Abstract
Líquenes produzir vários produtos químicos exclusivos que podem ser utilizados para fins farmacêuticos. Para triagem de metabólitos secundários romance líquen que mostram a atividade inibidora contra a motilidade celular do cancro do pulmão, testamos extractos de acetona de 13 amostras de liquens coletados no Chile. Physciosporin, isolado a partir de
Pseudocyphellaria coriacea
(Hook f . Taylor) D.J. Galloway P. James, foi identificado como sendo um composto eficaz e mostrou uma actividade inibitória significativa em ensaios de migração e invasão contra células de cancro do pulmão humano. tratamento Physciosporin reduzida ambos os níveis de proteína e mRNA de N-caderina com decréscimos concomitantes nos níveis de marcadores de transição epitelial-mesenquimal, como caracol e torção. Physciosporin também suprimiu KITENIN (KAI1 C-terminal de tetraspanina interagindo) mediada por AP-1 na actividade tanto na ausência e na presença de estimulação factor de crescimento epidérmico. A análise quantitativa por PCR em tempo real mostraram que a expressão do gene supressor de metástase, KAI1, foi aumentada ao mesmo tempo que o gene de metástases potenciador, KITENIN, foi drasticamente diminuída por physciosporin. Particularmente, a actividade da região 3 ‘não traduzida de KITENIN foi diminuída por physciosporin. Além disso, as atividades de Cdc42 e Rac1 foram diminuiu physciosporin. Estes resultados demonstraram que o líquen metabólito secundário, physciosporin, inibe a motilidade celular câncer de pulmão através de novos mecanismos de ação
Citation:. Yang Y, Parque SY, Nguyen TT, Yu YH, Nguyen TV, Sun EG, et al . (2015) Lichen secondary metabolite, Physciosporin, inibe a Lung Cancer motilidade celular. PLoS ONE 10 (9): e0137889. doi: 10.1371 /journal.pone.0137889
editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA
Recebido: 14 de junho de 2015; Aceito: 24 de agosto de 2015; Publicação: 15 de setembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2013R1A1A2004677, MRC-2011-0030132) e pelo Programa Korea National Centro de Recursos de Investigação ( NRF-2014M3A9B8002115). Este estudo também recebeu apoio de uma bolsa de investigação financiado pelo Centro de Pesquisa Sunchon de Medicina Natural. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
abreviações : DMSO, dimetilsulfido; EGF factor de crescimento epidérmico; HPLC, cromatografia líquida de alta eficiência; KITENIN, KAI1 C-terminal interagindo tetraspanina; RMN, ressonância magnética nuclear; PBD, domínio de ligação de p21; TLC, Fino Cromatografia de Camada
Introdução
O cancro do pulmão é o câncer mais comum ea principal causa de morte relacionada ao câncer em seres humanos em todo o mundo [1, 2]. Havia cerca de 1,8 milhões de novos casos de câncer de pulmão diagnosticados em 2012, respondendo por 12,9% do total de casos de câncer [1, 2]. Devido à falta de um tratamento eficaz para a doença avançada, o prognóstico de cancro do pulmão é ainda pobre, com menos do que 15% sobrevivem 5 anos após o diagnóstico [3]. Quando o câncer de pulmão é diagnosticado em apresentação com sintomas, ele carrega um extremamente mau prognóstico, com uma sobrevida global em 5 anos de 16% nos EUA e menos de 10% no Reino Unido [4]. No cancro do pulmão, metástases é a principal causa de morte, e revelando o mecanismo de progressão tumoral e metástase é, portanto, de grande importância [5]. Nos passos iniciais da invasão local, as vias de sinalização que controlam a dinâmica do citoesqueleto de células tumorais, o volume de células-matriz e as junções célula-célula foram activadas [6]. Portanto, o desenvolvimento de novos agentes químicos que inibem a migração de células de cancro e invasão por segmentação do sinal acima é necessária no tratamento de cancros avançados.
