Abstract

MicroRNA-214 (miR-214) tem sido relatada a ser desregulada em tecidos de câncer de bexiga humanos. Nós teve como objetivo investigar a correlação clínica, significado biológico e da rede molecular de miR-214 no cancro da bexiga. Nossos resultados mostraram miR-214 foi regulada para baixo em tecidos de câncer de bexiga e significativamente associada com o estágio do tumor, estado linfonodal, grau, multifocalidade, história de não-músculo-invasivo cancro da bexiga (NMIBC). Além disso, o miR-214 pode servir como um fator independente de sobrevida livre de recidiva (RFS) e sobrevida global (OS) para pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo (CINM). Restauração de expressão de miR-214 em linhas celulares de cancro da bexiga inibiu a proliferação celular, migração, invasão e apoptose marcadamente promovido. ensaio de repórter de luciferase dupla PDRG1 reconhecido como gene alvo a jusante directa de miR-214. PDRG1 foi significativamente aumentada em tumores de baixo de miR-214 e knockdown de PDRG1 imitavam os efeitos de miR-214 superexpressão. Nossas descobertas manifesto que o miR-214 poderia exercer efeitos tumor-supressora em câncer de bexiga por diretamente down-regulação PDRG1 oncogene e sugerir um indicador romance atraente para a intervenção prognóstico e terapêutica do cancro da bexiga

Citation:. Wang J, Zhang X, Wang L, Yang Y, Z Dong, Wang H, et al. (2015) MicroRNA-214 Suprime Oncogenesis e exerce impacto no prognóstico de Segmentação PDRG1 no cancro de bexiga. PLoS ONE 10 (2): e0118086. doi: 10.1371 /journal.pone.0118086

Editor do Academic: Chengfeng Yang, Michigan State University, Estados Unidos

Recebido: 23 de agosto de 2014; Aceito: 04 de janeiro de 2015; Publicação: 23 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e sua resposta aos revisores arquivos de suporte de informação. No entanto, por razões éticas, não podemos fornecer esses dados em nível de participante de um arquivo de informações de apoio ou repositório público. No entanto, outros investigadores poderão aceder a esse membro do Comité de Qilu Hospital da Universidade de Shandong e Hospital da Linyi Pessoas Ética Médica, contactando 1. Comitê de Ética Médica do Departamento de Pesquisa Científica, Hospital Qilu, Universidade de Shandong, 107 Wenhua West Road, Jinan 250012, província de Shandong, China. Tel: + 86-531-82169035; Email: [email protected]; Comissão 2. Ética Médica do Departamento Médico, Hospital Linyi Pessoas, 27 Jiefang Road, Linyi 276003, província de Shandong, na China. Tel: + 86-539-8216157; E-mail:. [email protected]

Financiamento: Este estudo recebeu apoio financeiro da National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov.cn/) para CW (No. 81.271.916) e da Fundação de Ciência Natural da província de Shandong (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) para XZ (ZR2013HQ063). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum diagnosticada em países desenvolvidos e representa a segunda maior causa de morte entre os pacientes com neoplasias do trato geniturinário em todo o mundo [1, 2]. Apesar de aproximadamente 75% dos casos estão agrupados como NMIBC com uma taxa relativamente elevada de 5 anos de sobrevivência [3, 4], outros 25% dos pacientes com MIBC são submetidos a doença metastática subsequente após o primeiro tratamento agressivo [5]. Investigando novas modalidades terapêuticas e identificar biomarcadores de prognóstico para o câncer de bexiga com base em novas redes moleculares tornaram-se hotspots pesquisa recentemente.

microRNAs (miRNAs) representam uma classe de pequenos, endógena, não-codificação, moléculas de RNA de 22 nucleotídeos que função como regulador do pós-transcricional, emparelhando parcialmente com as regiões 3 ‘não traduzida (UTR) de mRNAs alvo, levando a degradação do mRNA ou a repressão de translação [6, 7]. foi firmemente estabelecido que miARN pode regular a 60% de genes codificadores de proteínas humanas [8] e desempenham um papel crucial em vários processos fisiopatológicos [9, 10]. miARNs foram identificadas quer como supressores de tumores ou oncogenes [11]. Tendo em vista seus perfis de expressão doença- e de tecidos específicos e incrível potencial regulatório, miRNAs estão sendo avaliados como biomarcadores fascinantes para diagnóstico e prognóstico [12] câncer. Relatórios anteriores demonstraram regulação aberrante de miRNAs em câncer de bexiga e de vários miRNAs (

e

.

