Abstract
Fundo
diagnósticos confiáveis rápidas de mutações no DNA são altamente desejáveis em ensaios de pesquisa e clínicos . desenvolvimento atual nesse campo vai simultaneamente em duas direções: 1) métodos de alto rendimento, e 2) Ensaios portáteis. Abordagens não-enzimáticas são atraentes para os dois tipos de métodos, uma vez que iria permitir a detecção rápida e relativamente barato de ácidos nucleicos. microscopia de fluorescência moderna está a ter um enorme impacto sobre a detecção de biomoléculas no anteriormente inatingíveis resolução. No entanto, há métodos simples para detectar DNA de uma maneira não-enzimática utilizando microscopia de fluorescência e análogos de ácidos nucleicos têm sido propostas até agora.
Métodos e Resultados
Aqui nós relatamos uma nova enzima livre aproximar a detecção eficaz mutações cancerígenas. Este ensaio inclui enriquecimento específico para o gene alvo seguido de hibridação para os oligonucleótidos que contêm os ácidos nucleicos bloqueados (LNA) e, finalmente, a detecção por microscopia de fluorescência. O LNA contendo sondas exibem elevada afinidade de ligação e especificidade para as mutações no DNA que contém, o que permite a detecção de mutação com uma abundância intercalante EvaGreen corante. Utilizou-se uma segunda sonda, o que aumenta o número total de pares de bases a fim de produzir um sinal de fluorescência mais elevado mediante a incorporação de mais moléculas de corante. Na verdade nós mostramos aqui que o uso de corantes e LNA sondas EvaGreen, DNA genômico contendo
BRAF V600E
mutação poderiam ser detectados por microscopia de fluorescência em baixas concentrações fentomolar. Notavelmente, este era pelo menos 1000 vezes acima do limite de detecção potencial.
Conclusão
No geral, o ensaio romance descrevemos poderia tornar-se uma nova abordagem para diagnóstico rápido, confiável e livre de enzimas de câncer ou outros alvos de ADN associados. Importante, estequiometria de alvos de tipo selvagem e mutante é conservada no nosso ensaio, o que permite uma estimativa exacta de abundância mutante quando o requisito do limite de detecção é satisfeita. Usando microscopia de fluorescência, esta abordagem apresenta a oportunidade de detectar o DNA com resolução única molécula e directamente na amostra biológica de escolha
Citation:. Miotke L, Maity A, Ji H, J Brewer, Astakhova K (2015 ) enzima livre de detecção de mutações no DNA sintético cancro utilizando sondas de oligonucleótido e microscopia de fluorescência. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10.1371 /journal.pone.0136720
editor: Thomas Abraham, Pennsylvania State Hershey College of Medicine, United States |
Recebido: 19 de maio de 2015; Aceito: 07 de agosto de 2015; Publicação: 27 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Miotke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte Informações
financiamento:. a Fundação Augustinus (. Grant No. 95 305 73949; https://www.augustinusfonden.dk/) é reconhecido por AM financiamento e KA (reagentes para a síntese da sonda LNA e a microscopia de fluorescência, desenvolvimento do ensaio e análise de dados). Os autores também reconhecem que HJ e LM foram apoiados por uma Research Scholar Grant, RSG-13-297-01-TBG da American Cancer Society (https://www.cancer.org/). HJ recebeu apoio adicional da Doris Duke Foundation Clínica Clínica Scientist Award Desenvolvimento (https://www.ddcf.org/programs/medical-research/goals-and-strategies/build-the-clinical-research-career-ladder/clinical-scientist-development-award/) e um Howard Hughes Medical Institute Início de Carreira Grant (https://www.hhmi.org/). Os autores reconhecem também o apoio de Institutos Nacionais de Saúde HG000205 P01 (HJ; https://www.nih.gov/~~number=plural). As doações da American Cancer Society e Institutos Nacionais de Saúde apoiou projeto das sondas, genômica pré-enriquecimento, o trabalho de linha de células cancerosas e análise de dados