líquenes produzir diversos metabolitos secundários que mostram uma variedade de actividades biológicas, incluindo a actividade anti-cancro [7]. Até à data, cerca de mil metabólitos secundários de liquens foram descobertos e alguns destes metabolitos líquen exclusivos são eficazes contra vários
in vitro
modelos de cancro [8]. No entanto, embora os líquenes são uma fonte para o rastreio de compostos activos anti-cancro, apenas um pequeno número de compostos têm sido testados [9]. Portanto, o presente estudo examinou a atividade inibitória de 13 espécies de líquenes chilenos contra a migração e invasão capacidade das células de câncer de pulmão humanos e mais investigados os possíveis mecanismos moleculares subjacentes a sua actividade anti-metastático para identificar agentes anti-metástase potencial romance.
Materiais e Métodos
Preparação de extractos de líquen
Talos dos líquenes foram coletados a partir de Chile, em janeiro de 2009 e 2012, durante viagens de campo no Parque Nacional de Torres Del Paine, Patagonia, organizado pelo Dr. Pereira da Universidade de Talca, Talca, Chile. A autorização para recolher amostras de liquens a partir da localização foi emitida pela Administração da Corporação Nacional Florestal (CONAF) de Punta Arenas e da Administração do Parque Nacional Torres del Paine, região de Magallanes e Antártica Chilena, que faz parte do Sistema Nacional de Protegido Áreas silvestres do Estado do Chile. Os estudos de campo não envolve quaisquer espécies ameaçadas ou protegidas. As duplicatas foram depositados na Lichen coreano e Allied Bioresource Center (KOLABIC), no Instituto de Pesquisa Lichen coreano (KoLRI), Universidade Nacional Sunchon, na Coréia.
cromatografia em camada delgada (TLC) análise do material líquen
talos Lichen foram embebidas em 1 mL de acetona durante 5 minutos, em tubos de 1,5 mL PE, e a solução concentrada foi manchada sobre gel de sílica 60 F254 placas pré-revestidas (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) utilizando um microcap várias vezes. Solvente A [Tolueno: Dioxina: ácido acético 180: 45: 5 (v /v /v)], descrito no método normalizado de melhoria Culberson [10], foi usado neste estudo. A placa de TLC com amostras manchado foi carregada numa câmara de calha dupla pré-saturado com o sistema de solvente A e foi removido da câmara, quando a frente do solvente atingiu 14 centímetros a partir da linha de base inicial. Os resultados foram visualizados por exame e marcação à luz do dia (por pigmentos) e sob UV a 254 e 350 nm. Após isto, as placas foram pulverizadas com ácido sulfúrico aquoso a 10% e aqueceu-se a 110 ° C para assegurar a completa visualização. Depois de carbonização, as cores específicas de substâncias, tanto à luz do dia e sob UV (350 nm), foram anotados.
Duas espécies de líquenes
cladonioides Lethariella (Nyl
.
) Krog
(Atranorin) e
Usnea longissimi
(ácido úsnico) foram utilizados como controle padrão. Com base no método padronizado [10, 11], relativa R
valor f foi determinado para ajudar a identificar cada ponto [12].
Separação e identificação de physciosporin
Pseudocyphellaria coriacea
(CL090002) extracto foi separado por TLC como descrito acima. O local identificado como physciosporin foi raspada e eluida com acetona. O sobrenadante foi seco e pesado após centrifugação. cromatografia de ensaio (HPLC) líquida de alta resolução foi realizada para confirmar pico único dentro da amostra purificada, e, em seguida, a estrutura de physciosporin foi confirmada por ressonância magnética nuclear (RMN) análise (Figuras A e B em Ficheiro S1).
cultura celular
As células de câncer de pulmão humanos, incluindo A549, H1650 e H1975 foram utilizados neste estudo. As células foram cultivadas em RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de solução de Penicilina-Estreptomicina sob atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera a 37 ° C em uma incubadora.
