Abstract

Para facilitar a imagem do câncer de próstata utilizando moléculas-alvo, construímos nanobubbles ultra-som juntamente com (antígeno de membrana específico da próstata) nanobodies específicos anti-PSMA, e avaliada a sua capacidade de ligação

in vitro

e

in vivo

eficácia de imagem. Os nano-bolhas “específicas”, que foram construídos por meio de um sistema de biotina-estreptavidina, tinha um diâmetro médio de 487,60 ± 33,55 nm e levada a nanocorpo anti-PSMA como demonstrado por imunofluorescência. A microscopia revelou alvo ligação de nanobubbles

in vitro

às células PSMA-positivos. Além disso, os indicadores de ultra-sonografia de imagem nanobubble (incluindo o tempo de chegada, hora de pico, pico de intensidade e duração aumentada) foram avaliadas para a ultra-sonografia em três tipos de enxertos de origem animal (LNCaP, C4-2 e MKN45), e mostrou que estes quatro indicadores de nanobubbles direcionados apresentaram diferenças significativas em relação nanobubbles em branco. Portanto, este estudo não só apresenta uma nova abordagem para atingir ultrassonografia câncer de próstata, mas também fornece a base e métodos para a construção de nanobubbles de ultra-som alvo de pequeno porte e de alta eficiência

Citation:. Fan X, Wang L, Guo Y, Z Tu, Li G, Tong H, et al. (2015) Ultrasonic nanobubbles Carrying Anti-PSMA nanocorpo: construção e aplicação no Imaging Prostate Cancer segmentadas. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10.1371 /journal.pone.0127419

editor: Serge Muyldermans, Vrije Universiteit Brussel, Bélgica

Recebido: 05 de novembro de 2014; Aceito: 14 de abril de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural (número de concessão: 30970830), a Chongqing Science Foundation (número de concessão: cstc2012jjB0072) eo Juventude Science Foundation do Departamento Jiangxi da Educação (número de concessão: GJJ12142).

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A identificação específica do câncer de próstata é um clinicamente. tarefa urgente [1]. A este respeito, o desenvolvimento de imagiologia molecular ultra-som tem proporcionado uma nova avenida para o diagnóstico precoce do câncer de próstata. Esta técnica envolve compostos de imagem de etiquetagem com anticorpos ou ligandos específicos para gerar agentes de contraste de ultra-sons alvo capaz de se ligar a tecidos ou lesões específicas. Após a administração intravenosa, estas sondas moleculares agregar especificamente nos tecidos alvo, através da circulação sanguínea, permitindo assim a imagiologia específica à base de ultra-sonografia de alterações patogénicas a um nível celular ou molecular. [2]. No entanto, os agentes de contraste de ultra-som escala mícron (microbolhas) atualmente utilizados em exames de imagem mais relevantes têm diâmetros de 1-10 mm [3,4]. Tumorais estruturas neovasculares são muitas vezes imperfeita porque os vasos sanguíneos do tumor apresentam membranas basais incompletas, falta de camadas de músculo liso e exibem má circulação linfática; Por conseguinte, estes recipientes exibem um aumento da permeabilidade em relação aos vasos sanguíneos normais, um efeito que tem sido chamado o efeito de permeabilidade e retenção melhorada (EPR). Apesar desta permeabilidade, o diâmetro de poro vascular máxima varia de cerca de 380-780 nm, e teoricamente apenas partículas 700 nm de diâmetro, podem passar através da neovascularização do tumor; por conseguinte, os agentes de contraste de ultra-som normal, muitas vezes não pode passar através da vasculatura para pesquisar as células de tumor e facilitar a imagiologia de tumores específico [5,6]. Na sequência destas conclusões EPR, alguns grupos têm construído recentemente nanobubbles e examinou a sua permeabilidade. Os nanobubbles preparados por Yin

et al

. tinha um diâmetro médio de 436,8 ± 5,7 nm e apresentada tumor passivo segmentação [7]. Nos nossos estudos preliminares, foi também desenvolvido nanobubbles orientadas com um diâmetro médio de 644,30 ± 55,85 nm que realizada anticorpos monoclonais contra o antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) e investigou o potencial de imagem destas nanobubbles em xenoenxertos de cancro da próstata em ratinhos nus. Nossos resultados revelaram que esses nanobubbles alvo poderia aumentar os valores de tempo e intensidade de xenotransplante de pico em comparação com nanobubbles em branco e, portanto, propício a imagem alvo específico do tumor [8].