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e as variantes (SNVS) são a principal fonte de variação genética no genoma humano e de outras espécies [1]. Portanto, a detecção confiável de SNPs e SNVS é uma importante ferramenta de investigação clínica e de translação. Algumas das muitas aplicações incluem análise fármaco-resistência nos genomas virais e alterações de DNA somática câncer associado [2]. Um gene de cancro humano, em particular,
BRAF
ou v-Raf do sarcoma murino de oncogene viral homólogo B, codifica a proteína B-Raf [3]. Mais formalmente conhecido como serina /treonina-proteína-quinase B-Raf, esta proteína afecta a sinalização intracelular e está envolvido em dirigir o crescimento das células [3]. Mutações em
BRAF
têm sido implicadas em alguns cancros humanos, particularmente o melanoma [4]. Aliás, vários medicamentos foram desenvolvidos que tratar câncer impulsionado por
BRAF
, dois dos quais, vemurafenib e dabrafenib, estão agora aprovado pela FDA para o tratamento de melanoma em estágio final [5,6]. métodos de detecção atuais de mutações no
BRAF
submete amostras de biópsia de PCR e /ou sequenciamento. Uma abordagem menos invasiva detecta
BRAF
mutações diretamente na circulação de DNA tumoral (ctDNA) obtidos a partir de plasma do paciente [7]. No entanto, uma vez que ctDNA estão presentes em concentrações muito baixas (100-300 moléculas de analito por 100 mL), as técnicas de detecção altamente sensíveis e específicos devem ser aplicados [8].
De um modo geral, o desenvolvimento no campo de SNP /SNV diagnóstico vai simultaneamente em duas direções: 1) métodos de alto rendimento, e 2), ensaios fáceis de manusear portáteis [8,9]. sequenciamento de alto rendimento e reação de cadeia de polimerase (PCR) são métodos atuais de escolha para a investigação sobre o cancro e as doenças infecciosas nos países desenvolvidos [9]. técnicas mais disponíveis para uma rápida diagnóstico point-of-care, na ausência de sequenciação e PCR são atraentes. Além disso, todas as técnicas de alto rendimento desenvolvidos até à data aplicar enzimas, a fim de conseguir a sensibilidade e a especificidade de detecção [9] requerida. Enzimas aumentar o risco de erros durante a análise e afecta a estequiometria da mutação alvo no que diz respeito ao tipo selvagem análogo [10]. Assim, todos os métodos de detecção e quantificação de ácidos nucleicos se beneficiariam de estratégias livre de enzimas alternativas [9,10].
Um ideal, fácil de lidar com diagnóstico de SNP /SNV é um ensaio simples e robusta com mínima passos, alta sensibilidade e repetibilidade a baixo custo [9]. Com estes objectivos em mente, um suporte sólido ou no sistema de solução usando métodos ópticos e eletroquímicos é ideal [11]. A fluorescência é um método de detecção óptica conveniente que é amplamente aplicada em ambos os ensaios de diagnóstico modernos state-of-the-art e portáteis [9]. Em particular, os recentes desenvolvimentos na microscopia fluorescente está a ter um enorme impacto sobre a detecção de biomoléculas
in vitro Comprar e
in vivo
[12,13]. técnicas de microscópio fizeram anteriormente inatingíveis de detecção única molécula disponível. Isso fornece uma oportunidade para evitar enzimas ao detectar biomoléculas
in vitro
e uma oportunidade de monitorar as metas
in vivo
[9-13].
