPs (rs7553007, rs1205, rs3093077, rs4073, rs1143627, rs720816, rs723504, rs1876054, rs746961, rs2371923, rs487616, rs953183, rs400328, rs950487, rs759394, rs726402, rs1568645, rs929689, rs2254896, rs1951096, rs1843026, rs1543193, rs718015 , rs16091) foi realizada pelo serviço Sequenom à base de espectrometria de massa (Genergy Biotecnologia, Xangai, China). consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes. Todos os pacientes são chineses. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Gansu Provincial do tumor.

Resultados

Não há mutações somáticas recorrentes ocorrer em 3 comum

CRP

locais SNP em tumores

Para ver se outros não-codificante locais SNP de

CRP Quais são mutado em tumores, determinou-se os genótipos de 3

CRP

SNPs comuns (rs7553007, rs1205 e rs3093077), juntamente com 21 SNPs adicionais em 141 tumor pares de amostras /normais de 5 tipos de câncer,

ou seja

gástrico, pulmão, esôfago, cólon e reto. As frequências de alelos associados com níveis de CRP inferiores são de 48,9% para um alelo de rs7553007, 47,9% para o t alelo de rs1205, e 79,1% para o t alelo de rs3093077 em amostras normais (Tabela 1), proporcionando, assim, tamanhos de amostra suficiente para a detecção de mutações recorrentes. Portanto, foram identificados apenas 1 caso de G A mutação rs7553007, 0 caso de mutação no rs1205, e 2 casos de G mutações T em rs3093077 nas amostras tumorais correspondentes. Essa baixa incidência de mutação somática foi também encontrado por 21 outros sites SNP não-codificantes examinados distribuídos por 9 cromossomos diferentes (Figura 1). Estes indicam que, em contraste com os

CRP

SNP mutações (rs3091244) altamente recorrentes -286 [19], a 3

CRP

locais SNP aqui ensaiadas são mutantes única aleatoriamente em tumores no fundo frequência de mutação.

3

CRP

SNPs (rs7553007, rs1205 e rs3093077) e 21 SNPs adicionais de 141 pares de amostras tumorais /normal foram genotipados por Sequenom. Estas amostras foram coletadas de 37 gástrico, 12 de pulmão, 27 de esôfago, 24 pontos e 41 pacientes com câncer retal. (A) As frequências de mutação em cada sites SNP. Nenhum desses sites é recorrentemente mutado em tumores. A frequência do

CRP

-286 SNP (rs3091244) mutação nestas amostras é mostrada para comparação. (B) As frequências de mutação reunidos de SNPs com ou sem genes associados. locais SNP associado ao gene tendem a apresentar menores frequências de mutação embora sem alcançar significância estatística (duas amostras

t

teste, bicaudal,

p

= 0,47).

de acordo com os resultados de genotipagem, as frequências de mutação de sites SNP com e sem genes associados são de 0,97% (95% CI: 0,35-1,59%) (95% CI: 0,78-1,82%) e 1,30%, respectivamente . Embora não seja estatisticamente significativo, isto sugere que os locais de SNP do gene associado tendem a ser menos propensa a mutação aleatória do que aqueles com associação desconhecido, possivelmente devido a restrições que limitam os danos para os loci genómico com importância funcional. Do SNPs associado ao gene, rs1143627 e rs4073 são dois SNPs promotor que localizam a 31 e 199 pb a montante dos locais de início da transcrição de

IL-1β

e

IL-8

, respectivamente. Suas frequências de mutação baixas (0,7-1,4%) argumentam que a localização do promotor

per se

não é provável que a causa da mutação somática no

CRP

-286 SNP -site em tumores; Em vez disso, a incidência elevada de mutação -286 seria o resultado de consequências funcionais relacionados com a indução aumentada de

PCR, que pode conferir clones de células hospedeiras vantagem suficiente para sobreviver e expandir-se no desenvolvimento de cancro.

