Abstract

A camptotecina droga anti-câncer inibe a replicação e transcrição, aprisionando DNA topoisomerase I (Top1) covalentemente ao DNA em um “clivável complexo”. Para examinar os efeitos da camptotecina na síntese de ARN de genoma de largura foi utilizado Bru-SEQ e mostram que o tratamento camptotecina alongamento transcrição principalmente afectada. Observamos também que a camptotecina aumentou RNA lê sites de terminação da transcrição passado, bem como em elementos potenciadores. A seguir à remoção da camptotecina, propagação de transcrição, como uma onda a partir da extremidade 5 ‘de genes sem recuperação de transcrição resulta do ARN polimerases parado no corpo de genes. Como resultado, camptotecina preferencialmente inibidas a expressão de genes grandes, tais como proto-oncogenes e genes anti-apoptóticos enquanto que os genes de proteínas ribossomais menores, genes pró-apoptóticos e genes alvo p53 mostrou relativo mais elevado de expressão. Cockayne fibroblastos grupo síndrome B (CS-B), que são defeituosos de reparação acoplado a transcrição (TCR), mostrou um perfil de recuperação síntese de ARN semelhante a fibroblastos normais, sugerindo que o TCR não está envolvida na reparação de recuperação ou a síntese de ARN a partir de transcription- bloqueando lesões Top1. Estes resultados dos efeitos da camptotecina na transcrição têm implicações importantes para as suas actividades anti-cancerígenas e pode auxiliar na concepção de tratamentos melhorados envolvendo combinatórias venenos TOP1.

Citation: Veloso A, B Biewen, Paulsen MT, Berg N, Carmo de Andrade Lima L, Prasad J, et al. (2013) Genome-Wide Efeitos da transcrição do Agente camptotecina Anti-Câncer. PLoS ONE 8 (10): e78190. doi: 10.1371 /journal.pone.0078190

editor: Didier Auboeuf, INSERM, França |

Recebido: 05 de junho de 2013; Aceito: 02 de setembro de 2013; Publicação: 23 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Veloso et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Ciências ambientais (1R21ES020946) e do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (1R01HG006786). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a topoisomerase I de ADN (Top1) relaxa a tensão de torção que é gerada na hélice de DNA como uma consequência da replicação, transcrição e remodelação da cromatina [1,2]. A reação Top1 mediada envolve a ligação ao DNA, a clivagem de uma cadeia da hélice do DNA seguido pela passagem da outra cadeia através do intervalo e, finalmente, a nova selagem da quebra de cadeia de ADN covalente. A camptotecina de drogas anti-cancro inibe especificamente Top1 [3], actuando antes do passo de voltar a vedar, de forma eficaz prendendo Top1 ligado covalentemente ao DNA de um “complexo clivável.” A camptotecina e outros venenos TOP1 são utilizados para o tratamento de ovário, colo do útero, do cólon, do pâncreas, do pulmão, da mama, da próstata e cancros cerebrais [4]. A actividade anti-cancro da camptotecina está relacionada com a toxicidade mediada por replicação [5]. O efeito inibidor da camptotecina na transcrição também tem sido reconhecido que contribuem para a toxicidade em células que não se dividem [6,7].

Nós já mostrou que os complexos Top1-DNA estabilizou-camptotecina retardar o alongamento, mas não iniciação da transcrição [8]. De facto, observou-se um aumento da ocupação de ARN polimerase II na região promotora de

gene de DHFR

correlacionando a um aumento da taxa de iniciação da transcrição [8]. Em resposta ao bloqueio de alongamento da transcrição, Top1 está orientada para a degradação de uma forma dependente da ubiquitina [9] e os resíduos de ácido subsequentes residual ligado ao ADN de amino podem requerer a acção de fosfodiesterase-ADN tirosil 1 (TDP1) para a sua remoção, a fim de transcrição alongamento para retomar a [10]. O bloqueio do mecanismo de transcrição por complexos TOP1 aprisionados em ADN por camptotecina foi mostrado para levar à indução de DNA quebras de cadeia dupla [6] e a formação de ADN-ARN estruturas híbridas (R-loops) activar o stress cinase ATM [7 , 11]. Além disso, este stress transcrição resulta em activação da via de resposta a p53 [12-15] e indução de processamento de dano de ADN mediada por 53BP1 [16]. Top2 e PARP1 desempenham papéis sobrepostos para Top1 em células que não se dividem, sugerindo que a combinação de Top1, Top2 e drogas de direccionamento de PARP podem ser eficazes em células tumorais em divisão não [15].