No entanto, nanobubbles alvo de anticorpos monoclonais têm dois aparente limitações. Primeiro, os anticorpos monoclonais de murino são imunogénicos em seres humanos. Em segundo lugar, os grandes pesos moleculares de complexos anticorpo-partículas resultar em baixos números de segmentação complexos que atingem os alvos pretendidos [9], comprometendo os resultados de imagem. Consequentemente, a identificação de um anticorpo de pequeno porte que é conveniente, de alta eficiência e penetrante é crucial para imagiologia molecular segmentada por tumor. A descoberta de nanobodies [10] forneceu uma estratégia promissora para desenvolver um novo tipo de nanobubble alvejado por ultra-som, porque esses nanobodies são menores em tamanho. Especificamente, IgG2 e IgG3 (anticorpos de cadeia pesada) de animais da família dos Camelídeos naturalmente carecem de cadeias leves e o domínio CH1; estes são os menores fragmentos de ligação antigênicos atualmente conhecidos funcionais e são caracterizadas por baixo peso molecular, expressão adequada, estabilidade e baixa imunogenicidade

in vivo

. Assim, nanobodies são uma perspectiva promissora em relação ao diagnóstico preciso e terapias direcionadas [11-16]. No entanto, foram descritos muito poucos nanobubbles de ultra-som alvo de tumor juntamente com nanobodies específicos. No presente trabalho, nós desenvolvemos a formulação nanobubble alvo de pequeno porte e de alta eficiência, o que levou o nanocorpo anti-PSMA, para verificar a hipótese de que nanobubbles revestido de nanocorpo pode aumentar o valor diagnóstico do ultra-som no câncer de próstata.

Materiais e Métodos

células e animais

LNCaP, que é a típica de células de câncer de próstata andrógeno-dependentes humana, foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, o qual é um subtipo da linha celular de LNCaP e uma linha celular de cancro da próstata independente de androgénio humano, foi adquirida a partir de ViroMed Laboratories na Johns Hopkins, EUA. MKN45, uma linha celular de cancro gástrico humano como controlo, foi obtido a partir da Academia Chinesa de Ciências Médicas Cancer Institute (Pequim, China). macho de quatro a cinco semanas de idade BALB /c-nu ratinhos nus (Centro Experimental animal, Terceira Military Medical University) mantidos num ambiente específico isento de patógeno foram usadas como descrito abaixo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Terceira Universidade Médica Militar.

Western blot em três linhas celulares

LNCaP, células C4-2 e MKN45 foram cultivadas até a fase logarítmica, enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), colocado em gelo, e suspendeu-se em 400 ul de ensaio de radioimunoprecipitação tampão de lise (RIPA) de proteína. Em seguida, todos os lisados ​​celulares de tumor foram transferidos para um tubo de 1,5 ml e centrifugadas a 15000 rpm e 4 ° C durante 15 min. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Um kit de ácido bicinconínico (BCA) foi então usada para determinar a concentração de proteína. Além disso, as amostras foram suplementadas com 5X de sódio dodecil tampão de carregamento de electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE), misturados e fervidos durante 5 min para desnaturar as proteínas totalmente. Trinta microgramas de proteína total foi separada por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por meio do método de transferência semi-seca. A membrana foi bloqueada com um tampão de leite desnatado a 5% à temperatura ambiente durante 2 h e foi então sondada, sucessivamente, com uma diluição 1: 400 de diluição (2,5 ug /mL) de um anticorpo monoclonal anti-hPSMA a 4 ° C durante a noite e a 1: diluição de uma peroxidase de rábano (HRP) 2000 -conjugated anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 2 h; a membrana foi lavada três vezes com PBST (PBS com 0,1% de Tween-20) após cada incubação do anticorpo.