g

., miR-9, miR-182, miR-200b, miR-145 e miR- 129) apresentam valor prognóstico [13-17]. Mais estudos são exigidos para decodificar as vias reguladoras subjacentes pelos quais miRNAs participam na carcinogênese do câncer de bexiga e identificar miRNAs funcionando como novos alvos terapêuticos ou como biomarcadores de prognóstico para o câncer de bexiga.

Alguns estudos têm relatado que miR- 214 foi regulado para cima e contribuiu para a progressão da doença e metástases à distância no melanoma maligno [18, 19], enquanto outros indicaram que miR-214 foi regulada para baixo e teve um efeito tumor-supressor no cancro do colo do útero [20], o cancro da mama [21] e de carcinoma hepatocelular humano [22]. A evidência acima aponta que miR-214 pode desempenhar um papel central e diversas na oncogênese de vários tipos de tumores, ainda potenciais mecanismos de miR-214 ainda não estão completamente desvendados. Até agora, tem havido papéis pouco publicados envolvendo a análise funcional e de rede molecular de miR-214 no cancro da bexiga, embora alguns miRNA profiling estudos mostraram que miR-214 foi desregulado no cancro da bexiga [23, 24].

neste estudo, avaliou-se o nível de expressão de miR-214 em tecidos de câncer de bexiga humana, analisou sua importância prognóstica viável e realizou experimentos funcionais relevantes. Descobrimos que miR-214 pode inibir a proliferação de células de câncer de bexiga, migração, invasão e exercer a função pró-apoptótica essencial. Além disso, o oncogene PDRG1 foi verificado, pela primeira vez, como um alvo a jusante directa de miR-214 no cancro da bexiga. Este relatório implicado um papel supressor de tumor e mecanismos de regulação para miR-214 no cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

cultura celular

O nonmalignant SV-40 imortalizadas de células epiteliais da bexiga (SV-HUC-1) duas linhas de células de câncer de bexiga e (T24 e 5637) foram adquiridos a partir do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), em 22 de maio de 2014 que tenham passado pelo teste do perfil de ADN (curta repetições em série, STR). As células SV-Huc-1 foram cultivadas em meio F12K (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; TBD, Tianjin, China) e as duas linhas celulares de cancro da bexiga foram cultivadas em modificado RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT) suplementado com FBS a 10% (TBD, Tianjin, China), a 37 ° C numa incubadora humidificada (5% CO2).

pacientes e amostras de tecido

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética médica da Qilu Hospital da Universidade de Shandong e Hospital da Linyi Pessoas. Todos os pacientes assinaram consentimento informado por escrito antes de sua inscrição. Um total de 106 pacientes operação com carcinoma de células transicionais da bexiga primária confirmado patologicamente foram recrutados entre janeiro de 2004 e agosto de 2009 a partir Qilu Hospital da Universidade de Shandong (n = 45) e Hospital da Linyi Pessoas (n = 61). Entre esses pacientes, 31 pacientes foram submetidos a ressecção transuretral de tumor da bexiga e 75 pacientes foram submetidos a cistectomia radical. Nenhum dos pacientes tinham recebido tratamento pré-operatório. tecidos de bexiga normal adjacente foram obtidos a partir de regiões fora da margem do tumor ( 5 centímetros) em pacientes. Todos os tecidos foram dissecados macro-no prazo de 15 minutos após a ressecção cirúrgica, confirmada por análise patológica de secções congeladas sequenciais, e, em seguida, armazenada a -80 ° C até à sua utilização. O estágio e grau dos tumores foram avaliados de acordo com a União de Controle do Câncer 2009 internacional do sistema TNM [25] e 2004 sistema de classificação da OMS [26], respectivamente. Todos os pacientes foram acompanhados por consultas médicas a cada 3 meses durante os primeiros 2 anos, a cada 6 meses para 2 anos e todos os anos seguintes. RFS e OS foram definidas como o intervalo de tempo entre a ressecção cirúrgica inicial e data de evento ou último acompanhamento.