Para detectar SNP /SNVS em concentrações muito baixas, sondas extremamente específicas e sensíveis têm de ser aplicadas. Uma abordagem é colocar ácidos nucleicos bloqueados (LNA) com fluoróforos ligados diretamente em oligonucleotídeos curtos [14]. Estes tipos de sondas de captura de LNA /ADN são actualmente aplicado em genotipagem enzimática de SNPs num formato de micro-arranjo e técnicas baseadas em PCR [15]. Recentemente lançamos fluorescente etiquetado derivados de LNA como uma ferramenta promissora na genotipagem avançada, por exemplo, testes de resistência aos medicamentos de altamente polimórficos HIV-1 protease [16]. No entanto, a síntese de sondas marcadas por fluorescência é mais cara e trabalhosa do que é necessário para aplicações de ponto-de-cuidados. Um design sonda mais simples poderia aplicar-se as propriedades de hibridação altamente eficientes de oligonucleidos de LNA /ADN em conjunto com um corante fluorescente intercalante robusto tal como EvaGreen. Durante a última década corantes intercalantes têm sido aplicados com sucesso em técnicas enzimáticas para a detecção de ácido nucleico [2-5]. Neste trabalho optamos EvaGreen corante por causa do contraste demonstrada entre o sinal luminoso que se desprende quando ligado ao DNA de cadeia dupla e o sinal de fluorescência extinta com amostras de cadeia simples [17].
Aqui, nós descrevemos um novo ensaio para a detecção livre de enzima rápida de
BRAF V600E
mutação (T → a na posição gene 1799) no DNA humano (Fig 1). Inicialmente enriquecer o ADN alvo usando uma sonda de enriquecimento 120mer gene específico, seguido por detecção de fluorescência com o corante EvaGreen e uma segunda mutação específica, a sonda de captura mais curtas LNA /ADN. Ao utilizar diluições em série de mutantes /misturas de ADN da linha celular de tipo selvagem, foi demonstrado que este ensaio de novo é altamente potente para a detecção de fluorescência de um SNP clinicamente relevante em concentrações baixas e alta complexidade da amostra. Além disso, nós provar que através da aplicação de microscopia de fluorescência que pode detectar especificamente baixas concentrações femtomolar e attomolar de ADN contendo a mutação alvo
As principais etapas do ensaio de LNA /ADN:. 1) se ligar a sonda de captura específico para o gene, 2) lavagem e clivagem de apoio, 3) adição de LNA sonda de melhoria de sinal /DNA e intercalando tintura, 4) detecção de fluorescência. B = biotina, S = estreptavidina, CPG = vidro de porosidade controlada, L = LNA.
Materiais e Métodos
Geral
Os reagentes obtidos a partir de fornecedores comerciais foram utilizados conforme indicado. LNA reagentes fosforamidito e corante EvaGreen (20X em água) foram obtidos a partir de Exiqon e Biotium, respectivamente. cadeias de ADN não modificados e biotinilados foram adquiridos de IDT e utilizado após purificação por HPLC.
Os detalhes sobre a síntese de oligonucleótidos, caracterização e estudos de desnaturação térmica são dadas em S1 apêndice.
O DNA genômico
ADN genómico de linhas celulares LS411N e HT29 foram obtidos directamente do fornecedor (ATCC, catálogo Nr. CRL-2159 e HTB-38, respectivamente), e extraiu-se usando o sistema de extracção de cultura de tecidos Qiagen DNeasy acordo com as directrizes do fabricante (Qiagen). HMC-1 (controle masculino humano) foi obtido a partir de Promega [18]. O produto foi digerido durante 12 h a 37 ° C utilizando EcoRI (New England Biolabs), e precipitou-se a partir de etanol. Comprimento de fragmentos foi medida usando Agilent Bioanalyzer 7500 kit de ADN, dando um valor de aprox. 7000 bp.
Pré-enriquecimento do
BRAF
fragmento do gene.