Geração de nanocorpo específica e biotinilado

A região extracelular do PSMA foi expressa em primeiro eucariótica rim embrionário humano (HEK) -293 células, após o que a proteína recombinante foi utilizada como um material de revestimento, para pesquisar uma biblioteca de nanocorpo naturais previamente estabelecido designado nA-PDL. Correspondentemente, os fagos nanocorpo capazes de se ligar especificamente ao PSMA aos níveis moleculares e celulares foram obtidas [17]. Estes fagos foram subsequentemente sequenciados, e os seguintes iniciadores foram desenhados de acordo com os resultados da sequenciação: iniciador para a frente, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (contendo um

BamHI

local) e o iniciador inverso, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (contendo um

HindⅢ

sítio ). Uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi então realizada, utilizando o clone de fago positivo como um molde para amplificar o gene alvo; o produto da reacção foi subsequentemente clonado no

BamHI e

HindIII

locais do vector de expressão pET28a (Novagen /Merck, Billerica, MA, EUA), que contém um marcador de seis histidina. O vector recombinante foi transformado no

E

.

coli

estirpe DH5a. Os clones positivos resultantes foram sequenciados para identificar aqueles com a sequência correcta; os clones correctos foram transformados no

E

.

coli

Rosseta estirpe de expressão (DE3; Novagen /EMD Millipore) para produzir um nível de expressão elevado. Ni-agarose (Qiagen, Venlo, Países Baixos) foi posteriormente utilizado para purificar o nanocorpo histidina-tag. A seguir, marcado com o nanocorpo com a solução de biotina. Em pormenor, duas mg de Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) foram completamente dissolvidos em 360 mL de solução estéril de DDH

2O. Esta solução foi incubada com o nanocorpo a 4 ° C durante 72 h, seguido por diálise a 4 ° C durante a noite. Espectroscopia de UV foi usada para determinar a concentração de anticorpos. Especificamente, o coeficiente de extinção teórico a partir da sequência do nanocorpo foi 21555 H

-1 · cm

-1, e a absorvância a 280 nm foi medida para calcular a concentração de anticorpo de acordo com a fórmula “Absorvância = ε ( coeficiente de extinção, M

-1 · cm

-1) X pathlength (cm) X concentração (M) “. Um kit de biotina quantificação (Pierce /Thermo Scientific) foi utilizado para calcular as concentrações de biotina nas amostras e gerar a proporção de conjugação de biotina /anticorpo

Validação da afinidade nanocorpo através de ensaio imunoenzimático (ELISA)

Para obter a afinidade do nanocorpo biotinilado, utilizou-se um ELISA competitivo standard. Cada poço de uma placa de microtítulo foi revestido com antigene recombinante PSMA 1 mM, bloqueou-se com albumina de soro bovino 3% (BSA) -PBST à temperatura ambiente durante 2 h e, em seguida, lavada três vezes com PBST. Em seguida, 1 nM nanocorpo biotinilado foi incubado com concentrações crescentes de antigénio em concentrações que variam de 0,1 nM a 100 pM em tubos eppendorf paralelas. Após 30 minutos de incubação, 90 uL das misturas de reacção foram aplicados aos poços de uma placa de microtítulo revestidas com antigénio. Após 10 min de incubação, as misturas foram descartados, e os poços foram lavados com PBST. Em seguida, 100 ul de HRP-estreptavidina conjugada com biotina (Century Kangwei, Pequim, China), a uma diluição de 1: 2000 foi adicionado a cada poço, seguido de incubação a 37 ° C durante 1 h. Cada poço foi então enxaguado 5 vezes com PBST antes da adição de 100 ul /cavidade de um 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) solução de trabalho (Beyotime, Xangai, China) e incubar a placa à temperatura ambiente durante 15 min . As reacções foram terminadas por adição de 50 uL de uma solução de ácido sulfúrico 2 M a cada poço. A absorvância a 450 nm foi em seguida determinada para cada poço. Portanto, a maior densidade óptica (DO)

450nm deveria ter sido observada a baixas concentrações de antigénio. A concentração de antigénio no qual o sinal de ELISA semi-máxima é detectada corresponde à constante de dissociação K