ensaio de cicatrização de feridas
As células A549 foram semeadas a uma densidade de 2.5 ~ 3 × 10
5 células /poço em placas de 6 poços de cultura de tecidos (Corning, Nova Iorque, EUA) e cultivadas durante a noite até à confluência. células em monocamada foram riscados com uma ponta de pipeta estéril para criar uma ferida. As células foram então lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro para remover as células flutuantes e incubadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com FBS a 2% com 5 ug /mL de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. De fotografias de células foram retiradas a 0, 24, 48, e 72 horas após o ferimento para medir a largura da ferida. Para cada amostra, uma média de cinco ensaios de ferida foi feita para determinar a taxa média de migração. Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.
ensaio de invasão
ensaios de invasão foram realizados em câmaras de Boyden (Corning, Nova York, EUA). Os filtros de policarbonato (tamanho de poro 8 pm, Corning) pré-revestidas com gelatina a 1% foram usadas para ensaios de invasão. As células (2 x 10
6) em 120 ul de meio (RPMI 1640 contendo BSA a 0,2% dissolvida em PBS), com ou sem 5 ug /ml de extractos em bruto de liquens ou physciosporin foram semeadas na câmara superior. Em seguida, 400 ul meio com 10 ug /mL de fibronectina foi adicionada à câmara inferior para servir como um agente quimiotáctico. Após 24 h de incubação, as células na câmara superior foram fixadas com kit Diff Quik (Sysmex). Em seguida, as células ligadas na câmara superior foram removidas mecanicamente pela haste de algodão. As células aderentes ao lado inferior do filtro foram coradas e contadas sob microscópio vertical (5 campos /câmara). Cada ensaio de invasão foi repetida em três experimentos independentes.
Western blot
As células tratadas com 5 ug /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin durante 24 h foram lavadas duas vezes com PBS gelado e lisadas em tampão de lise [13]. Os anticorpos utilizados foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (N-caderina, α-tubulina) e BD Biosciences (E-caderina). Os anticorpos foram detectados com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Thermo) utilizando Kit Immobilon Ocidental Quimioluminescentes HRP Substrato (Millipore) e imagem de luminescência (Imagem Quant LAS 4000 mini). Bandas foram medidos por Multi-calibre 3.0 e a sua densidade relativa calculada a partir da densidade das bandas de a-tubulina em cada amostra. Os valores foram expressos como unidades densitométricas arbitrárias correspondentes a intensidade do sinal.
RT-PCR quantitativo
O RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) foi realizada como previamente descrito [14]. Resumidamente, o ARN total foi isolado a partir de células de cancro do pulmão humanas, utilizando RNAiso Plus (TaKaRa, Otsu, Shiga Shiga 520-2193, Japan) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total a partir de cada grupo de células tratadas foi convertido em ADNc utilizando um kit de transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e verde SYBR (Enzynomics, Seul, Coreia do Sul). Os iniciadores utilizados para PCR em tempo real foram caracol (directo) 5′-tcccgggcaatttaacaatg-3 ‘e (inverso) 5′-tgggagacacatcggtcga-3′; Torção (directo) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ‘e (inverso) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; N-caderina (directo) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ‘e (inverso) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; KAI1 (directo) 5’-gctcatgggcttgggct-3 ‘e (inverso) 5′-gagctcagtcacgatgccgc-3′; KITENIN (directo) 5’-cggaataaagacggcagagg-3 ‘e (inverso) 5′-tgctccgaggtgcctgtgat-3′; GAPDH (para a frente) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘e (reverso) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. reacções de qRT-PCR e as análises foram realizadas usando CFX (Bio-Rad, Hercules, EUA).