isolamento do RNA, síntese de cDNA e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

o ARN total foi extraído a partir de tecidos ou células, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A quantidade e qualidade de RNA foram verificados com BioPhotometer mais (Eppendorf AG, Hamburger, Alemanha). Para a detecção de PDRG1, o ADNc foi sintetizado utilizando um kit de RT ReverTra Ás qPCR (TOYOBO, Osaka, Japão). Para o miR-214, o ARN foi transcrito de forma reversa utilizando M-MLV de transcriptase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) e iniciadores de transcrição inversa específicos (RiboBio, Cantão, China). Os níveis de miR-214 e PDRG1 expressão foram quantificados por meio de qRT-PCR utilizando em tempo real de PCR kit de Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japão) e ABI 7500 em tempo real do sistema de PCR (da cidade Applied Biosystems, Foster, EUA) com o ARNnp de U6 como o seu gene de referência endógena. A reacção de PCR consistiu de um passo inicial de desnaturação (95 ° C durante 60 s), 48 ciclos (95 ° C durante 15s, 60 ° C durante 30s, 72 ° C durante 45s) e análise de curva de fusão. O 2 método

-ΔΔCT foi realizada para calcular a expressão e expressão níveis relativos de controles negativos foram usados ​​como calibrador.

miRNA maduro ou siRNA transfecção

células cancerosas da bexiga foram cultivadas a 3 × 10

4 células /poço em placas de 96 poços ou de 1 × 10

5 células /poço em placas de 24 cavidades ou 5 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços em meio de crescimento sem antibióticos durante cerca de 24 horas até atingir 80% de confluência e transf ectadas transitoriamente com imita miARN (Ribobio, Cantão, China) ou siARN (Ribobio, Cantão, China) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. miR-214 controlo mímico e miR-negativa (miR-NC) mímico foram usadas nas experiências de ganho-de-função, ao passo SI-PDRG1 e Si-negativo de controlo (SI-NC) foram utilizados nas experiências de perda de função . Para assegurar a transfecção real, qRT-PCR foi realizada para detectar a eficiência de transfecção em cada experiência 24 horas mais tarde. Para proliferação, cicatrização de feridas, a migração, invasão e ensaios de apoptose, as células foram colhidas 24 horas após a transfecção. Para o ensaio de Western Blot, as células foram recolhidas 48 horas após transfecção.

ensaio de proliferação celular

De acordo com o protocolo do fabricante, a proliferação celular foi detectada em 24, 48, 72 e 96 horas após a transfecção por uso de WST-8 coloração com celular Counting Kit-8 (Byotime, Haimen, China).

a apoptose ensaio

células cancerosas da bexiga foram colhidas, lavadas em PBS frio, novamente suspensas, duplamente coradas com FITC-anexina V /iodeto de propídio Apoptosis Detection Kit (BestBio, Xangai, China) de acordo com as recomendações do fabricante e imediatamente analisado por um citometria de fluxo (BD FACSCanto II, BD Biosciences, San Jose, EUA).

Wound -healing ensaio

as células foram plaqueadas em placas de 6 poços com meio contendo soro até subconfluência durante 24 horas e privadas de soro, em seguida, a monocamada de células foi riscado sobre o centro das placas depois de as células terem atingido confluência utilizando uma dica P-20 micropipeta [27]. O comprimento inicial lacuna (0 hora) e o comprimento residual lacuna em diferentes pontos temporais (6, 12 e 24 horas) após a lesão, foram fotografadas (200 ×) e calculada de acordo com IX71 microscópio invertido (Olympus, Tóquio, Japão).