Pré-enriquecimento de DNA genômico foi realizada utilizando kit XGEN Lockdown (IDT), 120mer
BRAF
espec�ico sonda marcada com biotina (IDT), e as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M270-, Life Technologies). A sonda 120mer foi projetado para se sobrepor ao
BRAF V600E e região (posição da mutação V600E é underlined):
5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAA
AATCACCTATTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGG-(biotin-C6)-3’
Pre-digested ADN genómico e sonda 120mer biotinilado foram incubadas durante 5 h a 60 ° C, seguido por ligação a esferas magnéticas, múltiplos passos de lavagem e desprendimento de calor, tal como sugerido pelo fornecedor (IDT, aquecimento a 92 ° C durante 10 min), como um resultado. , DNA de cadeia simples foi obtido.
ensaio de hibridização Solid-apoio.
a concentração de ADN foi calculada utilizando o peso molecular e copiar DNA Technologies vida calculadora número disponível em seu site. Assim, 50 fM de fragmentos de ADN SS (comprimento de 5000 nt) correspondeu a 3×10
6 moléculas por 100 mL, ou 1×10
6 moléculas do mesmo fragmento de ADN em 100 ul da amostra correspondia à concentração de 16,6 fM. Suporte sólido contendo sonda de captura correspondente e o ADN alvo (1 eq.) foram colocados em tubos Eppendorf de 1,5 ml contendo 100 ul de tampão 1X PBS. a mistura resultante foi aquecida durante 10 min a 85 ° C e subsequentemente arrefecida até à temperatura ambiente ao longo de 20 min. O suporte foi centrifugado a 11,000 rpm durante 10 min, e após a remoção do sobrenadante lavou-se 2 vezes com 100 ul de PBS 1X a 37 ° C. Depois corante EvaGreen (0.06-0.6X) e a sonda de aumento de sinal correspondente (4 eq.) foram hibridados com o suporte (100 uL de PBS 1X, 85 ° C, 10 minutos, seguido de arrefecimento até à TA ao longo de 20 min). sinal de fluorescência foi inicialmente analisados por meio de laboratório padrão UV-vis lâmpada. Para a análise na solução e microscopia, os oligonucleótidos foram clivados do suporte usando 32% de metilamina aquosa de amoníaco e 1: 1 (v /v) durante 4 h à TA, evaporou-se e re-hibridados em presença de EvaGreen corante, como descrito acima (0.06- 0,6x).
Fluorometria
quantidades de DNA (concentrações e número de moléculas) foram determinados utilizando UV-espectrofotometria padrão e copiar DNA Technologies vida calculadora número disponível como descrito acima. Para o recozimento, as sondas foram aquecidas durante 10 min a 85 ° C e subsequentemente arrefecida até à temperatura ambiente ao longo de 20 min. estudos de fluorometria as amostras resultantes foram realizados a 19 ° C em 1X PBS utilizando PerkinElmer LS espectrómetro de luminescência 55 equipado com um programador de temperatura de Peltier, excitação a 500 nm e emissão a gravação a 530 nm.
A microscopia de fluorescência
Os multifotônica medidas de microscopia de fluorescência de excitação foram concluídas em um costume construído microscópio multiphoton excitação [19]. Resumidamente, o objetivo utilizada foi uma objetiva de imersão 60X de água NA 1,29. O laser foi um laser de Ti: Sa (HPeMaiTai DeepSee, Spectra Physics, Mountain View, CA) e o comprimento de onda de excitação utilizado foi 840 nm. Os sinais de fluorescência foram recolhidos usando filtros de banda Bandpass 525/35 nm (AHF Analysentechnik AG, Alemanha). Os detectores foram Hamamatsu H7422P-40 PMT.
Resultados e Discussão
Inicialmente, nós projetamos sondas de captura de diferentes comprimentos (9, 11 e 18mers) contendo três LNAs em posição central dentro das sequências ( Tabela 1). De acordo com nossa concepção, uma das unidades de LNA foi cortesia ao potencial
BRAF V600E
mutação (T → A) no destino [16]. Nós investigamos a singularidade de cada sonda de captura CP1-CP3 para hibridação para a região alvo, em comparação com o genoma humano inteiro 3 bilhões pb usando no software casa disponível na Universidade de Stanford (S1 Table) [20]. Assim, as sondas e 9mer 11mer teve múltiplos locais de ligação no genoma, permitindo que zero, um ou mais erros de emparelhamento, enquanto que as sondas de 18mer (CP3) foram completamente específicos para o alvo. Como controlo negativo, utilizou-se uma sequência de DNA 9mero equivalente aplicada em nossos ensaios anteriores que não foi cortesia para o
alvo BRAF
(sonda de captura CP4) [14].
