Abstract

5-fluorouracil (5-FU) e sua pró-droga capecitabina têm sido amplamente usado no tratamento do cancro colo-rectal. No entanto, nem todos os pacientes respondem ao fármaco, pelo que existe a necessidade de desenvolver biomarcadores preditivos precoces fiáveis ​​para a resposta de 5-FU. Aqui, nós relatamos uma abordagem funcional Single Nucleotide Polymorphism (pfSNP) romance potencialmente identificar SNPs que podem servir como biomarcadores preditivos de resposta ao 5-FU em pacientes chineses câncer colorretal metastático (CRC). 1547 pfSNPs e uma repetição número variável tandem (VNTR) em 139 genes em 5-FU drogas (tanto PK e caminho PD) e as vias doença do cancro colorectal foram examinados em 2 grupos de pacientes com CCR. Encolhimento de metástases hepáticas medido por critérios RECIST foi utilizado como o ponto final clínico. pfSNPs específicas-non-responder quatro foram encontrados para explicar 37,5% de todos os não-respondedores (P 0,0003). Cinco pfSNPs adicionais foram identificadas a partir de um modelo multivariado (AUC sob ROC = 0,875) que foi aplicado para todos os outros pfSNPs, excluindo os pfSNPs não-específico-responder. Estes pfSNPs, que podem diferenciar os outros não-respondedores de respondedores, residem principalmente em genes supressores de tumores ou genes implicados no risco de câncer colorretal. Assim, um total de 9 novos SNPs com potencial significado funcional pode ser capaz de distinguir não-respondedores de responsivos ao 5-FU. Estes pfSNPs pode ser biomarcadores úteis para predizer resposta ao 5-FU

Citation:. Wang J, Wang X, Zhao M, Choo SP, Ong SJ, Ong SYK, et al. (2014) SNPs potencialmente funcionais (pfSNPs) como novos Genomic Preditores de 5-FU Response em metastáticos colorretais pacientes com câncer. PLoS ONE 9 (11): e111694. doi: 10.1371 /journal.pone.0111694

editor: Anthony W I. Lo, Queen Mary Hospital, Hong Kong

Recebido: 22 de julho de 2014; Aceito: 29 de setembro de 2014; Publicação: 05 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (SERC 112 148 0008) a partir de Singapura BioMedical Research Council – Conselho de Ciência e Pesquisa de Engenharia (BMRC-SERC) a a /Professores Caroline Lee, Simon Ong, Yik Ying Teo e Samuel Chong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Todos os anos, mais de um milhão de pessoas em todo o mundo irá desenvolver cancro colorectal [1], respondendo por 10% da carga global do câncer. O câncer colorretal (CRC) é o cancro mais frequentemente diagnosticado em Singapura (7.909 novos casos entre 2005-2009) [2]. Mais da metade dos pacientes com CCR desenvolvem a doença metastática (estágio 4), quer no diagnóstico ou na recidiva após terapêutica intenção curativa inicial. Isto traduz-se uma proporção substancial de pacientes que podem necessitar de tratamento para as metástases ou recidiva do cancro colorectal.

5-fluorouracilo (5-FU) e a sua pró-droga, Capecitabina, são amplamente utilizados no tratamento de CRC. Propôs-se que existem dois modos de acção distintos para 5-FU. Primeiro, actua como anti-metabolito em que a sua forma activa, FdUMP, produzido pela timidina fosforilase (Tymp), inibe a timidilato sintase (Tyms). Em segundo lugar, pode induzir a morte celular, em que a sua incorporação de produtos FUTP activo e FdUTP em ARN e de ADN, respectivamente, conduz a apoptose celular subsequente [3]. A uridina monofosfato sintetase (umps, também conhecidos como OPRT) é responsável pela conversão de 5-FU para FUMP, que é o primeiro passo de produção e FUTP FdUTP. Contudo, as duas vias podem sobrepor-se, porque o produto intermediário na via de “toxicidade celular”, FUDP, podem também ser convertidos em FdUDP e subsequentemente FdUMP e participam na via de “anti-metabolito”. 5-FU é catabolizado para a forma inactiva de DHFU por hidropirimidina desidrogenase (DPYD), e DPYD é a enzima limitante da velocidade na degradação de 5-FU.

