Abstract

Recentemente, histona deacetilase (HDAC) surgiram como uma classe promissora de medicamentos para o tratamento de cancros, especialmente do linfoma de células T por via subcutânea. Neste estudo, demonstramos que MPT0E028, um romance

N

-hydroxyacrylamide derivado inibidor HDAC, o crescimento de células HCT116 cancro colorectal humana inibida

in vitro

e

in vivo

. Os resultados de NCI-60 rastreio mostrou que MPT0E028 inibiu a proliferação em ambas as linhas celulares de tumores sólidos e hematológicos em concentrações micromolares, e foi especialmente potente em células HCT116. MPT0E028 tinha uma actividade apoptótica mais forte e inibiu a atividade HDACs mais potente do que o SAHA, o primeiro HDAC terapêutico inibidor provado pela FDA.

In vivo

modelo de murino, o crescimento do tumor de xenoenxerto de HCT116 foi adiada e inibida após o tratamento com MPT0E028 de uma forma dependente da dose. Baseado em

in vivo

estudo, MPT0E028 mostrou eficácia anti-câncer forte do que SAHA. Não foram observadas diferenças de peso corporal significativa ou outros efeitos adversos em ambos os grupos tratados com SAHA MPT0E028-e. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que MPT0E028 tem várias propriedades e é potencial como uma droga terapêutica anti-câncer promissor

Citation:. Huang HL, Lee HY, Tsai AC, Peng CY, Lai MJ, Wang JC, et ai. (2012) Anticancer Atividade de MPT0E028, um novo e potente da desacetilase de histona Inhibitor, em Células Colorectal Cancer Humano HCT116

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 7 (8): e43645. doi: 10.1371 /journal.pone.0043645

editor: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-Universidade, Alemanha |

Recebido: 20 Março, 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 22 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

histona deacetilase inibidores (HDACi) são uma nova classe promissora de agentes anticancerígenos. HDACi inibir a progressão do tumor através da sua capacidade para regular a expressão do gene através da promoção de acetilação de histonas e proteínas não-histona [1], [2]. Actualmente, vários HDACi, incluindo SAHA, LBH589, PXD101, MS-275, e FK228, estão a ser examinado em ensaios clínicos para a sua capacidade para tratar vários tumores sólidos e hematológicos [3], [4]. Os EUA Food and Drug Administration (FDA) aprovou recentemente SAHA e FK228, para o tratamento do linfoma cutâneo de células T [5]. inibidores de HDAC (HDACi) modular a expressão de vários genes que regulam a apoptose, angiogénese [6], [7], a progressão do ciclo celular e diferenciação celular. Elas têm uma toxicidade mínima contra células normais [8] – [10]. Tomados em conjunto, estes resultados são fundamentais na concepção de inibidores alvo de HDAC para o tratamento de câncer e outras doenças.

Uma vista próxima destes ensaios clínicos com pequena molécula HDACi indicou o ácido hidroxâmico ou

N

grupo -hydroxyacrylamide desempenhar um papel importante na actividade de HDAC [11], [12]. Nós relatado anteriormente identificação dos compostos-1-sulfonamida contendo indolina com actividade anticancro aparente [13], [14]. Com base nas observações anteriores, que concebido e sintetizado uma série de nova classe de inibidores de histona-desacetilase. Entre eles, 3- (1-benzenossulfonil-2,3-di-hidro-1H-indol-5-il) –

N

hidroxi-acrilamida (MPT0E028) tem a melhor actividade inibidora de HDAC. Neste estudo, nós examinamos as atividades antitumorais de MPT0E028 em várias linhas celulares de cancro a partir do painel de células de câncer do NCI-60. Foram investigados os efeitos de MPT0E028 sobre a progressão do ciclo celular e apoptose e explorado possíveis mecanismos moleculares que estão na base da sua actividade anti-cancro. Além disso, examinou-se o efeito de MPT0E028 sobre o crescimento de células HCT116 do cancro colo-rectais humanos

in vivo

, utilizando um modelo de xenoenxerto de tumor, o que confirmou o efeito antitumoral de MPT0E028. Os nossos resultados sugerem que MPT0E028 é um candidato terapêutico promissor para o tratamento de cancros humanos.