Após reversão camptotecina, a reação topoisomerase está concluído e complexos de transcrição são pensados ​​para retomar o alongamento. Curiosamente, observamos anteriormente que a recuperação da síntese de ARN a partir do

gene DHFR em células CHO a seguir à remoção camptotecina retomado como uma onda numa ‘direcção 5’-3 sem recuperação aparente a jusante do gene [8] . Isto sugere que os complexos de transcrição bloqueados por complexos Top1 presos não são capazes de retomar o alongamento após a reversão camptotecina [8]. A proteína de Cockayne grupo de complementação B (CSB) com defeito na reparação acoplado a transcrição (TCR) tem sido sugerido para ser envolvido na reparação de ADN-Top1 covalentemente ligados [17]. Foi sugerido que este foi acoplado a uma recuperação mais lenta da síntese de RNA total em células CS-B correlacionando a uma hipersensibilidade a exposição camptotecina [15,17,18]. No entanto, outros estudos não encontraram defeito na recuperação de síntese de RNA seguinte CSB knockdown [16].

Para analisar o efeito directo da camptotecina on-larga genoma transcrição e explorar recuperação transcrição após a remoção de drogas, utilizou-se o recentemente desenvolvido método Bru-Seq [19]. Esta técnica baseia-se na marcação metabólica de ARN utilizando bromouridine (Bru) seguido por isolamento específico de ARN nascente BRU-marcado, a preparação da biblioteca e a sequenciação profunda [19]. Os nossos resultados mostram que a camptotecina inibidor Top1 provoca uma inibição preferencial de expressão de genes grandes através do bloqueio da elongação de transcrição em combinação com uma falta de recuperação da síntese de ARN-polimerases bloqueados no corpo dos genes. Além disso, encontramos nenhum defeito na recuperação síntese de RNA em células CS-B após a reversão camptotecina, sugerindo que TCR pode não ser necessária para a recuperação após topo I inibição reversão.

Materiais e Métodos

celular linhas, tratamento camptotecina e Bru-Seq

hTERT imortalizado humanos diplóides fibroblastos de prepúcio (oferta do Dr. Mary Davis, Departamento de radiação Oncológica da Universidade de Michigan) e CS-B fibroblastos (GM00739, Cell Repository Coriell) foram crescidas como monocamadas em MEM fornecidos com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (Invitrogen). As células foram tratadas durante 45 minutos com 20 uM de camptotecina (Sigma) e marcadas durante 15 min com 2 mM bromouridine quer durante os últimos 15 min de tratamento de camptotecina ou de lavagem seguinte. Os procedimentos seguintes e BRU-BruChase-seq foram realizados como previamente descrito [19]. Em resumo, o ARN total foi isolado a partir das amostras de células, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen), seguido por isolamento específico de ARN BRU-marcadas utilizando anticorpos anti-BrdU (BD Biosciences) conjugado com pérolas magnéticas (Dynabeads, de cabra anti-IgG de ratinho, Invitrogen) . O ARN isolado foi então convertida numa biblioteca de ADN específica de cadeia simples utilizando o kit Ilumina TruSeq (Ilumina) como anteriormente descrito [19].

Illumina Hi-Seq sequenciação e análise de dados

O sequenciamento das bibliotecas de cDNA foi realizada pela equipe da Universidade de Michigan Sequencing núcleo usando o sequenciador Illumina HiSeq de 2000. chamada base foi realizada utilizando Illumina Casava v1.8.2. e mapeamento ler foi realizada utilizando TopHat, aceitando apenas lê-se que poderia ser mapeado de forma única para o genoma. Foram calculados os valores RPKM a partir dos dados Bru-seq e plotados os dados usando um navegador custom-built como descrito anteriormente [19].