Actualmente, não existem testes fiáveis ​​para a detecção precoce do resposta ao 5-FU. Desenvolver um biomarcador preditivo precoce confiável de resposta à quimioterapia comum, como 5-FU, em câncer colorretal metastático tem o potencial de levar a adaptação adequada de tratamento para pacientes individuais e ajudar a mover-nos mais perto de um atendimento realmente personalizado. benefícios globais custo económico são realizados em ambos os respondedores previstos e não-respondedores. Respondedores receber tratamento adequado, com a confiança de resposta previsto. Previsto não-respondedores ao tratamento convencional evitar desperdício despesa de 3 ciclos de tratamento fútil, toxicidades desnecessárias que se exigem remédios e perda de tempo em termos de tratamento fútil e perda de uma janela de oportunidade para um tratamento eficaz. Estes pacientes podem ser selecionados como candidatos para novas terapias e quimioterapia de combinação.

Até agora, apenas a variantes nos genes “5-FU PD” foram relatados para ser significativamente associada com eficácia 5-FU medido pela redução do tumor em alguns estudos [4] – [7]. Infelizmente, a replicação de tal associação relatada entre variantes genéticas “5-FU PD” e redução do tumor permanece um desafio [4], [6], [8] – [13], o que sugere a possível presença de outros locais na determinação 5-FU eficácia .

foi interessante notar que as variantes nos genes “5-FU” PK foram investigados principalmente pela sua associação com a toxicidade do 5-FU, não eficácia [14] – [17], apesar dos níveis de expressão desses genes tenham sido previamente associadas com 5-FU eficácia [18]. esforços limitados [8], [19] tentou explorar a possível associação de eficácia, mas não conseguiu.

Além disso, a maioria dos estudos sobre a resposta ao tratamento com 5-FU focado principalmente na SNPs em alguns genes candidatos. Apenas um estudo analisou 21 variantes principalmente na região de 11 genes envolvidos no metabolismo /acção da 5-FU e outras vias farmacológicos relacionados [19] de codificação. No entanto, este estudo ainda não exaustivamente interrogar todas as variantes possíveis que podem estar envolvidos na resposta de 5-FU.

Outra limitação dos estudos atuais é que somente análises univariadas foram, até agora, sido empregado e este não pode ter potência suficiente para detecção de associação de resposta à droga com raras SNPs menos comuns /com pequeno tamanho da amostra. modelo multivariada foi empregada com sucesso para estimar a dose apropriada de varfarina com base em dados clínicos e genéticos [20].

Assim, neste estudo, que empregam uma nova abordagem interrogar SNPs potencialmente funcionais (pfSNPs) em drogas relevante e via de doença para identificar associação com a resposta à droga. 1.547 SNPs potencialmente funcionais + 1 VNTR (número variável Tandem Repeat) de 139 genes no droga foram examinados (ambos PK e PD via) e as vias de doença. Potencialmente SNPs funcionais foram identificados usando o Resource pfSNP Web (https://pfs.nus.edu.sg/) [21] que incluía SNPs que foram previamente relatados para ser funcional ou associada à doença de resposta /drogas; SNPs que foram inferidos como sendo potencialmente funcional das abordagens genéticas, bem como aqueles previstos para ser potencialmente funcional a partir de motivos de sequência.

À medida que o número de amostras foi limitado, foi empregue um desenho de estudo de duas etapas. Na primeira fase, foram examinados 62 pacientes que estavam apenas em Capecitabina, uma pró-droga de 5-FU, para identificar SNPs interessantes que estão marginalmente associadas com a resposta à droga como medido por redução do tumor. Estes SNPs foram então examinados num outro grupo de 27 pacientes que foram tratados com 5-FU e oxaliplatina. Combinada multivariada e análise de desmoronamento (CMC) foi utilizado para avaliar a menos comum (≤5%), pfSNPs não-específico-responder por sua associação com a resposta de drogas 5-FU, enquanto um modelo de regressão logística multivariada com base usando gradual Akaike Critério de Informação (stepAIC ) procedimento foi usado para interrogar os outros pfSNPs para sua associação com 5-FU resposta à droga em pacientes que não carregam as pfSNPs não-específico-responder.