(a) NaBH

3CN, AcOH, 0 ° C-t.a .; (B) (i) cloreto de benzenossulfonilo, piridina, refluxo; (Ii) LiAlH

4, THF, 0 ° C-t.a .; (Iii) dicromato de piridínio (PDC), peneiras moleculares, CH

2 Cl

2, t.a .; (C) (i) metilo (triphenylphosphorylidene) etilo, CH

2Cl

2, t.a .; (Ii) LiOH a 1 M

(aq), dioxano, 40 ° C; (D) (i) NH

2OTHP, PYBOP, Et

3N, DMF, t.a. .; (Iii) ácido trifluoroacético, CH

3OH, t.a. Abreviaturas: NaBH

3CN, cianoboro-hidreto de sódio; AcOH, ácido acetil; LiAlH

4 (LAH), hidreto de alumínio e lítio; THF, tetra-hidrofurano; PDC, dicromato de piridínio; NH

2OTHP,

O

– (tetra-hidro-2H-piran-2-il) hidroxilamina; PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfato; Et

3N, trietilamina; DMF, dimetilformamida; TFA, ácido trifluoroacético.

Materiais e Métodos

Materiais

MPT0E028 e SAHA foi sintetizado pelo laboratório do Dr. Jing-Ping Liou. (Faculdade de Farmácia da Faculdade de Farmácia da Universidade de Medicina Taipei, Taiwan), e a pureza é mais de 98% (dados S1). RPMI 1640, M199, soro fetal de bovino (FBS), penicilina, estreptomicina, e todos os outros reagentes de cultura de tecidos foram obtidos a partir de Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). Os anticorpos contra várias proteínas foram listados como se segue: a-tubulina, PARP, actina, conjugado com HRP anti-ratinho, e anti-IgG de coelho eram de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EUA); 3 histona, actina, acetil-μ-tubulina foram de sinalização celular foram de Cell Signaling Technologies (Boston, MA, EUA); caspase 3 era de Imgenex (San Diego, CA, EUA); histona acetil-3 era de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EUA). iodeto de propídio (PI), sulfo-rodamina B (SRB), e todos os outros reagentes químicos foram obtidos de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA).

Cultura celular

A linha celular de cancro colorrectal humano HCT-116, linha celular de cancro da mama MDAMB231 e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). linha de células de cancro do ovário NCI-ADR foi obtido a partir da tela de linha de tumor Célula humana DTP (Programa Therapeutics Desenvolvimento, NCI). células HCT116, MDAMB231 e NCI-ADR foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (v /v) e penicilina (100 unidades /mL) /estreptomicina (100 ug /mL). As HUVEC foram cultivadas em M199 com 20% de soro inactivado por calor de bovino fetal (v /v) e penicilina (100 unidades /mL) /estreptomicina (100 ug /mL). Todas as células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO

2/95% de ar.

(a) Efeito, dependente da concentração de MPT0E028 SAHA e no crescimento celular. As células HCT116 foram incubadas sem ou com as concentrações indicadas de MPT0E028 ou SAHA durante 48 h. O crescimento celular foi avaliada pelo ensaio de SRB. Os dados foram expressos como média ± S.E.M. de pelo menos 3 experiências independentes. (B) Os efeitos dependentes da concentração de MPT0E028 SAHA e na progressão do ciclo celular. As células HCT116 foram tratadas sem ou com as concentrações indicadas de MPT0E028 ou SAHA durante 24 h e foram analisadas por citometria de fluxo para a distribuição do ciclo celular. (C, D) Os dados apresentados são as médias de pelo menos 3 experiências independentes. (E) efeitos dependentes do tempo de MPT0E028 e SAHA sobre a população subG1. As células HCT116 foram tratadas com ou sem 1 ^ M MPT0E028 SAHA ou para o intervalo de tempo indicado e foram analisadas por citometria de fluxo para a população subG1. (F) MPT0E028 induzida por caspase 3 e a activação de PARP. As células HCT116 foram tratadas com ou sem a concentração indicada de MPT0E028 ou SAHA durante 24 h sujeitas a Western blot para a caspase 3 e análise de PARP. (L) MPT0E028 induzida apoptose celular dependente de casepase. células HCT116 foram tratados sem ou com 3 mM MPTE028, SAHA ou 20? M z-VAD-fmk por 24 horas e submetidos a western blot para caspase 3 e análise PARP.