Dados disponibilidade

Os dados primários utilizados nas análises foi depositado em Gene Expression Omnibus NCBI e está disponível gratuitamente. Nós ter carregado os arquivos BAM mapeamento do genoma originais e as listas de síntese de derivados como arquivos cama. O número de acesso é GSE48678 eo link completo é https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48678.

Resultados

A camptotecina preferencialmente inibe a síntese de RNA de grandes genes

Nós desafiados fibroblastos humanos durante 45 min com 20 mM camptotecina e rotulados RNA com Bru 2 mM para o último 15 min na presença de camptotecina. A sequenciação lê a partir do Bru contendo ARN nascente mapeado ao longo genes abrangendo ambos os exões e intrões e as taxas relativas da transcrição foram determinados para todos os genes somando o número de leituras ao longo dos genes e dividindo-o pelo comprimento do gene. A densidade de leitura foi expresso como “lê por lote de mil pares de bases por milhão lê” (RPKM). estatísticas da amostra podem ser encontrados na Tabela S1. tratamento camptotecina taxas de transcrição de genes de 1142 inibido por mais do que duas vezes ao aumentar a transcrição de genes de 919 por mais do que 2 vezes (Figuras 1 A e B, Figura S1, S2 no ficheiro S1 e S2 Tabela). Se os genes foram identificados como o aumento das taxas relativas da transcrição são realmente a ser sintetizado a uma taxa mais elevada absoluta não é determinada uma vez que os dados gerados a partir BRU-Seq representa a distribuição de leituras em vez de valores absolutos de expressão. Portanto, quando a síntese é reduzida no corpo de grandes genes, a sequenciação lê deve acumular-se em outro lugar (isto é, em pequenos genes e no início de grandes genes).

fibroblastos humanos foram tratados com 20 ^ M durante 45 min camptotecina com Bru 2 mM adicionada durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. (A), genes longos, tais como

iniciação TRIO

, defeitos exposição de alongamento, mas não transcrição, após o tratamento camptotecina. (B), genes de curta duração, tais como

BAMBI

, mostram um aumento relativo da síntese de RNA após o tratamento camptotecina. (C), Efeito da camptotecina na transcrição relativa como uma função do tamanho do gene. Relação sinal Bru-SEQ de genes individuais em camptotecina-tratados em relação às células de controlo como uma função do tamanho do gene. genes mais longos são inibidas preferencialmente sobre genes mais curtos. (D), a mediana do tempo de genes induzidos 2 vezes por camptotecina (919 genes) é 8927 pb, enquanto que os genes regulados negativamente 2 vezes (1.145 genes) têm um comprimento médio de 136355 pb. Os mapas de genes são de Genes RefSeq (navegador genoma UCSC).

Os dados mostram uma correlação negativa óbvia entre a intensidade de leitura e tamanho gene após o tratamento camptotecina (Figura 1C). O tamanho médio dos genes com mais do que uma diminuição de 2 vezes taxas de transcrição relativa era de 107089 pb. (Figura 1D). O tamanho genômico mediana dos 919 genes que mostram taxas de transcrição relativa aumentou após o tratamento camptotecina foi 7.748 pb. Estes resultados são consistentes com um mecanismo de acção pelo qual camptotecina inibe a transcrição de alongamento sem inibir a iniciação da transcrição [8].

A camptotecina afeta terminação da transcrição e expressão de ncRNA e RNA potenciador (Erna)