A seguir , CP1-CP4 foram preparados usando a síntese de oligonucleótidos em fase sólida automatizada sobre o vidro de poro controlado (CPG, Tabela 1). CP1-CP3 foram sintetizados como tanto de tipo selvagem (w) e mutante (m) para variantes
BRAF
1790-1800 região (isto é, contendo os nucleótidos A e T na posição oposta à base 1799, respectivamente). sondas de captura ou foram separada do CPG ou manutenção no suporte sólido após a síntese (Informação de apoio). Isso nos permitiu realizar a análise, tanto em solução e em suporte sólido como descrito abaixo.
Foram analisadas as afinidades de ligação de CP1-CP3 para totalmente complementar e incompatíveis 63 fragmentos nt BRAF em solução (
T
valores m, Tabela 1). Como esperado, LNAs posicionado internamente aumentaram as temperaturas de fusão de todas as sondas por 3,0-4,5 ° C por uma incorporação LNA. Simultaneamente especificidade alvo foi aumentada, por causa da Tm diminuiu 10,0-11,0 ° C, na presença de uma incompatibilidade. Sem duplexes foram formadas a temperaturas acima de 22 ° C para as sondas de captura 9mer CP1W, m. Isto sugere que CP1W, m sondas têm o maior potencial para discriminar uma vs. incompatíveis alvos totalmente combinados. No entanto, isto pode ser acompanhado por uma falta de especificidade no genoma humano, tal como sugerido pela nossa sonda análise singularidade (Informação de apoio). Por sua vez, as sondas de captura 18mer mostraram alta
T
valores de m para ambos os duplexes totalmente emparelhados e desemparelhados e o 11mer CP2w e CP2m tinham valores intermédios tanto (33,5 ° C-34,5 ° C, na presença de uma incompatibilidade). Finalmente, CP4 controlo negativo não apresentou ligação a sequências alvo.
tendo propriedades de hibridação estudados de sondas de captura de LNA /ADN, aplicou-se-lhes para a detecção da
BRAF V600E
mutação no genoma humano ADN (Figuras 2 e 3, Tabela 2). Determinou-se, utilizando PCR digital (dados não mostrados), que as linhas de células humanas HT29 e tinha um LS411N 25,0% e 66,7% de abundância da mutação alvo, respectivamente [18]. ADN HMC-1 foi utilizado como um controlo de tipo selvagem como 100% não possuía qualquer mutação. Em primeiro lugar, nós pré-enriqueceu o ADN utilizando um 120mer
BRAF
sonda específica marcada com estreptavidina que não se sobrepõem a região da sonda de captura e, assim, foi universal para ambos os alvos e wt mut (Fig 1 e Materiais e Métodos;). Este passo de aumento da concentração do fragmento de genoma alvo e, simultaneamente, melhora a especificidade do nosso ensaio da mesma maneira como quando está a ser aplicada antes da próxima geração de sequenciação [7-8]. Depois de várias etapas de lavagem e desprendimento das esferas magnéticas biotinilados, de cadeia simples
BRAF
fragmentos (7000 nt) foram recuperados na solução.