D.

preparação e validação dos nano-bolhas orientadas

As misturas que contêm proporções específicas de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC; Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Suécia), biotinilado diestearoil fosfatidil etanolamina (Bio-DSPE; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, EUA) e azida de difenilfosforilo (DPPA; Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha) e foram pesados liofilizado usando um secador de congelamento (Shanghai Pudong liofilização Equipment Co., Shanghai, China). Alíquotas destas misturas foram colocadas em tubos de ensaio; octafluoropropano (C

3F

8) de gás foi lentamente injetada para substituir as sobreposições de ar nos frascos. Antes do uso, uma solução mista de 1 parte de glicerol: 9 partes de PBS foi adicionado ao frasco, seguido por aquecimento a 37 ° C para facilitar a solubilização. As preparações foram misturadas horizontalmente de forma inversa, utilizando um amalgamador série ST (AT M Biomateriais Co., LTD, Pequim, China) com os seguintes parâmetros de trabalho específicos: frequência de vibração, ≥4500 /min; amplitude de vibração, 15 ± 1 mm e duração vibração, 60 s [8]. Estas preparações foram, subsequentemente, deixada em repouso a 4 ° C para facilitar a separação de fases. A suspensão leitosa de fase inferior foi centrifugado a 300 rpm durante 3 minutos para separar as nanobubbles biotinilados na parte inferior a partir das microbolhas no topo. Em seguida, 3 ug de avidina foram adicionadas por 10

7 nanobubbles, seguido de incubação a 4 ° C durante 1 h. As preparações foram deixadas a repousar a fim de facilitar a separação de fases; a camada superior foi, subsequentemente, recolhido e centrifugado a 300 rpm durante 3 min. A amostra foi enxaguada três vezes para remover o excesso de avidina. Em seguida, 1 ml de nanocorpo biotinilado foi adicionado por 10

7 nanobubbles, seguido de incubação, centrifugação e lavagem para remover o excesso de nanocorpo biotinilado. Os nanobubbles resultantes foram designados os RN alvejados, enquanto nanobubbles sem suplementação anticorpo foram designados os RN em branco. Os tamanhos das partículas dos 2 produtos foram analisados ​​num Malvern Zetasizer Nano ZS90 analisador (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Reino Unido), e uma câmara de contagem foi usada para determinar as concentrações dos 2 produtos. sua

In vitro

efeitos de imagem com as diferentes concentrações foram investigados com um modelo de agarose sob a condição de um índice de mecanismo de 0,12 e um ganho de 60%.

Para investigar se este método poderia ser usada para anexar nanocorpo biotinilado às nanobubbles, RN em branco ou direccionados foram incubados com um anti-anticorpo de ratinho Sua durante 1 h, seguido por centrifugação, lavagem e incubação no escuro, com um isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo anti-ratinho de cabra durante 3 h a 4 ° C. As amostras foram centrifugadas e lavadas para remover o anticorpo secundário não ligado. As amostras foram então observados sob um microscópio de fluorescência (Olympus Corporation, Tóquio, Japão) para avaliar a fluorescente vinculativo.

nanobubbles e

in vitro

celular ensaio de ligação

LNCaP , células MKN45 C4-2 e cultivados para a fase logarítmica foram centrifugadas e semeadas em lamelas nos poços de uma placa de 24 poços a uma densidade de 1,5 x 10

4 células /poço. As células foram cultivadas durante a noite, fixadas com 4% de paraformaldeído e lavado três vezes com PBS. Dois grupos de lamelas foram preparados por tipo de célula; Um grupo foi suplementado com 30 ul de RN alvejado (1,0 x10

8 /mL) e a outra com RN em branco, após o que as misturas foram incubadas a 4 ° C durante 3 h. Posteriormente, as lamelas foram lavadas três vezes com PBS, colocados com a face para baixo em lâminas e observadas ao microscópio de luz (Olympus Corporation) para examinar os nanobubbles. A percentagem de aderência, definida como a percentagem de células marcadas com ≥4 nanobubbles orientados num dado campo aleatório, foi calculada para indicar ligação. Esta experiência foi repetida 4 vezes.