NCI-60 linhas de células de pesquisa

o NCI-60 linhas celulares de cancro triagem foi realizada pelo Programa de desenvolvimento Therapeutics do NCI (DTP; https://www.dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html).

Sulforodamina B Ensaio

HCT116, células MDAMB231 e NCI-ADR foram semeadas em placas de 96 poços em meio com soro fetal bovino a 5% durante a noite. As células foram fixadas com 10% tricloroacético representando população de células no momento do tratamento com fármaco (

T

0). Após a incubação com o veículo (0,1% DMSO), ou MPT0E028 SAHA durante 48 h, as células foram fixadas com ácido tricloroacético a 10% e, em seguida, coradas com sulforrodamina B a 0,4% (w /v) em 1% de ácido acético. O excesso de Sulforodamina B foi lavado com ácido acético a 1% e as células contendo corante foram lisadas com 10 mmol de base /l de Trizma. A absorvância foi lida sob comprimento de onda de 515 nm. Ao medir o tempo zero (

T

0), o crescimento de controlo (

C

), e o crescimento celular na presença do fármaco (

T

x

), o crescimento percentual foi calculada. inibição do crescimento percentual foi calculada como 100 – [(

T

x Restaurant –

T

0) /(

C Restaurant –

T

0)] × 100. A inibição do crescimento de 50% (GI

50) é determinado na concentração de droga que resulta na redução de 50% do aumento total de proteína em células de controlo durante a incubação composto.

Ensaio de Violeta Cristal

O As HUVECs foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (5000 células /poço) em quadruplicado. Após 24 h de incubação, as células foram fixadas com 0,1% de violeta de cristal /metanol a 20%, representando a população de células no momento do tratamento com fármaco (

T

0). Outras células foram tratadas com MPT0E028 ou SAHA durante 48 h. Após 48 h de incubação a 37 ° C, as células foram coradas com 0,1% de violeta de cristal /20% de metanol durante 10 minutos e lavou-se por 3 vezes. Em seguida, o corante foi fluido por M de citrato de sódio /etanol a 75% a 0,1, e a absorvância é medida a 550 nm.

(A) Inibição da actividade de HDAC em extractos nucleares de HeLa. Os dados foram expressos como a média de pelo menos 3 experiências independentes. (B) Inibição da actividade total de HDAC por MPT0E028 e SAHA. As células HCT116 foram tratadas com as concentrações indicadas de MPT0E028 e SAHA durante 24 h, e as proteínas nucleares foram isolados para determinar a inibição da actividade total da enzima HDAC. Os dados são expressos como a média ± S.E.M. de pelo menos 3 experiências independentes.

Citometria de Fluxo FACScan

Após o tratamento de veículo (0,1% DMSO), ou MPT0E028 SAHA para os cursos de tempo indicados, as células foram colhidas por tripsinização, fixadas com 75% (v /v) de álcool a 4 ° C durante a noite. Após centrifugação, as células foram incubadas em 0,1 mol /L de tampão de ácido cítrico fosfato-[0,2 mol /l NaHPO

4, 0,1 mol L /ácido cítrico (pH 7,8)] durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram centrifugadas e ressuspensas com 0,5 ml de solução PI contendo Triton X-100 (0,1%, v /v), ARNase (100 ug /mL), e PI (80 ug /mL). teor de ADN foi analisada com o software CellQuest e FACScan (Becton Dickinson).

células HCT116

(A) foram tratados com MPT0E028 e SAHA durante 24 h nas concentrações indicadas. Os lisados ​​celulares foram preparados e sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferência utilizando acetil-histona H3, histona H3, acetil-α-tubulina, e anticorpos alfa-tubulina. A análise quantitativa de western blot com ImageQuant (Molecular Dynamics, EUA); acetil-histona H3 (B) e acetil α-tubulina (C) foram analisados ​​em células HCT116.

HDAC bioquímicos Assays

O HDACs

in vitro

atividades de HDAC recombinante humana 1, 2, 4, 6 e 8 (BPS Biosciences) foram detectados por libertação fluorigênico de 7-amino-4-metilcoumarina de substrato sobre a actividade enzimática desacetilase. concentração inibitória máxima metade (IC

50) é determinado na concentração de droga que resulta na redução de 50% de aumento de actividade de HDAC em poços de controlo durante a incubação composto.