Materiais e Métodos

as amostras dos pacientes e parâmetros clínicos

o encolhimento do fígado tumor metastático CRC foi usado como o desfecho clínico para medir a eficácia do tratamento. Critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) [22] é usado para determinar a resposta do tumor. Nos pacientes recrutados, não havia nenhum paciente pertencente à categoria ‘Resposta Completa’. Os pacientes com “resposta parcial” foram considerados como “respondedores” e pacientes com ‘Doença Progressiva “ou” doença estável “foram classificados como” não-respondedores’ na análise de associação.

Um total de 89 metastático chinesa não relacionado pacientes com CCR foram recrutados. Todos os pacientes tinham metástases no fígado e receberam quimioterapia neo-adjuvante antes da operação para a lesão do fígado. A Tabela 1 mostra as características dos pacientes em cada estudo.

No grupo 1, 62 pacientes chineses Stage IV CRC não relacionados foram recrutados. Esses pacientes foram tratados apenas com capecitabina e eles nunca foram previamente expostos a esta droga. Destes 62 pacientes, 13 tiveram resposta parcial, 31 tinham doença estável, e 18 tinham doença progressiva. Assim, a taxa de resposta deste grupo de pacientes é de apenas ~21%, o que é típico para o tratamento com um único agente [23]. ~79% Dos pacientes eram do sexo masculino, ea idade média da coorte foi de 60 anos.

No grupo 2, 27 de fígado chinês pacientes com CCR metastático não relacionados que foram tratados com 5-FU (a poucos tinham Capecitabina) sozinho (alguns) ou com o regime de oxaliplatina (mais) como a quimioterapia neo- adjuvante foram examinados. Alguns destes pacientes também tinha sido previamente expostos a estes fármacos. Destes 27 pacientes, 12 tiveram resposta parcial, sete tiveram a doença estável, e oito tiveram a doença progressiva. Assim, a taxa de resposta foi de -45%, o que é típico para os pacientes submetidos a terapia de combinação de 2-drogas [24]. Dois terços desses pacientes são do sexo masculino e tinham uma idade média de 62 anos

Ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo SingHealth centralizado Institutional Review Board (CIRB) (Referência. No: NC05-22 e 2005/421 /B).

Seleção de SNPs potencialmente funcionais (pfSNPs) para estudo de associação

O recurso pfSNP (https://pfs.nus.edu.sg/) [21], foi empregue para identificar SNPs em genes associados com 5-FU /Capecitabina, oxaliplatina, bem como o cancro colo-rectal. Aproximadamente 2800 pfSNPs em 214 genes foram encontrados para ser associado com palavras-chave incluindo “fluorouracilo”, “5-fluorouracilo”, “capecitabina”, “platina”, “oxaliplatina”, bem como “cancro colorrectal”. Como apenas 1.536 SNPs podem ser genotipados dentro de um único personalizado GoldenGate Genotipagem Array (Illumina, Inc), os seguintes critérios foram utilizados para selecionar um subconjunto destes 2800 pfSNPs: todos os SNPs no promotor, codificação, 5 ‘/3’ un-traduzida regiões que tem um Índice de GoldenGate (GGS: medida da qualidade do ensaio por sua plataforma) superior a 0,5 foram selecionados. Para os íntrons, pfSNP com GGS 0,7 foram selecionados e aqueles monomórficas relatados na população HapMap CHB foram excluídos, exceto aqueles previamente relatado como funcional. Para qualquer SNPs adjacentes que podem interferir uns com os outros no ensaio, foi selecionado o SNP de acordo com a seguinte ordem: “Anteriormente relataram → não sinónima → Sinônimo → UTR → Intron”. Uma lista de todos os SNPs incluídos na matriz GoldenGate está disponível como Tabela S1.