Para muitos genes curtos onde nenhuma inibição do alongamento era evidente após o tratamento camptotecina, transcrição ler-through após o anotada 3 ‘ poli (a) local era proeminente (Figura 2A, Figura S3 no ficheiro S1). Estes dados apoiam um papel para a topoisomerase I de terminação da transcrição destes genes em [20]. Alternativamente, o aumento do número de leituras para além dos locais de terminação anotado, pode resultar da indução dos locais poli A alternativa (a) a seguir ao tratamento de camptotecina ou de estabilização do ARN além do local de 3’-clivagem. Muitos genes em células de mamíferos têm sido mostrados para gerar transcritos de promotor divergente a montante (as instruções) [19,21]. A expressão de alguns solicita que foi dramaticamente aumentada por tratamento de camptotecina (Figura 2B, Figura S4 A-C no ficheiro S1). Além disso, muitos genes divergentemente transcritos mostrou coordenar reforço de iniciação, o que sugere que a superespiralidade negativo deverá acumular na sequência de transcrição na ausência da actividade da topoisomerase I pode aumentar a iniciação da transcrição (Figura S4 D-F). Finalmente, o tratamento camptotecina chumbo para a produção de intensif icador mais ARN (Erna) a partir de muitos elementos intensificadores conhecidos e putativos, tais como a 5 ‘

FOS

potenciador (Figura 2C, Figura S5 S1 no ficheiro). A conseqüência funcional da geração aumentada de Erna após o tratamento camptotecina não é clara já que a taxa de transcrição relativa do gene

FOS

não foi elevada, apesar do aumento na geração de Erna. Para além de inibir o alongamento de genes codificadores de proteínas, camptotecina inibiu alongamento transcrição de transcritos microRNA primário (Figura 2D) e RNAs não-codificantes longos melhoradas ou reprimidos (lncRNAs) (Figura 2E F).

Como na Figura 1, fibroblastos humanos foram tratadas com camptotecina 20 uM durante 45 min com 2 mM Bru adicionada durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. (A), transcricional readthrough do local de terminação da

gene RHOB

induzida por camptotecina. (B), a iniciação melhorada do

ASCC3

gene e regulação positiva coincidente de RNA PROMPT montante divergente. (C), maior expressão da Erna do potenciador 5′-a montante do

FOS

por camptotecina. (D), A camptotecina inibe a transcrição do transcrito primário de miRNA138-1. (E), camptotecina induz a transcrição do ncRNA MALAT1. (F), A camptotecina inibe a transcrição de um tempo muito longo ncRNA anotadas no cromossoma 2. Os mapas de genes são a partir de genes RefSeq (navegador genoma UCSC).

Transcrição recupera como uma onda desde a extremidade 5 ‘ seguinte camptotecina remoção

a captura de topoisomerase I de DNA por camptotecina é pensado para ser um evento parcialmente reversível [2]. Para explorar se a remoção de camptotecina inverte os seus efeitos sobre a transcrição, foi utilizado BRU-Seq para examinar o transcriptoma ARN nascente em células após lavagem droga. Para obter uma imagem global do efeito da camptotecina na síntese de ARN nascente de múltiplos genes, que seleccionado genes altamente expressos (RPKM maior do que um) e maior do que 100 kb e alinhados segundo os seus locais de início da transcrição. Descobrimos que a camptotecina induziu um forte sinal acima do controlo dentro dos primeiros 10 kb de genes, seguido de uma queda grave no sinal abaixo de controlo mais a jusante (Figura 3A). Estes resultados sugerem que a inibição e aprisionamento da topoisomerase I por camptotecina não inibe a iniciação da transcrição, mas inibe fortemente alongamento. Quando camptotecina Lavou-se para fora e as células foram marcadas com bromouridine durante 15 min na ausência da droga, a recuperação de propagação de transcrição a partir da extremidade 5 ‘do gene, enquanto em nenhuma recuperação de sinal foi observado mais a jusante do gene. Após lavagem da droga e a incubação durante 15 minutos em meio isento de drogas e, em seguida, o ARN nascente para rotular os 15 minutos seguintes, a onda de transcrição movido ainda mais para o gene na direcção 3 ‘. Novamente, nenhuma recuperação do sinal foi observado mais a jusante no gene. Curiosamente, a taxa à qual a transcrição onda propagação da extremidade 5 ‘e para dentro do corpo dos genes foi de aproximadamente 1,1-1,3 kb /min (Figura 3, Figura S6 em S1 do ficheiro). Isto é mais lenta do que a taxa de alongamento estimado de cerca de 2 kb /min em células em condições normais [22]. Se elongando polimerases de ARN colidir com topoisomerases presos, dano ao DNA irreversível pode ser induzida que exigiria processamento adicional [6]. É possível que esta taxa de alongamento reduzido observado após o tratamento camptotecina e washout é devido a um pedido de um reparo Top1 /induzida por camptotecina dano ao DNA de ter lugar antes de alongamento pode retomar.