Nanobubble de imagem em diferentes xenoenxertos

células de cancro da próstata LNCaP-fase logarítmica e células de C4-2 foram utilizadas para preparar as suspensões de células a uma densidade de 5 x 10

7 células /mL; MKN45 células de cancro gástrico na fase de crescimento logarítmica, foram usadas para preparar suspensões de células de 1 x 10

7 células /mL. Duzentos microlitros de cada suspensão de células foram subsequentemente misturada com 200 ul de BD Matrigel (BD Biosciences, EUA); As misturas resultantes foram inoculados subcutaneamente em ratinhos nus macho de 4-5 semanas de idade BALB /c-nu com um peso corporal de 18-20 g. Cinco animais foram utilizados para cada tipo de tumor de xenoenxerto. Os xenoenxertos foram monitorizados diariamente com um compasso de calibre de vernier até que os tumores atingiram um diâmetro de aproximadamente 1 cm.

foram anestesiados portador de tumor ratinhos nude via intraperitoneal administrado pentobarbital de sódio a 1%. Para imagiologia, as superfícies de ambas a sonda do tumor e foram cobertos com um agente de acoplamento de espessura de 5 mm. A 50-mm L12-5 banda larga sonda de ultra-sons linear ligado a um sistema de ultra-som iU22 (Philips, Amsterdão, Holanda) foi usado para executar em modo-B de ultra-som dos xenoenxertos. Uma vez que a secção transversal de um xenoenxerto foi totalmente revelada, a sonda foi imobilizada para permitir set-up do modo ultra-sonografia (índice mecânico, 0,12; ganho, 90%). A ultra-sonografia foi iniciado quando o centro focal foi posicionada no centro do tumor. Cada animal de teste recebeu 200 ul em branco ou alvejado NBS (3 × 10

7) partículas através de injecção na veia da cauda, ​​após o que a tubagem foi lavada com 100 mL de solução salina. As imagens dinâmicas foram recolhidos até a área do tumor foi completamente livre de RNs. Além disso, 200 uL de uma quantidade equivalente de um outro tipo de nanobubbles e 100 ul de solução salina foram administradas de um modo semelhante para facilitar a ultrassonografia em condições idênticas; os dados de imagem obtidos a partir dos mesmos ratinhos nus foram analisados ​​utilizando software Qlab8.1 (Philips) para comparar os 4 parâmetros de imagem (tempo de chegada, hora de pico, pico de intensidade e duração aumentada) na área de heteróloga com os agentes de contraste 2. O tempo de chegada foi definido como o intervalo de conclusão de injecção e o primeiro ponto de tempo em que 10% da intensidade de pico foi alcançada. duração melhorada foi definido como o intervalo entre os 2 pontos de tempo em que 10% da intensidade de pico foi alcançada. horário de pico foi definido como o intervalo entre o momento da injecção eo tempo de pico de intensidade [18].

Análise estatística

Statistical Package for Social Science (SPSS) 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para realizar as análises estatísticas. Todos os dados quantitativos foram expressos como média ± desvio padrão. O NB alvejado e dados de indicadores de ultra-som em branco NB no

in vitro

e

In vivo

imagings foram obtidos e analisados ​​utilizando um teste t de amostras pareadas. Os indicadores de ultra-som dos nanobubbles que tiveram como alvos os 3 tipos de xenotransplante foram analisados ​​utilizando uma análise de variância (ANOVA). Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Histogramas e a curva com regressão não-linear foram plotados usando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA).