Entre os marcadores que eram inadequadas para serem genotipados por ensaio GoldenGate, 14 marcadores importantes em 5-FU predição de resposta foram escolhidos para ser genotipados por outros métodos (listadas na Tabela S2). Os 14 marcadores incluem o VNTR anteriormente bem estudada com SNP incorporado [25], bem como o 6bps 3 ‘UTR do gene indel em Tyms porque a tecnologia GoldenGate só poderia genotipar SNPs. Outros marcadores são SNPs com baixas pontuações GoldenGate nos genes Tyms, Tymp e DPYD. Um painel MassARRAY da Sequenom personalizado foi utilizada para genotipagem 11 dos 14 marcadores e 1 SNP foi genotipados pela ABI TaqMan. Além disso, foi desenvolvido um novo método para a genotipagem do VNTR (rs2853542) e incorporados SNP (rs34743033) no gene Tyms. Este VNTR pode ter 2 ou 3 repetições, e o SNP pode ocorrer em ambos os segundo e terceiro repetição [26]. Foi desenvolvido um método robusto usando Sanger A sequenciação para este propósito. Um fragmento de 486 pb foi amplificado utilizando os iniciadores (F- CTGCTGGCTTAGAGAAGGCG e R- AGCGGAGGATGTGTTGGATC) e o fragmento amplificado foi sequenciado em ambas as direcções usando o iniciadores directo e inverso. Diferentes genótipos renderia padrões distintos na frente e lê sequenciação reversa (como mostrado na Figura S1), permitindo que o genótipo ser facilmente deduzido.

Em resumo, foram 1.536 marcadores (listados na Tabela S1) com genotipados uma única matriz personalizado genotipagem Illumina GoldenGate SNP, 11 (listados na Tabela S2) por MassARRAY da Sequenom, 1 (rs11479) pela ABI TaqMan e do VNTR (rs2853542), com o SNP incorporado (rs34743033) foi genotipados usando Sanger Sequencing.

a distribuição dos SNPs e genes selecionados em três categorias (CRC, fluorouracilo e platina relacionados) está representado na Figura S2. Mais de metade dos SNPs (863) são de genes relacionados-fluorouracilo e 702 SNPs são a partir de genes relacionada com a platina. Uma parte considerável dos SNPs (656) são de genes relacionados com a CRC, embora 40% (32 de 80) destes genes e 88% (579 de 656) dos SNPs estão relacionadas com f luorouracilo e /ou platina, assim .

Os números de SNPs em cada categoria região do gene e função abordados neste estudo são mostradas na Figura S3. Cada uma das quatro regiões de genes, ou seja, o promotor, que codifica, intrão e 3 ‘UTR, uma cobertura adequada em geral. Para promotor e 3 ‘UTR, a maioria dos SNPs genotipados são aquelas que mudam TF locais de ligação. Na região de codificação, SNPs que mudam locais ESE /ESS são os SNPs mais abundantes, e não-sinônimas que causam efeitos deletérios são o segundo mais abundante. Os SNPs da região do intrão é enriquecida com aqueles com uma assinatura de selecção positiva recente.

A distribuição de SNP menor frequência alélica para o intrónica contra região intrónica não é mostrado na Tabela S3. Para a codificação, 3’UTR, e regiões promotoras, um número de SNPs genotipados não previamente por HapMap foi genotipados no presente estudo. Como o estudo pretende também explorar variantes raras, uma série de SNPs relatados por HapMap ser monomorphic também foi genotipados. Para a região do intrão, uma vez que a maioria dos SNPs são aqueles com uma assinatura de selecção positiva recente, têm MAF mais do que 5%. Nós não genótipo muitos outros monomórficas dentro íntrons.

análise de associação marcador Individual

Hardy-Weinberg e freqüência do alelo menor foram analisados ​​utilizando o SNP Calculator Estatísticas baseado em Excel Microsoft desenvolvido in-house. análise de associação de um único marcador foi realizada utilizando Plink [27]. O P-valor foi calculado pelo método baseado em permutação, ea Odds Ratio (OR) e correspondente intervalo de confiança de 95% foram determinadas usando associação baseada alelo análises regulares, porque o método baseado em permutação não fornecer tais informações. O genótipo da VNTR (rs2853542) e incorporados SNP (rs34743033) no gene Tyms é re-codificado como um SNP bi-alélico compreendendo o alelo de alta expressão e o alelo de baixa expressão de acordo com Kawakami et al [26].