(A), vista agregado de a síntese de RNA de genes maiores do que 100 kb de fibroblastos humanos normais com os genes alinhados por locais de iniciação da transcrição (SST). recupera a síntese de RNA, como uma onda numa direcção 5′-para-3 ‘a seguir à remoção camptotecina sem recuperação aparente de polimerases de ARN parado no corpo dos genes. as taxas de alongamento da onda transcrição recuperação foi estimada como sendo ~ 1,2 kb /min. (B), da onda de recuperação da síntese de ARN pode ser visto a partir de avançar a extremidade 5 ‘da

gene CD44

sem recuperação aparente no corpo do gene. A frente da onda de transcrição alargado cerca de 35 KB durante a primeira recuperação de 30 min, resultando em uma taxa de alongamento de cerca de 1,2 kb /min. (C) taxas de alongamento similares após a remoção camptotecina foi encontrado com o gene

MEISE1

. tecla de cor:

Blue

, controle (30 min rotulagem Bru);

Yellow

, rotulagem Bru durante a última 15 min de um tratamento camptotecina 45 min;

Green

, 45 min tratamento camptotecina seguido de uma lavagem de drogas e 15 min de rotulagem Bru;

Red

, 45 min tratamento camptotecina seguido de uma lavagem de drogas, 15 min de incubação e, finalmente, 15 min Bru rotulagem.

Sem aparente defeito na recuperação da síntese de RNA no CS- As células B seguintes camptotecina reversão

As células derivadas de pacientes com síndrome de Cockayne são hipersensíveis a camptotecina [18]. Esta hipersensibilidade está ligada a uma indução aumentada de rupturas dos filamentos duplos em fase S como garfos de replicação “colidir” com complexos Top1 presos [18]. Alguns estudos também têm demonstrado que a recuperação da síntese de RNA é mais lento em células CS [15,17,18], enquanto outros estudos não encontraram nenhum defeito na recuperação síntese de RNA [16]. Usando BRU-Seq testámos se a recuperação da síntese de ARN nascente em fibroblastos CS-B a seguir ao tratamento camptotecina e reversão diferia da recuperação em fibroblastos humanos normais. A análise do sinal de transcrição agregado de genes, pelo menos 100 kb ou mais longas demonstraram que as células-B CS recuperado a síntese de ARN de uma onda da extremidade 5 ‘destes genes de uma forma similar à dos fibroblastos normais (Figura 4A). Este foi também aparente para os genes individuais (Figura 4B C, figura S7 no ficheiro S1). Além disso, nenhuma recuperação da transcrição ocorreu nos corpos dos genes que sugerem que polimerases de ARN bloqueados não são capazes de retomar o alongamento após a remoção camptotecina. A recuperação normal resulta da síntese de ARN nestas células CS-B foi em nítido contraste com a recuperação defeituosa da síntese de ARN nascente nestas células após a irradiação de UV (dados não publicados).

(A), de agregados de vista a síntese de RNA de genes maiores do que 100 kb em células CS-B com os genes alinhados por locais de iniciação da transcrição (TSS) como na Figura 3. as taxas de alongamento da onda transcrição recuperação foi estimada como sendo ~ 1,0-1,3 kb /min. genes individuais em fibroblastos de um indivíduo CS-B mostrando as taxas de recuperação semelhantes como em fibroblastos de um indivíduo normal para (B),

CD44 Comprar e (C)

MEIS1

. chave de cor como na Figura 3.