Repórter ensaio
Para o ensaio repórter AP-1, as células HEK293T foram transfectadas com o plasmídeo de expressão e KITENIN AP1 plasmídeo repórter. Após 12 horas da transfecção, as células foram tratadas com 5 ug /mL de extractos de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin durante 48 h com ou sem FCE e depois analisada utilizando um Dual-Luciferase® sistema de ensaio repórter (Promega, Madison, WI, EUA). O plasmídeo repórter de luciferase de Renilla (pRL-TK) foi usada como um controlo interno para a eficácia de transfecção. A actividade de repórter TOPFLASH, NF-kB e repórter STAT também foram testados no nosso estudo.
Para KITENIN ensaio de repórter, promotor KITENIN humano (-2344 a + 536) foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico de HEK293T células utilizando iniciadores concebidos a partir da sequência genómica do locus KITENIN (1p13.1). Os produtos de PCR foram digeridos com
Kpn I /
Bgl II e clonado no plasmídeo pGL3basic (Promega, Madison, WI, EUA) a montante do gene repórter da luciferase. A construção foi confirmada por sequenciação. A região 3′-KITENIN untranlated ensaio (3′-UTR) foi realizada como previamente descrito [15]. Os experimentos foram realizados em triplicado, e pelo menos três experiências independentes a partir de resultados foram incluídos na análise. Fold alterações foram calculadas usando valores normalizados para a actividade da luciferase de Renilla.
Afinidade-precipitação de GTPases celulares
As actividades Rac1 e Cdc42 celulares foram determinadas utilizando GST-RBD /PBD, como previamente descrito [16] . Resumidamente, as células foram lisadas em tampão de lise. Os lisados foram incubados com esferas de GST RBD /PBD à TA durante 1 h. As pérolas foram então lavadas quatro vezes com tampão de lavagem. As proteínas Rac1 e Cdc42 ligados foram detectados por imunotransf erência usando um anticorpo monoclonal contra Rac1 (Millipore 05-389) e Cdc42 (Santa Cruz SC-87). A actividade relativa de cada GTPase foi determinada por quantificação cada banda de GTPase ligada a GTP e a quantidade total de GTPase utilizando multi-calibre 3.0, e os valores das bandas ligada a GTP foram normalizados para que da quantidade total. Todos os resultados foram determinados utilizando três exposições diferentes de pelo menos três experiências independentes.
Resultados
extractos de acetona de líquenes recolhidos no Chile inibir a motilidade celular A549
Invasion e jogar a migração de um papel crucial na metástase de células de cancro. Para encontrar uma substância inibidora de metabólitos secundários de liquens, ferida ensaios de cura foram realizados em células de câncer de pulmão humano A549 como uma triagem inicial para extractos de acetona de 13 líquenes chilenos (Tabela 1) [17-20]. Como mostrado na Figura 1A,
Rhizoplaca Melanophthalma
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Pseudocyphellaria glabra
e
Nephroma sp
. inibiu a migração de células A549 a uma concentração de 5 ug /mL. Esta concentração foi utilizada como não foi observada citotoxicidade a esta concentração (dados não mostrados). As distâncias entre os bordos das feridas para as células tratadas com os cinco extractos líquen eram mais largos do que os de células tratadas com DMSO (Figura 1B).
(A) A análise quantitativa dos ensaios de migração de células A549 tratados com 5 mg /mL de extractos de acetona de
Pseudocyphellaria glabra
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Nephroma
sp.,
Physcia
sp.,
Flavoparmelia caperata
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Rhizoplaca Melanophthalma
,
Rhizoplaca Melanophthalma
,
Pseudocyphellaria argyracea
,
Pseudocyphellaria verrucosa
,
Xanthoparmelia
sp.,
Protousnea sp
. e
Xanthoparmelia
sp .. (B) Imagens representativas de ensaios de migração de células A549 tratadas com os extratos de
R
.
Melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
e
Nephroma
sp. (C-D) Os ensaios de invasão das células A549 tratadas com 5 ug /mL de extractos de acetona de
R
.
Melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra e Nephroma sp
. (C) e a análise quantitativa do número de células invadidas em cada tratamento (D). Os dados quantitativos foram obtidos a partir de três experiências independentes, n = 3. Os dados representam a média ± S.E.M. (Erro padrão da média). *** P . 0,001 em comparação com as células A549 tratadas com DMSO
usando duas revestidos por gelatina Para verificar ainda se os extractos líquen acima tinha uma actividade inibidora contra a invasão de células A549, ensaios de invasão foram realizadas bem câmaras. Como mostrado na Fig 1C, as células tratadas com os extractos de acetona de cinco líquenes mostrou um menor número de células invadidas quando comparado com o controlo tratado com DMSO. A análise quantitativa dos dados revelou que as diferenças foram significativas (Figura 1D). Estes resultados indicam que os extratos de acetona de
R
.
Melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
e
Nephroma sp
. exibem actividade inibidora contra a motilidade celular A549.
Physciosporin foi identificada como um metabolito secundário líquen activo de
P
.
coriacea
na inibição da motilidade celular do cancro do pulmão
Para investigar o principal composto destes cinco líquenes candidatos, cinco extratos líquen acetona foram analisados individualmente por TLC (Fig 2A). Com base na relação R
f valores [12],
R
.
Melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
e Nephroma sp
. compartilham o mesmo componente principal, o ácido úsnico (manchar um, Fig 2A), enquanto
P
.
glabra
e
P
.
coriacea
têm compostos principais distintas (ponto C, Fig 2A). Como o ácido úsnico é o metabolito líquen mais estudada para a atividade anti-câncer, nós escolhemos “ponto c ‘para um estudo mais aprofundado. ‘Ponto c’ foi distintamente observadas dentro
P
.
glabra
e
P
.
coriacea
entre outro
Pseudocyphellaria
género que possui tenuiorin (spot d) e outros metabolitos desconhecidos como o composto principal (painel esquerdo, Fig 2B). Como “ponto c ‘no
P
.
glabra
e
P
.
coriacea
compartilhou um
valor idêntico f TLC R com physciosporin em
P
.
granulata
e foi cinza claro ou escuro na luz do dia e tornou-se negro e denso sob UV (esquerdo e painel direito, Fig 2B), identificamos “ponto c” como physciosporin [21-23].
P
.
faveolata
e
P
.
valdiviana
também possuem physciosporin como seu principal composto (painel direito, Fig 2B). O physciosporin utilizada neste estudo foi isolada a partir de
P
.
coriacea
como as quantidades de outros líquenes physciosporin contendo eram limitadas. A pureza e a estrutura de physciosporin foi confirmada por HPLC e análise de RMN (Fig 2C; Ficheiro S1)
(AB) Cromatografia em Camada Fina (TLC) usando análise (Tolueno:. Dioxina: ácido acético = 180: 45: 5 , v /v /v) como sistema solvente para extractos líquen possuindo actividade inibidora na motilidade celular A549 (a), os líquenes em
Pseudocyphellaria
género (B). ‘A’ denota localização do ponto para o ácido úsnico; ‘B’, por atranorin; ‘C’, por physciosporin; ‘D’, por tenuiorin. espécies de líquenes
L
.
cladonioides Comprar e
U
.
longissimi
foram utilizados como controle padrão para atranorin e ácido úsnico, respectivamente. (C) Estrutura química da physciosporin. (D-E) Ensaio de migração de células A549 tratadas com 5 ug /mL de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou 5 ug /mL physciosporin (D), e análise quantitativa do comprimento da ferida (E). (F-G) ensaios invasão de células A549 tratadas com 5 ug /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
physciosporin ou (F), e análise quantitativa do número de células invadidas em cada tratamento (G). Os dados quantitativos foram obtidos a partir de três experiências independentes, n = 3. Os dados representam a média ± S.E.M. (Erro padrão da média). *** P . 0.001 em comparação com células A549 tratadas com DMSO
A fim de verificar se physciosporin é o composto ativo inibir a motilidade celular A549, physciosporin foi testado em ensaios de cicatrização de feridas e ensaios de invasão. Comparado com o extracto de acetona de
P
.