Combinada multivariada e de desmoronamento (CMC) análises para SNPs não-específico-responder

Combinada multivariada e método de desmoronamento (CMC) foi proposto pela primeira vez como um método de análise de SNPs raros [28]. CMC utiliza de Hotelling T

2 de teste para analisar mais de 2 grupos de variantes colapsados. Quando apenas dois grupos de tais variantes são analisados, teste exacto de Fisher pode ser usado. Neste estudo, foi utilizado o teste exato de Fisher para avaliar se o alelo menor colapso de SNPs específicos não responderam que são menos comuns (≤5% menor freqüência do alelo) seria um bom indicador da capacidade de resposta ao 5-FU.

modelo de regressão logística multivariada com base usando o procedimento de informação de Akaike Critério (stepAIC) para prever a resposta da droga em pacientes que não têm SNPs não-específico-responder

os pacientes, que não têm qualquer um dos não-respondedor SNPs específicos, foram divididos em 2 grupos. Os dados do primeiro grupo que compreende 80% dos pacientes foi usada para formar uma regressão com base modelo multivariado logístico usando Critério de Informação de Akaike (AIC) em um algoritmo de passo a passo (usando o pacote de R “stepAIC”), enquanto os dados do outro 20% dos pacientes foram utilizados para validar o modelo. O modelo selecionado foi avaliado pela área sob a curva (AUC) da característica (ROC) Receiver Operating. O ponto de corte ideal para a regressão logística foi escolhido caso o montante máximo de sensibilidade e especificidade é obtida [29], [30].

Resultados e Discussão

Uma concordância alta (R

2 = 0,9494) foi observada entre as freqüências alélicas de SNPs em nosso estudo e os do CHB (chinês em Pequim) população em HapMap (liberação de 27) (Figura S4) afirmando a qualidade do nosso genotipagem. Uma grande proporção dos SNPs examinadas neste estudo eram ou monomorphic (36%) ou tinham uma alta menor freqüência do alelo (MAF≥0.1, 46%) (Figura S5). Setenta e dois e 66 SNPs nos Grupos 1 e 2, respectivamente, foram encontrados para se afastam significativamente Hardy-Weinberg e foram excluídos da análise posterior.

O genótipo foi com sucesso (97-100%) atribuído em 9 de 11 SNPs genotipados utilizando o MassARRAY da Sequenom. Sanger de sequenciação atribuído com êxito genótipo dos SNPs 2 para todas as amostras, enquanto ensaio TaqMan atribuído com êxito genótipos de 96% das amostras. Todos os SNPs genotipados com sucesso por estes métodos foram encontrados para estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Análise única associação SNP identificados três não responderam SNPs específicas no gene umps que pode representar potencial biomarcador preditivo de não-resposta a 5-FU

Como o número de amostras neste estudo foi pequeno, foi empregada uma abordagem de validação cruzada em que as amostras foram separados em 2 grupos distintos para a descoberta e validação para aumentar a robustez de nossas descobertas.

Um total de 36 SNPs em 12 genes foram encontradas associadas com a resposta à droga antes da correcção de testes múltiplos em pacientes do Grupo 1 (Tabela 2). À medida que o tamanho da amostra foi pequeno (n = 62), nenhum desses marcadores foram estatisticamente significativas após a correção de Bonferroni.

No entanto, havia 68 pfSNPs de baixa frequência no Grupo 1 que foram encontrados exclusivamente apenas em não -responders (pfSNP não-específico-respondedor). Para avaliar se algum desses pfSNPs não-específico-respondedor pode representar potencial biomarcador preditivo de não-resposta ao 5-FU, examinamos um segundo grupo de 27 pacientes. Destes 68 pfSNPs específicos não-respondedores, 24 permaneceu não-específica-respondedor ainda no Grupo 2 e estes são apresentados na Tabela 3. No entanto, apenas 3 dos SNPs não-específica no-respondedor (umps) gene uridina monofosfato sintetase nomeadamente rs2291078 (e /4 /T1050A C350 *), rs3772809 (e /6 /H446Y A1336G) e rs3772810 (E6 /3UTR /A28G) (Tabela 2, os SNPs 42-44) (Tabela 3, os SNPs 03/01) foram encontrados -se estatisticamente significativa (p = 0,036 teste antes da correcção múltipla) no Grupo 2. Quando os 2 grupos de pacientes foram combinados e analisados, estes SNPs 3 manteve-se estatisticamente significativo (p = 0,032 teste múltiplo antes da correcção). A observação de que, de um total de 89 pacientes no grupo combinado, não há respondedores foram encontradas para realizar este alelo sugere que este alelo pode ser um alelo “causal” para determinar a resposta ao 5-FU. Os dados significativos não estatísticos obtidos (após a correcção de testes múltiplos) sugere que este pode não ser o único alelos “causais” para uma resposta de 5-FU e há provavelmente outros alelos que também desempenham um papel na resposta de 5-FU, sugerindo “heterogeneidade de locus “de resposta ao 5-FU.