A camptotecina expressão do gene do cancro relevantes afetada

Performing análise enriquecimento gene DAVID descobrimos que genes induzida por camptotecina de codificação para os elementos do ribossomo, mitocôndria e p53 e de sinalização de apoptose vias foram altamente representada (Figura 5, Tabelas S2-4). O conjunto de genes que se encontram a ser inibido imediatamente após o tratamento camptotecina foi enriquecida para fosfoproteínas, proto-oncogenes e genes envolvidos no ciclo celular mitótico, a conjugação de ubiquitina e anti-apoptose. Alguns grandes proto-oncogenes representativos inibidas por camptotecina são apresentados na Figura 6A. Tem sido mostrado que o bloqueio do alongamento da transcrição por camptotecina desencadeia uma resposta de stress que conduz à rápida acumulação de p53 acompanhada por fosforilação do sítio de Ser15 e acetilação do sítio Lys382 [12]. Em apoio da camptotecina induzir uma resposta p53 em fibroblastos humanos, descobrimos que camptotecina induzida genes na via de sinalização p53, incluindo

CDKN1A

(p21),

MDM2, BTG2

e

FAS

(Figura 6B). Alguns destes genes foram induzidas já durante o tratamento enquanto que a expressão camptotecina alguns genes, como CDKN1A e MDM2, mostrou apenas induzida após a reversão do tratamento medicamentoso. A camptotecina reduziu as taxas de transcrição relativamente grandes de genes anti-apoptóticos e expressão aumentada de um conjunto de genes pró-apoptóticos de menor tamanho (Figura 6c). genes pró-apoptóticos são geralmente mais compacta em relação a genes anti-apoptóticos [23], Assim, os agentes de redução, preferencialmente, a expressão de genes grandes, bloqueando o alongamento da transcrição são esperados para deslocar o equilíbrio da expressão do gene em favor da apoptose. padrões semelhantes de expressão gênica relativa aumentou e diminuiu após o tratamento camptotecina e reversão foi encontrado com células CS-B (Figura S8 em S1 Arquivo). Não foram, no entanto, algumas diferenças entre fibroblastos humanos normais e as células CS-B foram observados, tais como a falta de reduzida

Gli2

expressão e não indução dos genes regulados por p53

DUSP5

,

FAS

,

MDM2 e

TRIM22

em células CS-B

.

Acesso (a) representados por genes para cima regulada, pelo menos, duas vezes, e (B) regulada para baixo, pelo menos duas vezes após o tratamento com camptotecina e de recuperação. fibroblastos humanos foram tratadas com 20? M camptotecina durante 45 minutos e incubou-se durante pelo menos 15 min com Bru 2 mM ( “0 min”), incubadas durante 15 min com Bru a seguir à remoção da camptotecina ( “15 min”) ou incubou-se durante 15 min com Bru após um tratamento de 45 minutos, uma lavagem e uma recuperação de 15 min ( “30 min”). análise de enriquecimento foi realizada utilizando DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov) e os números mostrados representa os valores p para enriquecimento.

(A), exemplos de grandes proto-oncogenes inibidas por camptotecina e mostrando nenhuma recuperação (ou recuperação lenta) após a remoção de drogas. (B), Exemplos de genes-alvo p53 induzida a seguir a tratamento de camptotecina. (C), os exemplos de grandes genes anti-apoptóticos que mostra reduzida transcrição relativa (esquerda) e exemplos de pequenas genes pró-apoptóticos que mostram transcrição relativa aumentada após o tratamento com camptotecina (à direita). (D), Modelo de mecanismos pelos quais a camptotecina pode induzir a morte celular ou inibir o crescimento celular. A camptotecina desencadeia uma resposta transcricional de p53 e inibe selectivamente grande proto-oncogenes e genes de sobrevivência. Os dados são codificados por cores, onde o azul representa o controle (C), amarelo representa 15 min Bru-rotulagem, no final de um tratamento de camptotecina 45 min sem recuperação ( “0 min”), o verde representa washout de drogas e 15 min Bru-rotulagem imediatamente depois de washout ( “15 min”) e, finalmente, o vermelho representa rotulagem 15-30 minutos após washout ( “30 min”).