In Vitro

ensaios de migração e invasão

as células de câncer de bexiga em meio isento de soro foram colocados na câmara superior do inserto com poros de 8 mm em placas de cultura de tecidos de 24 poços (costar Corning, Nova Iorque, EUA), com ou sem matrigel (BD Bioscience, Bedfold, MA, EUA). Modificação meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% na câmara inferior serviu como o quimioatractor. Após 24 horas de incubação, as células que aderiram ao membrana inferior foram lavadas, fixadas e coradas com 0,1% de violeta de cristal e 20% de metanol, trabalhada (400 ×), e contou-se utilizando IX71 microscópio invertido (Olympus, Tóquio, Japão).

dual-luciferase ensaio de repórter

os vetores PMIR-Report (RiboBio, Guangzhou, China) foram construídas com tipo selvagem (WT) -PDRG1 sequências ou mutante (MUT) -PDRG1 sequências inserido entre o hRluc e o gene hLuc. células de cancro da bexiga em placas de 96 poços foram co-transfectadas com o miR-NC /miR-214 e WT imita PDRG1 3′-UTR vector /vector MUT- PDRG1 3′-UTR utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As actividades de Renilla e luciferases firefly em lisados ​​de células foram medidos utilizando o kit de ensaio de luciferase dupla (Promega, Madison, WI) e o quociente de Renilla luciferase /actividade firefly (Rluc /Luc) foram considerados como dados normalizados.

Western blot

lise tampão (Beyotime, Haimen, China) foi usado para extrair proteína total a partir de células de câncer de bexiga e concentração de proteína foi determinada com BCA avançado Kit de ensaio de proteína (Byotime, Haimen, China). lisado de proteína foi separada por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF. Depois de ser bloqueada, as membranas foram incubadas com o mAb de coelho anti-PDRG1 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA, EUA) ou mAb de ratinho anti-β-actina (1: 500; SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4 ° C, em seguida, marcada com peroxidase de cavalo avermelhado (HRP) -conjugated anticorpos secundários (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology). complexos específicos foram visualizados com substrato quimiluminescência HRP (Millipore, Little Chalfont, UK).

Alvo de pesquisa genética para miR-214

Para identificar genes alvos potenciais de miR-214, aproveitamos uma análise bioinformática integrado, Base Estelar v 2.0 (https://starbase.sysu.edu.cn/targetSite.php), que pode usar em conjunto cinco algoritmos disponíveis públicas (incluindo TargetScan, PicTar, PITA, RNA22 e miranda).

A análise estatística

Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizadas usando SPSS versão 17.0, software GraphPad Prism e Microsoft Excel. As diferenças significativas entre grupos independentes foram calculados pelo teste de Mann-Whitney, o teste de Kruskal-Wallis ou t-teste de Student. O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar a expressão de miR-214 em tecidos de cancro da bexiga emparelhados e tecidos normais adjacentes. curvas RFS e OS foram determinados pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças de sobrevivência de pacientes em sub-grupos foram avaliados pelo teste de log-rank. fatores prognósticos independentes para predição de sobrevivência foram estimadas por análise multivariada de regressão de Cox. A análise de correlação de Spearman foi aplicada para calcular a relação entre o miR-214 e PDRG1.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

miR-214 é frequentemente atenuadas no cancro da bexiga, que está envolvido na progressão do cancro

Detectamos o nível de miR-214 expressão em 106 pares de câncer congelado tecidos da bexiga humana e combinados espécimes normais adjacentes por qRT-PCR e descobriu que miR-214 foi significativamente underexpressed em tecidos de cancro da bexiga (

P Art 0,001), com o nível de expressão média dez vezes menor do que a das amostras não cancerosos (expressão mediana = 0,084 e 0,864, respectivamente) (Fig. 1A). Além disso, 74% das amostras de tecido de cancro da bexiga mostrou que mais de duas vezes menor nível de miR-214 em comparação com os tecidos normais correspondentes (Fig. 1B e 1C). Foram avaliados ainda mais a correlação entre miR-214 expressão em tecidos de câncer de bexiga e características clínico-patológicas (Tabela 1) e observaram que a expressão atenuada miR-214 foi significativamente associada com maior estágio do tumor (

P Art 0,001), maior estado dos linfonodos (

P Art 0,001), maior grau (

P Art 0,001), multifocalidade (

P

= 0,003) e história de NMIBC (

P

= 0,033). No entanto, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão de miR-214 e outras características clínico-patológicas. Estes resultados manifestam que o miR-214 pode desempenhar um papel supressor de tumor no cancro da bexiga e a sua infra-regulação ser envolvida na progressão do cancro.