Resultados

expressão PSMA em diferentes linhas celulares e preparação do PSMA-specific nanocorpo

Western blot foi utilizada para examinar a expressão de PSMA em células LNCaP, C4-2 e MKN45. Os resultados mostraram que, entre estas linhas de células, as células LNCaP expressa ao mais alto nível do PSMA, seguido de células C4-2; MKN45 células cancerosas gástricas exibiu nenhuma expressão PSMA aparente (Fig 1).

células LNCaP expressa um maior nível de PSMA que as células C4-2, enquanto células MKN45 exibiu nenhuma expressão.

o clone de fago seleccionado através de panning procariótica foi utilizado para a expressão recombinante e facilitou a aquisição de marcada com His nanocorpo específicos do PSMA (peso molecular, de 18 kD). Após a biotinilação nanocorpo, espectrometria de UV foi realizada para revelar que a concentração do anticorpo foi de 0,59 mg /ml e a proporção de conjugação de biotina /nanocorpo foi de cerca de 3,6: 1 de acordo com um kit de biotina quantificação. Com base no princípio de ligação competitiva, a constante de dissociação é igual à concentração no valor de semi-máxima em ELISA. Por isso, o K

D de nanocorpo biotinilado contra o PSMA recombinante foi 519 nM, enquanto o de regressão não linear teve um bom encaixe com R

2 = 0,978 (Figura 2).

A curva com de regressão não linear sobre a concentração de recombint PSMA variando de 0,1 nM a 100 uM são obbtained.

Targeted NB Caracterização por microscopia de fluorescência

os nanobubbles e nanocorpo biotinilado foram conjugados com estreptavidina biotina. Um microscópio de luz e Malvern Zetasizer analisador nano ZS90 foram usadas para estudar as morfologias e diâmetros dos RNs alvejados e RNs em branco e revelou que ambos exibindo formas esféricas regulares, ea preparação NB alvejado tinha um diâmetro médio de 487,60 ± 33,55 nm, enquanto que o NB preparação em branco tinha um diâmetro médio de 445,30 ± 32,96 nm; sua

in vitro

efeitos de imagem, ou seja, sinais de ultra-som, não teve diferenças na mesma concentração (P = 0,06, Fig 3). Imunofluorescência revelou mais tarde que os RN alvo emitido sinais de fluorescência verde sob o microscópio (Fig 4). Em contraste, os nanobubbles branco, que não foram marcadas com nanocorpo biotinilado, não exiba um sinal de fluorescência claro, indicando que as nanobubbles especificamente ligado a nanocorpo através de interacções biotina-avidina.

Um analisador Malvern Zetasizer foi usada para examinar o tamanho das partículas. RN em branco (sem nanocorpo biotinilado) tinha um diâmetro médio de 445,30 ± 32,96 nm (A), ao passo que Targeted NBS (com nanocorpo biotinilado) tinha um diâmetro médio de 487,6 ± 33,55 nm (B). E não há nenhuma diferença na sua

in vitro

de imagem nas mesmas concentrações (C).

A observação microscópica do RN alvejado (A e B). As estruturas em forma de anel com membranas grossas são RNs (B). Os resultados demonstraram que os RNs alvejados poderia especificamente incorporar nanocorpo através de interacções biotina-avidina.

A ligação de nanobubbles direcionados para células

ligação foi examinada por meio de microscopia de Cell-nanobubble (Fig 5). Os nano-bolhas orientadas aderiram melhor às células LNCaP, cada um dos quais recrutados uma média de 7,27 ± 1,70 nanobubbles para se obter uma percentagem de aderência de 98,00 ± 2,31%, seguido por células C4-2, cada um dos quais recrutados 5,67 ± 1,61 nanobubbles para se obter um percentagem de aderência de 92,00 ± 8,64%. Em contraste, não foi observada ligação significativa entre os nanobubbles e células MKN45, com uma frequência de ligação de 0,72 ± 0,87 nanobubbles por célula. Finalmente, não foi identificado de ligação aparente entre os RN em branco e cada um dos tipos de 3 células, como evidenciado pelos números correspondentes de ligação de 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 e 0,68 ± 0,94 por célula, respectivamente.