CRP

-286 SNP mutação está associada à mutação

APC

no cancro rectal

O

CRP

-286 SNP mutação é mais prevalente em cancros do cólon [19], em que

p53

,

K-ras

e

APC

estão entre os genes mais frequentemente mutado que promovem tumorigênese via mecanismos distintos [22 ] – [24]. Nós, portanto, procurou examinar se existe alguma relação entre estes acontecimentos de mutação. Mutado

p53

,

K-ras

e

APC

foram identificados por sequenciação de suas respectivas regiões de mutação hotspot,

ou seja

301-1044 de

p53

, 24-442 de

K-ras

e 3922-4453 da

APC

em cDNA sequência varia, de acordo com as estatísticas do banco de dados cósmica. Apesar de suas altas incidências (cerca de 50%), o

CRP-

286 SNP mutação não mostra nenhuma relação aparente com mutado

p53

(n = 35; Tabela 2 e Figura 2A.) Ou

K-ras

(n = 35; Tabela 3 e Fig. 2B). A falta de associação entre a

p53

e

CRP

-286 mutações SNP foi também confirmado em câncer de esôfago (n = 36;. Tabela 4 e Fig 2C), em que

p53

representa o gene mais frequentemente mutado.

o

CRP

-286 mutações SNP não mostram nenhuma associação com mutado

p53

ou

K-ras

em cólon (AB) ou cânceres de esôfago (c) (teste exato de Fisher, bicaudal). Cada retângulo representa uma amostra de tumor com a cor cinza indica o estado de tipo selvagem. Os gráficos de barras à direita mostram as percentagens de pacientes portadores de mutações indicadas em dois grupos de pacientes com ou sem mutações CRP-286.

Por outro lado, a dois enriquecimento fold de mutante

APC

foram observados em tumores de cólon com o concorrente

CRP

-286 mutações SNP (n = 38; Tabela 5 e Figura 3A). No entanto, essa correlação não atingiu a significância estatística, provavelmente, devido à dimensão limitada da amostra que poderíamos obter. Nós, portanto, examinado mais 67 tumor /pares de amostras normais de câncer retal (Tabela 6 e Figura 3B), que é muito semelhante ao cancro do cólon em ambos os origem tipo de célula e alterações genômicas [25] mostrando alta incidência de ambos

APC

[25] e

CRP

-286 mutações SNP [19]. Na verdade, a co-ocorrência destas duas mutações nesse conjunto de amostras se tornaram mais evidentes (odds ratio: CI 5,56, 95%: 1,17-26,36) e significativa (

p

= 0,04). Estes resultados sugerem, portanto, que a PCR e APC podem cooperar na sobreposição de percursos durante o desenvolvimento do cancro colo-rectal.

O

CRP

-286 mutações SNP tendem a co-ocorrer com

APC

mutações em dois pontos (A) (teste exato de Fisher, bicaudal,

p

= 0,47) e retal (B) (teste exato de Fisher, bicaudal,

p = 0,04

). Cada retângulo representa uma amostra de tumor com a cor cinza indica o estado de tipo selvagem. Os gráficos de barras no lado direito indicam as percentagens de pacientes portadores de mutações do gene APC em dois grupos de pacientes com ou sem mutações CRP-286.

Discussão

O

in vitro

actividades de PCR [3], [4], [6], [11], [13], [14], incluindo o reconhecimento de sinais de perigo endógeno ou exógeno, a regulação da activação do complemento, indução de respostas de células pró-inflamatórias, levam à ideia que a PCR pode funcionar como um receptor de reconhecimento de padrões solúvel na imunidade inata e defesa do hospedeiro [6], [7]. No entanto, a falta de apoio consistente pela pesquisa em modelos animais [26] – [34], seres humanos [35], [36] e epidemiologia genética [15], [20], [21], [37] torna incerta se a PCR desempenha um papel significativo na inflamação crónica

in vivo

ou simplesmente representa um marcador inespecífico como sugerido pelo seu padrão de expressão fase aguda. A este respeito, a identificação do altamente recorrente

CRP

-286 mutações SNP em vários tipos de câncer humano [19] fornece uma evidência convincente de que esta proteína é um driver potencial de desenvolvimento de neoplasias e uma componente central do regulador rede de inflamação.

mutações promotor na

TERT

[38], [39] e

CRP

[19] constituem os primeiros exemplos que não codificantes regiões reguladoras podem também ser alvo para promover a tumorigénese através da modulação da expressão em vez de as actividades de genes-chave. No entanto, é pouco única no caso de

PCR

que a mutação ocorre num local SNP comum. Isto levanta a preocupação se os locais de SNP são geralmente mais vulnerável a alterações genéticas, que conduz à elevada incidência de mutações de passageiros. Para resolver este problema, nós genotipados 24 SNPs de 141 pares de amostras tumorais /normal. Estes SNPs estão localizados em cromossomas 9 distintas, e consistem em 3 de SNPs