o gene umps é importante na determinação da resposta de 5-FU, uma vez que converte 5-FU no seu metabolito activo, FUMP, que pode participar tanto na toxicidade celular pathway, bem como na via de “anti-metabolito”. Na via de toxicidade celular, FUMP pode ser adicionalmente convertido no FUTP e FdUTP que é então incorporada no ARN e de ADN, respectivamente. Na via de “anti-metabolito”, FUMP pode ser convertido em FdUMP e inibe Tyms.

3 Estes alelos no gene umps estão em desequilíbrio perfeito de ligação (LD) e, consequentemente, irá ocorrer em conjunto todo o tempo. As funções moleculares previstos dos três alelos únicos para os não-respondedores são todos associados com a interrupção da função do gene umps e apoiar a sua presença única nos não-respondedores (Figura 1).

A um alelo de rs2291078 (umps E /4 /T1050A C350 *) foi previsto para criar um codão de paragem no exão 4 do ARNm umps. umps ARNm contendo este codão de terminação pode ser rapidamente degradado desde codão de paragem aparecendo mais de 50 pb a partir da última junção exão-exão induziria não-sentido decaimento do mRNA mediada [31]. Portanto, pacientes portadores desse alelo podem ter menor mRNA e proteína umps abundância.

O co-ocorrência de rs3772810 3’UTR pfSNP (umps E6 /3UTR /A28G) com este rs2291078 pfSNP sugere que a expressão desta gene pode ser ainda mais atenuado. O alelo G das rs3772810 3’UTR SNP (umps E6 /3UTR /A28G) está prevista para criar sítios de ligação para 23-miRNA, 23b e 130 *. A 23a miRNA é mostrado para ser regulada para cima sob condição hipóxica comumente encontrados em tumores [32]. Notavelmente, uma publicação recente relatou que miRNA 23a é regulado para cima em câncer colorretal metastático [33] sugerindo que os pacientes com o alelo G pode ser não-responsivos a 5-FU desde miRNA 23a pode suprimir a expressão de mRNA umps contendo o alelo G .

Também co-ocorrendo com estes 2 pfSNPs, é o não-sinônimas rs3772809 pfSNP (umps E /6 /A1336G H446Y), que têm o potencial de alterar a função do gene umps. Assim, estes 3 pfSNPs co-ocorrência, que responderam por 17,2% de todos os não-respondedores têm o potencial de ser as variantes causais que afetam a função de umps e, assim, resposta ao 5-FU, embora experimentos adicionais são necessários para validar a funcionalidade potencial destes pfSNPs.

Combinada multivariada e de desmoronamento (CMC) As análises revelaram que um mínimo de pfSNPs específicas quatro não responderam que não estão em equilíbrio de ligação pode distinguir de forma significativa não-respondedores de respondedores

procedeu-se determinar se a combinação dos pfSNPs específicos não responderam (Tabela 3) pode contribuir para uma maior percentagem de 5-FU não-respondedores do que os acima mencionados 3 não responderam pfSNPs umps específicas em perfeita LD que mostram significância estatística (antes de múltiplas correções de teste ). Uma vez que os três não responderam umps pfSNPs específicas estão em perfeita LD, apenas um foi selecionado para análises posteriores. Em seguida, identificar o número mínimo de pfSNPs específicos não responderam adicionais da Tabela 3 que pode explicar a percentagem máxima de 5-FU não-respondedores e empregou multivariada Combinada e desmoronamento (CMC) analisa [28] para determinar a significância estatística.