coriacea
, physciosporin mostrou atividade inibitória semelhante contra a migração e invasão de células A549 (Fig 2D-2G). Em particular, physciosporin inibiu a invasão de células A549 de forma dependente da dose (Figura 2F e 2G). Curiosamente, a inibição do composto purificado foi maior do que a de extractos em bruto no ensaio de invasão, mas ligeiramente inferior no ensaio de migração (Figura 2E e 2G). atividade inibitória do extrato de acetona de
P
.
coriaea Comprar e physciosporin sobre a motilidade de células de câncer de pulmão também foi observada em H1650, H1975 células (Fig 3). A viabilidade celular não foi alterado na concentração dada de physciosporin (dados não mostrados). Acima de tudo, estes resultados demonstraram que physciosporin é um líquen metabólito secundário ativo de
P
.
coriacea
na inibição da motilidade celular câncer de pulmão.
(AB) ensaios de invasão das células de câncer de pulmão H1650 e H1975 tratados com 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou 5 ug /mL physciosporin (A), e análise quantitativa do número de células em cada invadido tratamento (B). Os dados quantitativos foram obtidos a partir de três experiências independentes, n = 3. Os dados representam a média ± S.E.M. (Erro padrão da média). *** P . 0.001 em comparação com células A549 tratadas com DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin diminuiu o nível de epitelial-mesenquimal marcador de transição
Para investigar o mecanismo de ação para a atividade inibitória de physciosporin contra a motilidade celular do cancro do pulmão, os efeitos do extrato de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin foram examinados em várias vias de sinalização. Em primeiro lugar, as alterações nos níveis de epitelial-mesenquimal (EMT) marcador foram medidos em células tratadas (Fig 4). Em nosso estudo, diminui na expressão de N-caderina eram proeminentes em células A549 tratadas com extracto de acetona de
P
.
coriacea
physciosporin ou em ambas as proteínas e os níveis de ARNm (Figura 4B e 4C), enquanto que os de E-caderina permaneceu marginal (Fig 4A e dados não mostrados para o ARNm da E-caderina). Além disso, as expressões de Caracol e torção foram dose-dependente diminuiu extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin tratamento (Fig 4C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o extrato de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin têm actividade inibidora contra a motilidade celular câncer de pulmão, em parte, através da inibição da EMT.
(AB) Análise Western blot da caderina-E (A) e N-caderina (B) em células A549 tratadas com 5 ug /mL de extractos de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. (C) A análise quantitativa dos níveis de mRNA de N-caderina, Snail e torção em células A549 tratadas com 5 ug /mL de extractos de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. Os dados quantitativos foram obtidos a partir de pelo menos duas experiências independentes. Os dados representam ± médios S.E.M. (Erro padrão da média). * P 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001 em comparação com células A549 tratadas com DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin suprimida KITENIN mediada atividade AP-1 e afetou a expressão de KAI1 e KITENIN
Em seguida, mudanças na atividade de transcrição de β-catenina /LEF-1 (TOPFLASH), AP -1 (AP-1-luc), NF-kB (NF-kB-luc) e STAT (STAT-luc) foram medidos em células tratadas. Em um teste preliminar, única atividade AP-1 foi diminuída em extracto de acetona de
P
.