PCR, dois SNPs promotor de citocinas inflamatórias, um SNP de um gene não-codificante, com 18 SNPs associação desconhecido. Apesar disso, todos os locais de SNP foram encontrados para ser mutado em tumores com apenas baixa frequência fundo. Portanto, a mutação altamente recorrente no

CRP

local -286 SNP é mais provável o resultado da seleção pelo desenvolvimento do câncer, mas não simplesmente devido a propriedades gerais associadas com o local SNP ou localização genômica. É, no entanto, ainda é possível que a mutação -286 é apenas uma consequência de desenvolvimento de neoplasias e ensaios funcionais adicionais são necessários para esclarecer este ponto.

No entanto, é intrigante que, embora o 4 examinada

CRP

SNPs afetam a todos os níveis séricos de CRP, apenas o -286 SNP é alvo de tumorigênese. Isto sugere que os efeitos dos outros 3 SNPs são secundárias à SNP -286, que pode em parte ser explicada pela dependência de

PCR

expressão do promotor metilação CpG, um mecanismo epigenético essencial no silenciamento de genes [ ,,,0],40]. De facto, demonstramos recentemente que a expressão elevada PCR está correlacionada com baixa metilação do promotor, e vice-versa [19]. Dos 5 motivos CpG em

PCR

promotor, o evolutivamente conservadas -286 CpG parece ser a chave, em especial para tipos de células extra-hepáticas, para determinar o nível basal de

PCR

expressão [19] . Como a maioria das mutações são -286 C transições de A /T que perturbam o motivo metilação, é concebível que tais alterações genéticas, por sua vez contribuem para ligar a actividade de promotor de

PCR

provavelmente através da redução metilação sinal inibitório e facilitar a ligação de factores de transcrição para a sequência de e-box subjacente [41]. Estes podem, eventualmente, permitir a posterior participação de elementos reguladores distais contendo o outro

CRP

SNPs.

A alta recorrência e difusão do

CRP

-286 mutações SNP em tumores sugerem que localmente produzidos CRP, em vez de CRP em circulação, impulsiona o desenvolvimento de câncer. Este paradoxo pode ser explicado pela dependência apertado das acções de CRP no microambiente inflamatório [3], [13], [14], [36]. PCR circulante é produzida pelo fígado como um pentâmero mostrando principalmente actividades anti-inflamatórias [7], [42], [43]. Além hepatócitos, células extra-hepáticos também são capazes de secretar a PCR localmente em resposta a estímulos inflamatórios. Além disso, desencadeia enriquecido em loci inflamatória irá induzir mudanças de conformação rápidas no CRP pentam�ica postar sua

produção in situ

[44] – [49], para liberar todo o potencial no ligando de ligação [47], [48] , [50], complementar a regulamentação [46], [48], [51] – [54] e estimulação do pró-inflamatória e respostas de células angiogénicos [48], [49], [55] – [61]. Como tal, a abundância local de PCR e as suas interacções com o microambiente estressante deve ser mais relevantes para a progressão da doença; enquanto que os níveis circulantes de PCR principalmente espelhar o estado inflamatório subjacente.

A desregulação da via de sinalização Wnt é o evento mais frequente observado em câncer colorretal, que geralmente se manifesta por inactivar mutações do

APC

ou ativar mutações do

β-catenina

[25]. Uma consequência directa da

APC

inativação é a estabilização da

β-catenina

ea activação aberrante de genes alvo a jusante [62]. Por conseguinte, é de interesse que

PCR demonstrou ser um alvo de

β-catenina

[63]. Além disso, nossos resultados revelam que o

CRP

-286 mutações SNP tendem a co-ocorrem com o mutante

APC

no cólon e tumores do reto. Estes implicaria que as duas moléculas secretoras,

i.

CRP e Wnt, pode agir de feed-back e maneiras de cooperação para promover a tumorigênese, que merece mais investigações. Dada a sinalização Wnt anormalmente ativados e altamente induzida

expressão CRP

em tumores, tópica visando ambas as moléculas podem ser uma opção potencial para a terapia do cancro colorectal.

Reconhecimentos

Agradecemos Sr. . Jing Zhao pelo seu excelente assistência técnica.