meta vinculativa resultados especificidade da diferença de temperatura de fusão (
T
m) entre a sonda de captura totalmente combinados e incompatíveis: complexos alvo. CPG = vidro de poro controlado
(A) Visualização de
BRAF V600E
mutação on-suporte sólido contendo sonda de captura CP2m:. CP2m: HT29 (14:05, tubo 1), CP2m : LS411N (02:05, tubo 6). Sinal é obtido em laboratório UV-vis lâmpada (excitação a 365 nm) a 19 ° C utilizando a sonda de melhoria de sinal 22:00 e corante 0,6x EvaGreen. (B) Quantificação da genômica
BRAF
alvos por fluorometria em solução. curvas de titulação alvo foram obtidos para complexos totalmente complementares e não correspondentes (azul e linhas vermelhas, respectivamente) de LNA /sondas de captura de DNA CP2w e CP2m com metas correspondentes e de melhoria de sinal da sonda P1: 5′-GCT A + GA CCA + AAA TCA CCT A AGA + TT TTT ACT GTG AG + G TCT TCA TGA + AAT AT-3 ‘. nucleotídeos LNA são marcadas com mais antes da letra correspondente.
Depois, pré-enriquecido
BRAF
alvos foram emparelhadas com as sondas de captura CP1-CP4 directamente no suporte sólido [ ,,,0],11]. Em seguida, usamos EvaGreen para detectar e quantificar o DNA de cadeia dupla. EvaGreen sinal aumenta proporcionalmente com o número de pares de bases do duplex formado [17]. Dito isto, a sonda de captura: o complexo alvo foi bastante curto (9-18 pares de bases). A fim de evitar que um sinal fraco aplicada uma sonda adicional LNA /ADN de reforço do sinal complementar à sequência apenas adjacente à sonda de captura (P1; 50 nt). Esta sonda não apresentaram propriedades de auto-dobragem e ligado tanto de tipo selvagem e mutantes universalmente objectivos (FIG 2 e S1 apêndice). sonda de reforço de sinal maior resultaria em ainda maior aumento de sinal após a ligação alvo. No entanto, LNA /sondas de ADN de comprimento 50 nt são difíceis de sintetizar e purificar. Além disso, o seu alvo propriedades de ligação têm de ser adicionalmente avaliadas para evitar sinal falso positivo devido a, por exemplo, auto-dobrável (papel em preparação)
Além disso, com o sistema de suporte sólido, fomos capazes de aproveitar o
T
diferença entre m totalmente combinados e destino incompatíveis.: pares de sondas (Tabela 1). Um simples passo de lavar roupa no
T
m do complexo incompatíveis nos permitiu eliminar a ligação da sequência incompatíveis. Finalmente, a amostra foi re-recozido na presença de P1 sonda de aumento do sinal e corante EvaGreen (Figs 1 e 2)
O suporte sólido contendo o DNA do cancro:. Sondar complexo foi visualizado utilizando uma lâmpada de UV de laboratório padrão (Figura 3 e Tabela S2). Quando a sonda de captura específica do mutante foi aplicada, a presença do alvo mutante pode ser claramente detectado a olho nu. Para mais quantificação, a amostra foi isolada a partir de CPG, re-hibridado e submetido a análise por fluorometria (Figura 3). Estimou-se a concentração do tipo selvagem e mutantes alvos no ADN do cancro por meio de uma curva de titulação. Este foi gerado com um ensaio de fluorometria em solução usando uma quantidade inicial conhecida de ADN genómico no analito (em mol e o número de moléculas), e as mesmas concentrações de reagentes como no ensaio experimental (ver Materiais e Métodos). O limite de detecção (LOD) foi calculada como sendo a menor concentração-alvo que pode ser detectada com um sinal-ruído acima de 3 [14]. Assim, estabeleceu o valor LOD de 50 ADN genómico FM utilizando fluorometria convencional (Tabela 2; ver Materiais e Métodos para obter detalhes sobre o cálculo).