coriacea
physciosporin ou tratamento de uma forma dependente da dose, na ausência de co-activador (dados não mostrados). Em nosso estudo anterior, mostramos que KITENIN (KAI1 C-terminal tetraspanina interagindo) promove o potencial tumorigénico de cancros, e fator de crescimento epidérmico (EGF) estimula KITENIN mediada por AP-1 ativação [24]. Para testar os efeitos do extrato de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin em KITENIN mediada por actividade de AP-1, AP-1 Os ensaios de repórter foram realizados em células co-transfectadas com KITENIN. Como mostrado na Fig 5A, KITENIN mediada por actividade de AP-1 foi diminuída por extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou tratamento physciosporin de uma forma dependente da dose, tanto com e sem estimulação EGF. A fim de investigar o extrato como acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin suprimida atividade AP1 KITENIN mediada, testamos níveis KITENIN em células tratadas. Os níveis de ARNm KITENIN foram reduzidos pelo tratamento (Figura 5B). O gene supressor de metástase, KAI1, é frequentemente regulados negativamente em células tumorais metastáticas [25, 26]. Como KITENIN tem uma relação inversa com KAI1 ou outros genes supressores de metástases [27], foi testada a nível de mRNA de KAI1 em células tratadas e encontrou uma relação inversa semelhante entre KITENIN e KAI1 (Fig 5C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o extrato de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin inibem a motilidade celular A549, em parte, através da supressão de KITENIN mediada atividade AP-1, regulando expressões KITENIN e KAI1. Para verificar o nível de ARNm de KITENIN pode ser alterada pelo tratamento, foram realizados ensaios de luciferase para o promotor KITENIN e 3′-UTR. Como resultado, a actividade de KITENIN 3′-UTR foi dramaticamente reduzida pelo tratamento (Figura 5E), enquanto que o promotor de KITENIN manteve-se constante (Figura 5D).
(A), AP-1 de ensaio de luciferase de HEK293T As células transfectadas com KITENIN e tratados com 5 ug /mL de extracto de acetona de
P
.
coriacea
physciosporin ou na ausência ou presença de estimulação factor de crescimento epidérmico. (B-C) A análise quantitativa do nível de ARNm de KITENIN (B) e KAI1 (C) em células A549 tratadas com 5 ug /mL de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. (D-E) promotor KITENIN (D) e 3′-UTR (E) ensaios de luciferase de células HEK293T tratados com 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. Os dados quantitativos foram obtidos a partir de pelo menos três experiências independentes. Os dados representam ± médios S.E.M. (Erro padrão da média). * P 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001 em comparação com células tratadas com DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin redução da atividade RhoGTPase
Em seguida, mudanças nas atividades de RhoGTPases foram medidos em células tratadas (Fig 6). Para investigar os efeitos do extrato de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin sobre as actividades da Cdc42 e Rac1, ensaios de pull-down GST foram realizadas utilizando GST-PBD (domínio de ligação de p21). Os resultados mostraram que as actividades de Cdc42 e Rac1 foram reduzidos em 20% e 33%, respectivamente, na presença de physciosporin (Figura 6A e 6B). atividade RhoA também foi diminuída em extracto de acetona de
P
.
coriacea
e physciosporin (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o extrato de acetona de
P
.
coriacea Comprar e physciosporin inibem a motilidade celular A549, em parte, através da redução da atividade RhoGTPase. Os resultados demonstram que o metabolito secundário líquen, physciosporin, inibe a motilidade celular de cancro com mecanismos de acção específicos.