Discussão

a camptotecina e seus derivados são aprovados pela FDA anti -Câncer drogas utilizadas para tratar uma variedade de tumores [4]. Eles agem por aprisionamento complexos de topoisomerase I em DNA em vez de inibir a função enzimática, uma vez que RNAi knockdown de Top1 não reduz a sobrevivência das células com a mesma intensidade como tratamento camptotecina [4,24]. Neste estudo, utilizou-BRU-Seq para explorar os efeitos agudos de camptotecina em vários aspectos de transcrição e descobriram que a camptotecina (I) inibiu o alongamento da transcrição, (ii) estimulada transcricional read-through passado a extremidade 3 ‘de genes pequenos , (iii) expressão aumentada de Erna de certos elementos potenciadores (iv) induziu a resposta de p53 e (v) deslocou o equilíbrio de expressão de genes de apoptose-regulação em favor da apoptose. Importante, a transcrição recuperado com uma taxa de alongamento reduzido como uma onda a partir da extremidade 5 ‘do gene sem recuperação aparente de síntese a partir de ARN-polimerases bloqueados no corpo dos genes. Não encontramos nenhuma evidência de que a recuperação da síntese de RNA foi diferente em fibroblastos CS-B, que está em nítido contraste com a recuperação da síntese de RNA nestas células após a luz UV (dados não publicados). Assim, os mecanismos responsáveis ​​pela recuperação da síntese de RNA após a remoção camptotecina são fundamentalmente diferentes dos exigidos seguinte radiação UV sugerindo que o reparo acoplado à transcrição não tem um papel importante no reinício da transcrição após a remoção camptotecina. Assim, é concebível que a hipersensibilidade observada de células CS-B para a camptotecina está relacionada com algum papel da proteína CSB durante a recuperação de replicação vez que na recuperação de transcrição [18].

A incapacidade das células de reinício da transcrição a partir de dentro do corpo de genes sugere que as polimerases de ARN bloqueados são descartados, em vez de reciclado. Isto irá preferencialmente voltar a definir a expressão de genes grandes, mesmo após uma exposição limitada de células a camptotecina. Curiosamente, muitas proto-oncogenes e genes anti-apoptóticos pertencem à classe de genes preferencialmente inibidas pela camptotecina. O modelo que emerge é que o envenenamento de Top1 por camptotecina resultados na inibição de grandes proto-oncogenes, expressão aumentada de pequenos genes pró-apoptóticos e a activação da via da p53 (Figura 6D). O conhecimento do tamanho dos oncogenes que dirigem a carcinogénese e são importantes para a sobrevivência de células cancerosas em um dado tumor pode ser usado para seleccionar os pacientes que seria especificamente beneficiar do tratamento de camptotecina e de combinar racionalmente camptotecina com outras modalidades de tratamento. Por exemplo, a expressão do gene da proteína grande domínio RING associado a BRCA1 1 (BARD1) foi reduzida por camptotecina. Tal supressão seria esperado para suprimir a recombinação homóloga e, portanto, devem conduzir a susceptibilidade aumentada a inibidores de PARP ou a terapia de radiação. De facto, tem sido demonstrado que a combinação de camptotecina com os inibidores da PARP ou radioterapia melhora o controlo do tumor [4,25-27].

Informações de Suporte

arquivo S1.

Apoio Figuras.

Figura S1. Grandes genes inibida por camptotecina. (A),

SULF1

, (B),

NAV2

, (C),

SH3BP4

, (D),

KCNN2

, (E ),

PLCB4 Comprar e (F),

TLE4

genes estão mostrando a inibição do alongamento da transcrição na sequência de um 45 min tratamento de 20 mM camptotecina. células de fibroblastos humanos foram incubadas com Bru 2 mM durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. Os mapas de genes são a partir de genes RefSeq (navegador genoma UCSC). Figura S2. Exemplos de genes que mostram pequenas relativo mais elevado de transcrição lê a seguir ao tratamento camptotecina. (A),

RGS2

, (B),

HSPB3

, (C),

FUS

, (D),

TSPYL2

, (E ),

CHCHD7 Comprar e (F),

TP53

representam genes que são regulados positivamente na sequência de um tratamento de 45 min com 20 mM camptotecina. células de fibroblastos humanos foram incubadas com Bru 2 mM durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. Os mapas de genes são a partir de genes RefSeq (navegador genoma UCSC). Figura S3. readthrough transcrição aumentada para além da extremidade 3 ‘de genes curtos. (A),