Ao comparar resultados entre sondas de captura CP1-CP3, o CP2 11mer mostrou a maior discriminação das metas incompatíveis mantendo uma boa especificidade de ligação (Fig 3). Em contraste, as sondas mais longas CP3 mostrou sinal semelhante para complexos totalmente emparelhados e desemparelhados, uma vez que o duplex formado foi ainda à temperatura do ensaio (Tabela 1 e Fig S1). Usando CP2m, nós também alcançou alta precisão para a quantificação abundância do LS411N linha celular (67,2% -67,7% determinado pelo nosso ensaio vs. 66,7% determinada por PCR digital). No entanto, o mutante abundância menor no ADN HT29 foi detectado com o nosso ensaio a um nível de erro mais elevada em comparação com LS411N (desvio de ~ 8% vs ≤ 1%, respectivamente). Muito provavelmente, isso foi causado pelo sinal de emissão do alvo mutante em HT29 ser inferior a LOD fiável.
A especificidade da detecção foi confirmada pela ausência de sinal de fluorescência quando se utiliza CP2m e ADN de controlo de tipo selvagem, HMC-1 (Tabela 2). Nomeadamente, o passo de pré-enriquecimento aumentou dramaticamente a concentração de
fragmento BRAF
na amostra. Isto foi confirmado por até 10-vezes elevada de sinal não específico depois da detecção de não-enriquecido HMC-1 de DNA com a sonda CP2m (dados não mostrados). Portanto, concluiu-se que tanto o passo de pré-enriquecimento e o desenho da sonda de mutação eram essenciais para o ensaio. Estimou-se a precisão de direcionamento de um determinado
BRAF e região estar dentro de ± 1%. Tendo em conta a grande complexidade sequência de DNA genómico humano, concluiu-se que a precisão da nossa
BRAF
gene alvo utilizando sondas LNA /ADN foi muito bom [10,21].
Como aspecto final, que submetido uma série de altamente diluídas HT29 moléculas mutantes de ADN para a detecção por microscopia de fluorescência (Figura 4). Antes da análise, que pré-enriqueceu a ADN alvo, recozido para CP2m sobre um suporte sólido (CPG) e depois clivado-lo do CPG como descrito acima. Com este método o complexo de
BRAF
alvo, CP2m, P1 e EvaGreen solução corante pode ser facilmente detectado a ~ 1,5 fM concentração de ADN mutante correspondendo a ~ 1 × 10
5 moléculas por 100 uL de analito (por detalhes sobre o cálculo, ver Materiais e Métodos). O DNA: Complexo EvaGreen foi visto para formar pequenos agregados na superfície da tampa de vidro de aprox. 1 um de diâmetro. Na ausência de P1, o sinal de fluorescência foi quatro vezes mais fraca e não foi observada nenhuma fluorescência para o corante EvaGreen controlo (Fig 4 e Fig S2). Além disso, nenhum sinal foi observado usando o controlo de tipo selvagem 100% de ADN HMC-1 na mesma configuração. Para o melhor de nosso conhecimento, estes valores de LOD só foram previamente relatado para os ensaios baseados em PCR, mas não quaisquer métodos sem amplificação. Além disso, o sinal observado pode ser detectada a 1000 vezes menor do que as concentrações de ADN de 1,5 fM mesmo correspondendo a apenas 100 moléculas por 100 uL analito. Especula-se que aplicando esta técnica e o aumento do comprimento da sonda de reforço do sinal, como mencionado acima, o valor de LOD de ADN cancro poderia ser muito abaixo 01:00.
(A) o complexo de ADN com CP2m, sinal -enhancing P1 sonda e corante EvaGreen, pontos luminosos, com intensidades mais de 80 são vistos. (B) de ADN alvo re-hibridados com CP2m e EvaGreen corante na ausência de P1, pontos mais escuras são vistos com contagens de até cerca de 20. (C) EvaGreen corante em 1XX PBS (solução 0.06X), nenhum sinal é visto. As imagens foram obtidas usando dois fótons microscópio de varredura a laser (ex 535 + 35nm; a laser @ 840); a 19 ° C utilizando 1,5 fM DNA câncer e re-hibridação com sonda de melhoria de sinal 22:00 e corante 0.06X EvaGreen. As imagens foram tiradas usando as mesmas configurações do instrumento e ajustados usando o mesmo limiar de intensidade. O gráfico abaixo das imagens mostra um gráfico de linha da linha na imagem.