Notavelmente, outros três pfSNPs específicos não-respondedor em conjunto com qualquer um dos pfSNPs específicos não-respondedores umps foram encontrados para contabilizar 37,5% de todos os não-respondedores a partir dos 2 grupos de pacientes (Tabela 4). As análises CMC revelou significância estatística (P = 0,0003) destes pfSNPs 4 não responderam específicos (3 não umps mais qualquer um dos 3 umps pfSNPs), sugerindo associação significativa dessas pfSNPs com não-resposta.

rs3218592 SNP provoca uma alteração de aminoácidos não conservativa no gene REV3L que codifica a sub-unidade catalítica de polimerase de ADN Zeta. ADN Polimerase zeta foi relatado para ser significativamente regulada negativamente em cancro colo-rectal humano [34] e foi sugerido para ser um supressor tumoral [35]. O alelo T do rs3218592 (E /26 /C8285T, R2762Q) que se encontra exclusivamente em não-respondedor no nosso estudo está previsto para ser prejudicial para a função da proteína por ambos Polyphen [36] e peneirar [37]. Nós supomos que, portanto, os pacientes portadores deste alelo deletério teria doença mais agressivo e, portanto, são mais prováveis ​​de ser não-responsivo ao tratamento.

pfSNP (rs8071253) reside na região promotora de TK1 e está previsto para criar um xenobióticos-stress activado sítio de ligação TGA1a transcrição.

o terceiro SNP (rs501415) reside dentro o primeiro intron de WDR7 e está previsto para interromper AML1 (RUNX) local ligamento fator de transcrição. Uma vez que toda a família partilham RUNX o mesmo local de ligação (TGT /CCGT) [19], postulamos que este SNP pode também afectar a ligação de RUNX3. RUNX3 foi saudado como um gene supressor de tumor e reduziu a expressão de RUNX3 foi previamente associados com pior sobrevida em pacientes com câncer colorretal [38]. No entanto, o papel da resistência WDR7 em 5-FU permaneceram obscuros. Foi relatado para ser associado com 5-FU por PharmGKB [39], mas a publicação [39] foi recentemente retraída [40].

O modelo multivariado à base de regressão logística identificou um adicional de 5 pfSNPs que não são não –responder específica que pode distinguir de respondedores não-respondedores

Além das pfSNPs específicos não-respondedores que estão associadas com os pacientes que não respondem ao 5-FU, procedeu-se a identificar pfSNPs adicionais que podem ser associado com 5-FU resposta à droga através da formação de um modelo multivariada baseados em regressão logística com o método stepAIC usando dados de outros pfSNPs. O modelo de regressão logística identificou 5 pfSNPs adicionais, nomeadamente, rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q), rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A, E589K), rs17431184 (PTEN, I /7 /T-400C), rs2236722 (CYP19A1, e /2 /A115G, W39R) e rs17160359 (ABCB1, 5UR //L-4254T) (Tabela 5) que podem distinguir respondedores de não-respondedores. A AUC (Área Sob a Curva) para ROC (Receiver Operating Characteristic) curva destes cinco SNPs é 0,875 (Figura 2). Um valor previsto de 0,794 foi identificado como sendo o ponto de corte óptima para prever a resposta ao fármaco, com sensibilidade de 62,5% e especificidade de 100%. Com este limiar, o modelo multivariada baseada em logística pode identificar corretamente 39,1% (25/64) dos não-respondedores. Juntamente com os 37,5% dos não-respondedores previstos pelas SNPs não-específica-respondedor, um total de 76,6% (49/64) dos não-respondedores podem ser correctamente identificado por ambos os modelos.

A AUC do a curva ROC é 0,875. O ponto de montante máximo de sensibilidade e especificidade é realçada pelo círculo verde na curva ROC. A sensibilidade e especificidade correspondente é de 62,5% e 100%, respectivamente.