(A) Nível de expressão do miR-214 foi determinada por meio de qRT-PCR e normalizado contra U6 RNA, um controle endógeno, em 106 pares de tecidos humanos de cancro da bexiga (BC) e combinou tecidos normais adjacentes (NT). ***

P Art 0,001, teste de Wilcoxon, n = 106. (B) A expressão atenuada de miR-214 foi encontrado em 74% (78 de 106) de tecidos de cancro da bexiga em comparação com as amostras normais adjacentes. (C) A expressão relativa de miR-214 foi apresentado como log

2 mudança vezes (BC /NT) eo log

2 mudança dobra foi definida da seguinte forma: 1, subexpressão; 1, a sobre-expressão; o restante foi definida como inalterada. (D) de Kaplan-Meier RFS e curvas OS com base nos níveis de expressão de miR-214 de pacientes com câncer de bexiga. O ponto de corte foi o nível de expressão de miR-214 mediano nas amostras de tecido de cancro da bexiga. (E) de Kaplan-Meier RFS e curvas OS com base nos níveis de expressão de miR-214 de pacientes com CINM. O ponto de corte foi a mediana miR-214 nível de expressão nas amostras de tecido CINM.

miR-214 serve como um predicador prognóstico independente para pacientes com MIBC

durante o seguimento, 54,7% (58 de 106) dos pacientes com câncer de bexiga apresentou recorrência ea taxa de sobrevida global em 5 anos foi de 61,3% (65 de 106). O acompanhamento médio de RFS e OS foram 57,5 ​​meses (variação, 0.5-79 meses) e 62 meses (variação, 1-79 meses), respectivamente. Kaplan-Meier curva de sobrevida revelou que pacientes com câncer de bexiga com baixa expressão de miR-214 foram submetidos a RFS significativamente mais curtos (-log rank test = 26,207;

P Art 0,0001) e OS (-log rank test = 45,174;

P

. 0,0001) do que aqueles com alta expressão (Fig 1D), enquanto a análise de regressão de Cox multivariada mostrou que miR-214 era nem variável prognóstica independente da RFS (

P

= 0,269), nem oS (

P

= 0,397) para pacientes com câncer de bexiga.

em seguida, foi realizada a análise separada para os tumores NMIBC e CINM. No grupo NMIBC, depois de um período de acompanhamento médio de 59 meses (variação, 42-79months), 54,8% dos pacientes NMIBC (17/31) apresentaram recidiva, mas miR-214 não previu RFS nem OS quando desregulado por Kaplan-Meier análise. No grupo CINM, depois de um período de acompanhamento médio de 32 meses (variação, 0.5-76 meses), foi observada recidiva local ou metastático, para 54,7% dos 75 pacientes CINM (41/75), que morreram todos. A taxa de sobrevida global em 5 anos foi de 45,3% (34 de 75) e a mediana de seguimento do OS foi de 35 meses (variação de 1-76 meses). análise de sobrevivência de Kaplan-Meier revelou que a diminuição da expressão de miR-214 foi significativamente associada com pior prognóstico tanto em termos de RFS (-log rank test = 14,214;

P

= 0,0002) e OS (-log rank test = 13,797;

P

= 0,0002) (Figura 1E).. Além disso, entre os vários parâmetros clínico investigados neste estudo, a idade, a história da NMIBC, estágio do tumor e estado dos linfonodos foram significativamente associados com resultado do CINM ao nível de significância de 5% na análise univariada. A análise de regressão multivariada de Cox incluindo a idade, história de NMIBC, estágio do tumor, estado linfonodal e miRNA-214 demonstraram que o estádio, o status de linfonodos e miRNA-214 foram predicadores prognósticos independentes de RFS e OS para CINM (Tabela 2).