Sob um microscópio de luz, ambas as células LNCaP e células visivelmente C4-2 ligado a RN alvejado (a e B), enquanto que células MKN45 não se ligou a RN alvejado (C). Nenhum dos 3 tipos de células exibido proeminente ligação a RN branco (D, E e F). Escala, 5 mm.

imaging xenotransplante Ultrasound

software Qlab8.1 foi utilizado para analisar e comparar os indicadores de imagem (hora de chegada, horário de pico, pico de intensidade e duração aumentada) de os RN alvejados e RNs em branco nos 3 grupos de xenotransplante (Fig 6 e Tabela 1). Nos xenoenxertos de cancro da próstata (LNCaP e C4-2), os resultados revelaram que os valores de intensidade de pico (valores de P, 0,003 e 0,002, respectivamente) e aumentou durações (valores de P, 0,001 e 0,004, respectivamente) dos RN alvejados foram significativamente mais elevado e mais, respectivamente, do que nos RN em branco. No entanto, os tempos de chegada e horários de pico eram indistinguíveis entre os 2 tipos de nanobubbles. No grupo de xenoenxerto de cancro gástrico controle MKN45, o RN alvejado e NBS em branco não apresentaram diferenças claras em relação aos 4 indicadores. Uma comparação entre os 3 tipos de xenoenxertos com respeito às propriedades de imagem nanobubble segmentados revelou que os xenoenxertos C4-2 exibiram significativamente diferentes valores de intensidade de pico, da duração dos tempos de chegada, melhoradas e tempos de pico comparados os xenoenxertos MKN45, com os respectivos valores de p de 0,024, 0,007, 0,000 e 0,050. Além disso, os xenoenxertos de LNCaP também exibida significativamente diferentes tempos de chegada e os valores de pico quando comparadas com as dos xenoenxertos MKN45 (valores de p de 0,000 para ambos), embora os restantes 2 indicadores não foram significativamente diferentes. Portanto, o uso de imagens ultra-sonografia com RN alvo, tanto as células cancerosas da próstata LNCaP andrógeno-dependentes e células C4-2 andrógeno-independente manifestado maiores valores de pico e tempos de chegada mais tarde do que o controle xenoenxertos de cancro gástrico. Além disso, quando os xenoenxertos de LNCaP e C4-2 foram comparados, o tempo de chegada (P = 0,026), o tempo de pico (P = 0,005) e do valor de pico (P = 0,008) diferiu significativamente melhorada enquanto que a duração não foi significativamente diferente (P = 0,261). No entanto, as pequenas diferenças (apenas menos de um segundo) no tempo de chegada e o tempo para atingir o pico entre dois tumores ou dois tipos de agentes de contraste não são fáceis de ser observada, de modo que a duração do valor de pico e de imagem deve ser o foco da maior preocupação .

Painéis B, e e G mostram as secções transversais clássicas de 3 tipos de enxertos menores de modo B ultra-sonografia. Os painéis A, D e H mostram a ligação de RN em branco para os xenoenxertos com a intensidade de pico. Painéis C, F e I mostram a ligação do RN direcionados aos xenotransplantes na intensidade de pico. As imagens ultra-sonografia, tanto no LNCaP e xenotransplantes C4-2 revelou que a intensidade de imagem era aparentemente superior à intensidade de imagem alcançada com os RN em branco no nível de pico nanobubble. Nos MKN45 xenotransplantes, os resultados de imagem dos RNs alvejados e RNs em branco foram comparáveis ​​ao nível de pico nanobubble. De tudo, áreas azuis representam os exnografts, enquanto que as áreas vermelhas e amarelas representam, respectivamente, as diferentes áreas de imagem em LNCaP e C4-2 exnografts.