É digno de nota que o SNPs no modelo multivariado estão localizados principalmente dentro gene supressor de tumor (PTEN) ou em genes que são principalmente associado com câncer colorretal (DLG5, EXO1, CYP19A1 e ABCB1) (Tabela 5). Notavelmente, um dos não-específica-respondedor SNP (rs3218592, REV3L E /26 /C8285T, R2762Q) (Tabela 4) residente no gene, Rev3L, também tem sido implicado como sendo um gene supressor de tumores [41].

a PTEN (fosfatase e homólogo tensina) o gene é um gene supressor de tumores bem conhecido, que foi recentemente relatado para controlar a reparação do ADN e sensibilidade ao stress genotóxico [42]. A maior freqüência do alelo C nos respondedores (26% nos respondedores vs. 12% no não-respondedores) sugere que os doentes com este alelo podem apresentar menor tolerância ao estresse genotóxico causadas por agentes que danificam o DNA como o 5-FU.

o DLG5 (discos de grande homólogo 5) gene codifica um membro da família associada à membrana da guanilato-quinase (MAGUK) de proteínas de andaime, que está envolvido na manutenção da integridade do epitélio [43]. O alelo T do rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q) faz com que uma mudança não conservada de aminoácidos na vizinhança de um dos domínios PDZ nesse gene (aa 1391-1472; Prosite marcar 13,531). Esta variante foi postulada para prejudicar as funções de andaimes DLG5 [44] e melhorar a permeabilidade intestinal mediada por junção apertado [45]. Este polimorfismo também tem sido associada a um risco aumentado de doença inflamatória intestinal [45], que pode conduzir a um risco aumentado de cancro colorrectal [46]. Desde melhorada a permeabilidade do intestino foi relatado para levar a uma maior absorção de 5-FU em ratos [47], os autores sugerem que o alelo T levaria a uma melhor absorção de drogas e, assim, uma melhor resposta. Consistente com nossa hipótese, mais respondedores têm o alelo T (MAF de 34% em resposta vs 17% em não-respondedor) neste estudo.

O EXO1 (exonuclease 1) gene tem sido implicada como desempenhando papéis em replicação de ADN, a recombinação, reparação, a integridade dos telómeros [48], bem como danos de sinalização decisões [49]. O alelo de rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A ou E /13 /G1765A, E589K) faz com que uma mudança de ácido não-conservada amino e está previsto para residir dentro de uma região que é altamente conservada entre o XP-G ADN /RAD2 reparação Família Endonuclease (HMMPanther PTHR11081). Nas análises de Kin-coorte, o alelo A foi associado com maior risco de câncer colorretal em uma população do Reino Unido [50]. Este SNP também tem sido associada a um risco mais elevado para vários outros cancros na população chinesa [51] – [57]. Nós supomos que o aumento do risco de cancro associado com esta SNP poderia ser devido a reparação menos eficiente de danos no ADN em indivíduos portadores do alelo A-. Tal como os metabolitos de 5-FU é incorporado no ADN danificar o DNA do hospedeiro, os mecanismos de reparação ineficientes de indivíduos portadores do alelo de A-este SNP pode resultar numa maior morte celular, por conseguinte, aumentar a eficácia do tratamento com 5-FU. Isto é consistente com nossas observações de que uma maior percentagem de respondedores carrega o A-alelo deste SNP em comparação com não-respondedores (30% versus 16%).

CYP19A1 (citocromo P450, família 19, subfamília A, polipeptídeo 1) ou aromatase é um membro da superfamília de enzimas do citocromo P450 e desempenha um papel importante no metabolismo dos estrogénios. O estrogênio tem sido associada a um menor risco de cancro colorectal [58] – [60]. Embora vários SNPs no gene CYP19A1 tinha sido relatada a ser associada com o risco para o cancro colo-rectal em uma população caucasiana [61], SNP rs2236722 (E /2 /A115G ou E /3 /A115G, W39R) não foi examinado em que estudo quanto é monomorphic na população HapMap CEU. No entanto, este SNP (rs2236722), que ocorre com uma frequência de 3,3% da população HapMap CHB e 9,5% em nosso estudo, provoca uma mudança aminoácido não conservada a partir de triptofano hidrofóbica para arginina cobrado no domínio da família CYP_P450 e é previsto pela Polyphen [36] para ser uma alteração prejudicial. Por isso, é possível que esta alteração prejudicial na CYP19A1 pode levar a níveis mais baixos de estrogénio levando a um maior risco de cancro colorrectal.