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miR-214 reintrodução suprime oncogenicity

in vitro

em primeiro lugar, o nível de maturidade miR-214 expressão foi encontrado para ser significativamente down- regulada em células cancerosas da bexiga em comparação com o que em SV-HUC-1 utilizando qRT-PCR (Fig. 2A). Para investigar o potencial papel supressor tumoral de miR-214, então reintroduzida miR-214 em linhas celulares de cancro da bexiga, seguido por ensaios funcionais. Relativa expressão de miR-214 em T24 e 5637 células transfectadas com miR-214 mímico foi 22319 e 10276 vezes maior do que a transfectadas com miR-NC imitam confirmada por meio de PCR em tempo real 24 horas após transfecção (fig. 2B). Tal como indicado na Fig. 2C, foram observadas inibições proliferação significativa em células miR-214-melhorados em comparação com o controle pela Cell Counting Kit-8 de ensaio. Observamos também que proporção celular por apoptose foi significativamente aumentada após a miR-214 restauração comparação com miR-NC por citometria de fluxo (Fig. 2D), indicando um papel pró-apoptótica de miR-214 na regulação da carcinogênese. Além disso, as células cancerosas da bexiga sobre-expressam o miR-214 exibiu uma redução significativa na capacidade de migração em comparação com os controlos a cicatrização de feridas por ensaio (Fig. 3A) e ensaio de migração Transwell (Fig. 3B). Como mostrado na Fig. 3C, Transwell ensaio de invasão de matrigel com revestimento apresentado que o miR-214 reexpressão também significativamente prejudicada a capacidade de invasão de ambas as linhas celulares. É de notar que o tempo de incubação para os ensaios de migração e invasão estava dentro de 24 horas após a transfecção, durante o qual o crescimento de células cancerosas da bexiga não foi afectada pela miR-214. Assim, os efeitos inibidores sobre a migração celular e invasão não foram causados ​​pela diminuição no número de células. Estas observações demonstram que o miR-214 reintrodução suprime o oncogenicity de cancro da bexiga células

in vitro

.

(A) A expressão de miR-214 foi significativamente regulada negativamente em linhas celulares de cancro da bexiga do que em condições normais A linha de células da bexiga (SV-HUC-1). (B) A expressão relativa de miR-214 depois de miARN transfecções imitam como determinado por qRT- PCR. (C) ensaio de viabilidade celular na simulação /miR-NC /miR-214 células de câncer de bexiga transfectadas (análise estatística entre o miR-NC e miR-214: ***

P Art 0,001, teste t, n = 4). (D) A citometria de fluxo análise mostrou que a expressão forçada de miR-214 promoveu significativamente a apoptose. As barras de erro correspondem à média ± erro padrão da média (SEM). ***

P Art 0,001, teste t, n = 6.

(A) a cicatrização de feridas ensaio, (B) ensaio de migração Transwell e (C) Transwell ensaio de invasão na simulação /miR-NC /miR-214 transfectadas células de câncer de bexiga. As barras de erro correspondem à média ± SEM. ***

P Art 0,001, t-teste, n = 6.

Oncogene PDRG1 é um alvo a jusante directa de miR-214

Desde miARN geralmente exerce o seu papel através da inibição da expressão de genes alvo a jusante , que parecia ainda mais para os alvos de miR-214 para elucidar o mecanismo subjacente dos seus efeitos anti-tumorigénica. análise bioinformática Integrado (TargetScan, PicTar, PITA e Miranda) demonstra que PDRG1 contém um site de miR-214 de ligação de cortesia potencial sobre a sua 3′-UTR (Fig. 4A). Dado que, construímos primeiro vectores de luciferase PMIR-relatório contendo de tipo selvagem ou mutante 3

‘- UTR de PDRG1 inserido entre o hRluc e o gene hLuc, e, em seguida, levada a cabo ensaio de repórter de luciferase dupla por cotransfecção acima vectores com miR -214 imita ou miR-NC em células de câncer de bexiga. Como mostrado na Fig. 4B, o miR-214 suprimiu significativamente a actividade de luciferase relativa do repórter contendo o tipo selvagem 3’-UTR, mas não o repórter mutante, significando que PDRG1 é um alvo a jusante directa para miR-214 em células cancerosas da bexiga.

coerente com isso, foram observados expressão endógena deprimida de PDRG1 em ambos os níveis de mRNA e proteína no miR-214 reexpressas células de câncer de bexiga (Fig. 4C e 4D). Além disso, houve uma correlação inversa entre miR-214 e a expressão PDRG1 em tecidos de cancro da bexiga (Fig. 4E). Tomados em conjunto, os nossos resultados com força verificar que o miR-214 regula negativamente a expressão PDRG1 pela directamente vinculativa para as suas sequências de cortesia 3′-UTR.