(AB) Os níveis de Cdc42 (A) e Rac1 (B) foram medidos em células A549 ligada a GTP tratados com 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
ou physciosporin. -GTP Cdc42 e -Rac1 foram medidos utilizando GST-PBD. Os montantes totais da Cdc42 e Rac1 foram mostrados para medir a atividade relativa. Os dados quantitativos foram obtidos a partir de três experiências independentes, n = 3. Os dados representam a média ± S.E.M. (Erro padrão da média). *** P . 0.001 em comparação com células A549 tratadas com DMSO
Discussão
Um monte de produtos químicos exclusivos foram isolados de líquen utilizadas para fins farmacêuticos. Neste estudo, um composto químico efectivo physciosporin foi isolado a partir de Chile líquen
Pseudocyphellaria coriacea
quanto à sua actividade inibidora contra a motilidade das células de cancro do pulmão. Physciosporin, um depsidone clorado, foi isolado pela primeira vez em 1977 a partir do líquen
Pseudocyphellaria physciospora
e identificado como metilo 2-cloro-4-formil-3,8-di-hidroxi-l, 6,9-trimetil-11- oxo-11
H
-dibenzo [b, e] [l, 4] dioxepina-7-carboxilato de (5-metil chlorovirensate) [22], mas a sua actividade biológica não tem sido relatada até à data. Neste estudo, verificou-se o seguinte: 1) o extracto de acetona de
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e seu subcomponente, physciosporin, inibem a motilidade das células de câncer de pulmão; 2) o extrato de
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coriacea Comprar e physciosporin suprimir EMT; 3) o extrato de
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coriacea Comprar e physciosporin diminuir KITENIN mediada atividade AP-1 e afetar a expressão de KAI1 e KITENIN; e 4) o extrato de
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coriacea Comprar e physciosporin reduzir a atividade RhoGTPase.
EMT, uma conversão fenotípica essencial durante o desenvolvimento embrionário, remodelação de tecidos e cicatrização de feridas, desempenha um papel indispensável na invasão tumoral e metástase [28-30]. Os aumentos na expressão de N-caderina e diminui em nível de E-caderina (chamado de “comutação caderina”) são cruciais para EMT e surgir durante a progressão do câncer [31]. Especialmente, o nível de N-caderina parece representar o fenótipo mesenquimal das células e um grupo de factores de transcrição incluindo caracol, Slug, ZEB e torção tem um papel crucial no controlo da EMT [32]. Caracol, um fator de transcrição zinc-finger identificado pela primeira vez em Drosophila, é um regulador EMT tecla [33]. Torção também tem um papel importante na metástase do cancro. Por exemplo, a inibição da expressão TWIST de RNAs curtos-interferência afeta vigor metastático [34], ea regulação do Twist-1 pode contribuir para a resistência ao paclitaxel e antimicrotúbulos drogas em pacientes com câncer [35]. Nosso resultado mostrou que os níveis de N-caderina, Snail e torção foram diminuiu extracto de acetona de
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e tratamento physciosporin enquanto as de E-caderina permaneceu marginal (Fig 4). É digno de nota que, em alguns casos, as mudanças no nível de E-caderina não são essenciais para EMT [36] ou a actividade metastática de tumores [37].
KITENIN é um gene que aumentam a metástase. Recentemente, identificamos que o eixo KITENIN /ErbB4-Dvl2-c-Jun é um sinal a jusante independente de EGFR não convencional de EGF e medeia a invasão e tumorigénese de células de câncer [24]. Em nossos resultados, KITENIN mediada atividade AP-1 foi diminuída pelo extrato de
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coriacea Comprar e physciosporin. Especialmente, a expressão de KITENIN foi reduzida pelo tratamento e, por isso, a actividade 3′-UTR de KITENIN foi dramaticamente reduzido (Fig 5). Alguns microRNAs-alvo KITENIN suprimindo a migração e invasão das células através de modulação da expressão KITENIN foram notificados e miR-27a, miR-30b, e miR-124 estão entre os exemplos [15]. Atualmente, nós não sabemos se physciosporin provavelmente age como microRNAs para suprimir 3′-UTR atividade de KITENIN. No entanto, o sinal a jusante KITENIN como não convencional /mediada por ErbB4 de EGF desempenha um de a base molecular para que confere resistência a agentes anti-EGFR, o extrato de
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coriacea Comprar e physciosporin pode ter potencial atividade benéfica para a superação da eficácia clínica limitada da terapia anti-EGFR.
Rho GTPases, membros da superfamília Ras de pequenas GTPases, como Rac1, Cdc42, e