Comparando o nosso método para métodos de genotipagem reportados anteriormente para
BRAF
mutação e outras variações na seqüência, o ensaio desenvolvido é beneficamente de baixo custo, o tempo (12 horas vs. até 1 semana) e robustez [9,14]. Importante, sem enzimas, além de enzimas de restrição para o ADN genómico de fragmentação, são necessários para a detecção da mutação alvo [22-24]. Isso impede erros que ocorrem frequentemente com PCR ou o alinhamento dos dados de sequenciamento [3,11]. Estequiometria de alvos tipo e mutantes selvagens também está conservado em nosso ensaio, o que permite uma estimativa precisa da abundância mutante, dado que o prazo de exigência de detecção objectivo seja alcançado. Nos ensaios anteriormente relatados isto poderia ser conseguido utilizando nanoparticulas de ouro, ADNzimas ou detecção eléctrica [25-27]. Neste trabalho, melhorar a sensibilidade de detecção do alvo através da aplicação de sondas de melhoria de sinal e microscopia de laser, que apresenta a oportunidade de detectar variações na seqüência do DNA alvo em baixas concentrações directamente no soro humano [28].
resumo, descrevemos um novo ensaio que permite a rápida análise de mutações de cancro. Para conseguir a especificidade e a sensibilidade de detecção do alvo necessário, o ensaio combina diversos princípios: 1) alvo pré-enriquecimento utilizando uma sonda de comprimento, específicos do gene (120mer); 2) elevada afinidade de ligação e especificidade de sondas curtas de LNA, e 3) a detecção de ADN por microscopia de fluorescência de alta resolução. À medida que provar neste trabalho, a combinação destas técnicas permite a análise rápida de mutações no DNA do cancro, sem a necessidade de amplificação ou outras reacções enzimáticas. demonstrou com sucesso como uma prova de princípio sobre a mutação V600E no
BRAF
oncogene, este método pode ser aplicado para detectar outras mutações de significado clínico (por exemplo, codões 12 e 13 da
KRAS
gene [29]) e servir como um método simples e confiável para pesquisa, monitoramento de prognóstico ou terapêutica de amostras clínicas.
Informações de Apoio
S1 apêndice. a síntese de oligonucleótidos, caracterização e estudos de desnaturação térmica
doi:. 10.1371 /journal.pone.0136720.s001
(DOCX)
S1 Fig. . Visualização de DNA câncer no suporte sólido contendo captura sonda CP3m
(esquerda para direita) tubos 1-3: CP3m: HT29 (10.0, 5.0 e 14:05), tubos de 3-6: CP3m: LS411N (10.0, 5.0 e 2:05). Sinal é obtido sob a lâmpada UV-vis laboratório (excitação a 365 nm), a 19 ° C utilizando a sonda de melhoria de sinal 22:00 e corante 0,6x EvaGreen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0136720.s002
(TIF)
S2 Fig. imagens de fluorescência de
BRAF
fragmentos de DNA a partir de linha de células HT29.
(A) Complexo de DNA com CP2m, de reforço do sinal P1 sonda e corante EvaGreen, pontos luminosos, com intensidades mais de 80 são vistas. (B) de ADN alvo re-hibridados com CP2m e EvaGreen corante na ausência de P1, pontos mais escuras são vistos com contagens de até cerca de 20. (C) EvaGreen corante em 1X PBS (solução 0.06X), nenhum sinal é visto. (D) de controle do tipo selvagem DNA HMC-1, nenhum sinal é visto
doi:. 10.1371 /journal.pone.0136720.s003
(TIF)
S1 Table. análise singularidade de captura e sondas de reforço de sinal
doi:. 10.1371 /journal.pone.0136720.s004
(PDF)
S2 Table. análise colorimétrica de alvos modelo e DNA genômico em suporte sólido
doi:. 10.1371 /journal.pone.0136720.s005
(PDF)