(A) Esboço das sequências de ligação presumíveis miR-214 em PDRG1 3′- UTR ea estrutura do tipo selvagem ou mutante PDRG1 vetores PMIR-relatório. O local de ligação mutante foi em itálico e sublinhado. (B) ensaio da atividade Dual-Luciferase foi realizada em células de câncer de bexiga co-transfectadas com vectores miR-NC /miR-214 e PMIR-relatório contendo 3′-UTR /MUT-PDRG1 sequências 3′-UTR WT PDRG1. Os dados foram apresentados como a mudança de dobragem normalizada em actividade de luciferase relativa (Rluc /Luc). As barras de erro correspondem à média ± SEM. ***

P Art 0,001, t-teste, n = 6. (C) O ARNm PDRG1 foi regulada para baixo em células cancerosas da bexiga transfectadas com miR-214 por qRT-PCR. As barras de erro correspondem à média ± SEM. ***

P Art 0,001, t-teste, n = 6. (D) os resultados Western blot de expressão da proteína PDRG1 endógena em células cancerosas da bexiga transfectadas com miR-NC /miR-214 com β-actina como um controlo de carga. análise de correlação (E) de Spearman indicou uma correlação inversa entre os níveis de miR-214 expressão de mRNA e PDRG1 em tecidos de cancro da bexiga.

Em comparação com tecidos normais correspondentes, PDRG1 foi significativamente sobre-expresso em 81% dos tecidos de cancro da bexiga detectado por qRT-PCR (

P

0,001). Além disso, avaliou-se a correlação entre a expressão PDRG1 em tecidos de cancro da bexiga e os parâmetros clínico-patológicas (Tabela 1) e descobriu que a expressão PDRG1-regulada foi significativamente associada com maior estágio do tumor, maior estado dos linfonodos, maior grau e gênero. Kaplan-Meier curva de sobrevida mostrou que pacientes com câncer de bexiga com alta expressão PDRG1 sofreu RFS significativamente mais curtos (-log rank test = 6,578;

P

= 0,010) e OS (-log rank test = 8.990;

P

= 0,003) do que aqueles com baixa expressão, enquanto a análise de regressão de Cox multivariada demonstrou que PDRG1 era nem variável independente prognóstico da RFS (

P

= 0,457), nem oS (

P

= 0,145 ) para pacientes com câncer de bexiga. analisa realizando separada Kaplan-Meier para os tumores NMIBC e CINM, PDRG1 nem previu RFS nem OS quando desregulado em ambos os grupos.

PDRG1 knockdown recapitula os efeitos de miR-214 re-expressão em células de cancro da bexiga

com o objetivo de investigar se miR-214 exerce suas funções anti-tumorigénica principalmente através PDRG1, que trataram células de câncer de bexiga com PDRG1 siRNA seguidos de ensaios funcionais. O efeito do knockdown foi confirmada por RT-PCR e análise de Western blot (Fig. 5A e 5B). Tal como esperado, as inibições de proliferação significativas foram observadas em células transfectadas Si-PDRG1 em comparação com o controlo (Fig. 5C). Além do mais, as fracções de células em apoptose foram significativamente aumentados em cima PDRG1 knockdown em comparação com o controle como observado em cima do miR-214 reintrodução (Fig. 5D). O ensaio de cicatrização da ferida e Transwell ensaio de migração indicaram ambas que o Si-PDRG1 reduziu significativamente a capacidade de migração de células de cancro da bexiga (fig. 6A e 6B). Visivelmente, transpoço ensaio com revestimento matrigel manifestou que PDRG1 si- provocou um efeito inibitório sobre a invasão de células de câncer da bexiga em comparação com o grupo controle (Fig. 6C). Acima de tudo, por meio da técnica PDRG1 knockdown siRNA imitou os efeitos induzidos pela expressão forçada de miR-214, indicando que ainda PDRG1 pode servir como um mediador a jusante funcional para miR-214

.