Discussão

Atualmente, próstata câncer é comum e compromete gravemente a saúde dos homens idosos, muitas vezes levando à morte [19,20]. Embora a ultra-sonografia transrectal tornou-se uma ferramenta de exame de rotina que desempenha um papel importante na doença de biópsia, monitorização e tratamento, estudos clínicos revelaram que este procedimento é limitada pela sensibilidade e especificidade [21-23] insuficiente. O campo emergente da ultra-sonografia molecular integra ultra-sonografia, biologia molecular e outras disciplinas e, assim, introduz um novo caminho pelo qual para diagnosticar e tratar tumores; ele também oferece a possibilidade de imagem específica do câncer de próstata em um nível molecular e correspondentes diagnóstico precoce [24]. Atualmente, a construção e design de microbolhas de próstata-alvo-cancerosas se principalmente focada em moléculas alvo implicados na angiogênese, incluindo microbolhas alvo que carregam anticorpo vascular tipo de receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR2). No entanto, este projeto tem 2 inconvenientes aparentes: i) os agentes de contraste em sua maioria micro-escala têm fraca permeabilidade e não pode viajar através de vasos sanguíneos do tumor para entrar nos espaços intersticiais e, portanto, bolhas de segmentação não podem aderir diretamente às células cancerosas da próstata; ii) este método tem uma especificidade baixa que conduz a uma incapacidade para realizar imagiologia de tecido do cancro da próstata específica [25]. O esforço EPR de tumores torna teoricamente possível usar nanobubbles em imagem molecular das células da matriz e do parênquima tumoral extravasculares tumorais. Anteriormente, usando microscopia óptica e eletrônica, demonstramos que nanobubbles com um diâmetro médio de 435,20 ± 60,53 nm podia atravessar as lacunas endoteliais vasculares em xenoenxertos, proporcionando assim uma base experimental em que para alcançar imagiologia orientada das estruturas tumorais extravascular [26]. Enquanto isso, este método também tira proveito de alguns dos atributos de nanobubbles, como o relativamente grande área de superfície, capacidade de adesão forte e de longa duração de imagem

in vivo

.

PSMA é uma próstata biomarcador do cancro com uma maior especificidade e sensibilidade do que outras moléculas semelhantes. PSMA é particularmente altamente expresso em cancros da próstata hormônio-refratário e metástases de câncer de próstata [27]. Além disso, a região extracelular do PSMA, que compreende 707 amino ácidos, acomoda vários epítopos antigénicos. Assim, PSMA tornou-se um foco de investigação no que diz respeito às terapias de tumor alvo-imunes e imagiologia molecular tumor [28,29]. Sanna

et al

. conjugados do inibidor PSMA à base de ureia DCL para o poli componente de microbolhas envelope (láctico-co-glicólico ácido-polietileno-glicol (PLGA-PEG), gerando, assim, um agente de contraste de ultra-sons objectivo de ser utilizada para a avaliação de ligação de células de cancro da próstata

em

vitro [30]. no nosso estudo anterior, o anticorpo monoclonal utilizado foi imunogénica, que, em conjunto com os grandes pesos moleculares dos complexos de anticorpo-paticle, conduziu a fraca penetração no tecido. por conseguinte, após a administração venosa, a concentração na área alvo era baixa. Este problema limitou severamente a maior aplicação clínica de microbolhas para modalidades de diagnóstico e de imagiologia segmentados. Alternativamente, os péptidos de pequenas moléculas específicas são frequentemente utilizados em estudos de imagem molecular. Embora estes compostos são facilmente sintetizados e possuem pesos moleculares baixos , altos níveis de infiltração de tecido e de baixa imunogenicidade, eles também apresentam problemas, tais como meias-vidas curtas (propensão para a hidrólise e depuração renal) e afinidades voláteis, que prejudicam significativamente a estabilidade do nanobubbles específicas de curto-rolamento peptídicas. Em contraste, nanocorpos são altamente estáveis ​​e apresentam afinidades elevadas de antigénio. Além disso, eles têm muito baixa imunogenicidade, como evidenciado por resultados experimentais animais, nos quais não há respostas imunitárias humorais ou celulares foram detectados após a administração repetida [31]. Portanto, as várias propriedades de nanobodies forneceram evidências convincentes sobre a viabilidade de segmentação e concentrando nanobubbles dentro dos tecidos-alvo

in vivo

. Embora nanobodies supostamente foram aplicadas em estudos de imagem molecular, incluindo algumas aplicações moleculares nucleares medicina [32-34], a aplicação desta tecnologia no campo da ultra-sonografia tem sido limitada a microbolhas de ultra-som [35]; a nosso conhecimento, poucas pesquisas sobre nanobubbles marcado com nanocorpo foram relatados neste campo.

Por isso, foi utilizado um sistema biotina-avidina para integrar as vantagens de nanobubbles e nanocorpo gerando nanobubbles que abrigavam PSMA nanocorpo.