FZD7

, (B),

MYC

, (C),

Cyr61

, (D),

DKK1

, (E ),

SSTR1 Comprar e (F),

IER5

. células de fibroblastos humanos foram tratadas com camptotecina 20 uM durante 45 minutos e incubadas com Bru 2 mM durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. Os mapas de genes são a partir de genes RefSeq (navegador genoma UCSC). Figura S4. Efeito da camptotecina na transcrição a montante divergente. Camptotecina induz divergentes transcrição promotora a montante no (A),

CEP78

, (B),

FER Comprar e (C),

RAB33B

genes e aumentos gene divergentes transcrição para (D),

PLAG1

e

CHCHD7

, (e),

CCDC58

e

FAM162A Comprar e (F),

IMMP1L

e

ELP4

genes. células de fibroblastos humanos foram tratadas com camptotecina 20 uM durante 45 minutos e incubadas com Bru 2 mM durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. Os mapas de genes são a partir de genes RefSeq (navegador genoma UCSC). Figura S5. Efeito da camptotecina em potenciadores putativos definidas como regiões com alta H3K4m1 e H3K27ac enquanto a baixa H3K4m3 modificações de histonas. células de fibroblastos humanos foram tratadas com camptotecina 20 uM durante 45 minutos e incubadas com Bru 2 mM durante os últimos 15 min de tratamento camptotecina para rotular ARN nascente seguido por BRU-Seq. Os mapas de genes, marca de histonas e DNase faixas de hipersensibilidade são de codificar e Genes RefSeq (navegador genoma UCSC). Figura S6. Efeito da reversão camptotecina sobre a síntese de ARN em fibroblastos humanos normais. Recuperação da síntese de ARN é observado como uma onda na direcção 5 ‘para 3’ a seguir à remoção camptotecina sem recuperação aparente de polimerases de ARN parado no corpo dos genes para a (A)

TOP1

, (B)

Smad3 Comprar e (C)

TLE4

genes. tecla de cor:

Blue

, transcrição lê em células de controlo;

Yellow

, transcrição lê a partir de células marcadas com Bru durante a última 15 min de um tratamento de 45 minutos com a camptotecina;

verde

, transcrição lê a partir de células marcadas durante 15 minutos com uma lavagem seguinte Bru-de camptotecina após um tratamento de 45 min;

Red

, transcrição lê a partir de células marcadas com Bru 15 minutos após a lavagem da droga na sequência de um tratamento de 45 min. Figura S7. Efeito da reversão camptotecina sobre a síntese de ARN em fibroblastos CS-B. Recuperação da síntese de ARN é observado como uma onda na direcção 5 ‘para 3’ a seguir à remoção camptotecina sem recuperação aparente de polimerases de ARN parado no corpo dos genes para a (A)

TOP1

, (B)

Smad3 Comprar e (C)

TLE4

genes. tecla de cor:

Blue

, transcrição lê em células de controlo;

Yellow

, transcrição lê a partir de células marcadas com Bru durante a última 15 min de um tratamento de 45 minutos com a camptotecina;

verde

, transcrição lê a partir de células marcadas durante 15 minutos com uma lavagem seguinte Bru-de camptotecina após um tratamento de 45 min;

Red

, transcrição lê a partir de células marcadas com Bru 15 minutos após a lavagem da droga na sequência de um tratamento de 45 min. Figura S8. Efeito da camptotecina na expressão de genes mostrados na Figura 7 em células CS-B. (A), grandes proto-oncogenes inibidas por camptotecina e não apresentando /lenta recuperação após a remoção de drogas. O

gene Gli2

não foi afetada pelo tratamento camptotecina em células CS-B. (B), os genes p53 alvo onde apenas alguns foram induzidas em células de CS-B, após o tratamento de camptotecina. (C), os exemplos de grandes genes anti-apoptóticos que mostram diminuição da transcrição relativa (leftt) e exemplos de pequenas genes pró-apoptóticos mostrando reforçada transcrição relativa em células CS-B, após o tratamento camptotecina (à direita).