(A) A expressão relativa de ARNm PDRG1 após transfecções de ARNip conforme determinado por qRT- PCR. níveis (B) Proteína de PDRG1 foram avaliadas por western blot em células de cancro da bexiga si-NC /si- PDRG1 com β-actina como um controlo de carga. (C) ensaio de proliferação celular em células de câncer de bexiga transfectadas com simulação /si-NC /si-PDRG1 (análise estatística entre si-NC e si-PDRG1: ***

P Art 0,001, teste t , n = 4). (D) A citometria de fluxo análise indicou que PDRG1 knockdown apoptose significativamente promovidos. As barras de erro correspondem à média ± SEM. ***

P Art 0,001, teste t, n = 6.

(A) a cura de ensaio, (B) ensaio de migração Transwell ferida e (C) Transwell ensaio de invasão em células de câncer de bexiga transfectadas com simulação /si-NC /si-PDRG1. As barras de erro correspondem à média ± SEM. ***

P Art 0,001, teste t, n = 6.

Discussão

No presente estudo, verifica-se, pela primeira vez um supressor de tumor vital, miR-214, que funciona importante na patogênese do câncer de bexiga. miR-214 foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de cancro da bexiga tumorigênicos em comparação com a linha de células epiteliais da bexiga imortalizadas não oncológica. Atenuação de miR-214 expressão foi avaliada em cerca de 74% dos tecidos de câncer de bexiga e associado com maior estágio do tumor, maior estado dos linfonodos, grau superior, multifocalidade ea história de NMIBC, sugerindo que miR-214 pode ser envolvido na progressão do cancro. Os dados são consistentes com o de diversos estudos, como se segue. Por exemplo, o miR-214 suprimiu o crescimento e invasividade de células de cancro cervical pela segmentação UDP-N-acetil-α-D-galactosamina [20]. Diminuição de miR-214 em níveis de células de cancro da mama coincidiu com o aumento da proliferação celular, invasão e acumulação do Polycomb EZH2 metiltransferase [21]. Regulação negativa de miR-214 contribuiu para a angiogénese tumoral através da indução da secreção do factor de crescimento derivado de hepatoma em hepatoma humano [22]. miR-214 potenciador regulamentado de homólogo zeste 2 e migração inibida e invasão no carcinoma humano esôfago de células escamosas [28]. miRNA expressão estudos de perfis mostraram que miR-214 foi regulada para baixo em amostras de tecido da bexiga e malignos significativamente diferencialmente expressos entre NMIBC e MIBC [23, 24]. No entanto, o miR-214 que serve como oncogene tinha sido encontrado sobre-regulada em outros cancros humanos tais como do ovário, do estômago, do pâncreas, do colo do útero, do pulmão, cancros da mucosa da nasofaringe e orais e melanomas malignos [18, 19, 29-32]. É notório que as disparidades funcionais de miR-214 em diferentes tipos de cancro pode resultar de seus diversos genes-alvo ou distinção entre os tipos de tecidos e circunstâncias celulares. Tem sido relatado que miARN pode ser silenciado por alterações genéticas estruturais (tais como a deleção genómica e mutações de inactivação), a metilação do DNA promotor e perda de acetilação da histona [33, 34]. Além disso, foi encontrada pelo menos uma cópia dos miR-214 alelos a ser eliminado em 24% dos tumores de mama primários [21]. Em nosso estudo, atenuou a expressão de miR-214 resultante da perda de genômica ou outros mecanismos, juntamente com o aumento do nível PDRG1 pode fornecer novos biomarcadores de prognóstico para a intervenção de cancro da bexiga.

No processo de avaliar a significância prognóstica de miR- 214, descobrimos que os pacientes de câncer de bexiga com baixa expressão de miR-214 tiveram uma recorrência significativamente maior e sobrevivência global mais curto após a análise cirurgia e multivariada identificou miR-214 como um fator prognóstico independente para RFS e OS em pacientes com CINM. Nossos resultados apresentaram que o miR-214 desregulação poderia servir como um romance biomarcador de prognóstico para CINM, assim como ele pode ser prognosticator em hepatoma humano [22].