Todos os tumores cresceram até a 1,200 mm

3 volume de endpoint. Os tumores (A) foram medidos regularmente e atraso de crescimento foi calculada para os grupos de tratamento em relação aos tumores de controlo (TGD). análise de sobrevivência (B) de Kaplan-Meier foi baseado no ponto final do crescimento do tumor. (C) Inibição de curvas de crescimento de tumor representada uma média ± SEM e variação percentual no volume médio do tumor (TGI por cento). (D) Os pesos corporais foram medidos diariamente durante a primeira semana e, em seguida, 2 vezes por semana. A proporção de peso corporal foi calculada em relação à medida de referência. (E)

In vivo

efeito de MPT0E028 sobre a expressão da caspase 3, PARP, H3 histona-acetil-acetilo e μ-tubulina em tumores de xenoenxerto de HCT116 como determinado por Western blotting.

HeLa nuclear Extract HDAC Ensaio de actividade

a actividade de HDAC extracto nuclear de HeLa foi medida usando o Ensaio de actividade fluorescente de HDAC Kit (BioVision, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante [15]. Resumidamente, o tampão de substrato e o ensaio fluorimétrico de HDAC foram adicionados a extractos nucleares de HeLa num formato de 96 poços e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. A reacção foi parada pela adição de desenvolvedor lisina, e a mistura foi incubada durante mais 30 min a 37 ° C. controlos negativos adicionais incluíram a incubação sem o extracto nuclear, sem o substrato, ou sem ambos. TSA em 1 uM serviu como o controlo positivo. Um leitor de placas de fluorescência com excitação a 355 nm e emissão a 460 nm foi utilizada para quantificar a actividade de HDAC. Metade concentração inibitória máxima (IC

50) é determinada na concentração da droga que resulta em redução de 50% do aumento da atividade de HeLa HDAC no grupo de controle durante a incubação composto.

Total de HDACs enzimática Ensaio de Actividade

atividade enzimática total HDACs foi determinada utilizando o Boc-Lys (Ac) -AMC fluorom�rica kit de ensaio a actividade de HDAC (BioVision, mountain View, CA, EUA). As células HCT116 foram tratadas com MPT0E028 e SAHA durante 24 h. As células foram então recolhidas e os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​usando um Kit de Ensaio de Actividade de HDAC fluorométrico (k330-100; BioVision). Um leitor de placas de fluorescência com excitação a 355 nm e emissão a 460 nm foi utilizada para quantificar a actividade de HDAC. Metade da concentração máxima inibitória (IC

50) é determinado na concentração de droga que resulta na redução de 50% do aumento total na actividade de HDAC grupo de controlo.

Análise Western Blot

Após o tratamento de veículo (0,1% DMSO), ou MPT0E028 SAHA nas concentrações indicadas, as células foram lavadas com PBS arrefecido. Para lisado total de, as células foram lisadas com 120 mL de gelo frio de tampão de lise [10 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1 mmol /L de EGTA, 1 mmole /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug /mL de aprotinina, 10 ug /mL de leupeptina, 1 mM de orthovandate de sódio, NaF 1 mM e 1% de Triton X-100]. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 13000 rpm durante 30 min. Para a análise de Western blot, a quantidade de proteína (40 ug) foi separada por electroforese em gel de poliacrilamida a 10% ou 15% e transferida para um (PVDF) da membrana de difluoreto de polivinilideno. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente em PBS leite desnatado /5%, a membrana foi lavada com PBS /0,1% e incubadas com os anticorpos indicados a 4 ° C durante a noite. Após as lavagens com PBS /0,1% de Tween 20, os anticorpos secundários correspondentes foram aplicados para as membranas durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram então lavadas com PBS /0,1% de Tween 20 e a detecção de sinal foi realizado com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).

In vivo

Implantação e Tumor

crescimento

As células de adenocarcinoma colo-rectal HCT116 humanos utilizados para implantação foram colhidas durante a fase de crescimento logarítmico e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato a 5 × 10

7 células /mL. Cada rato foi injectado s.c. no flanco direito com 1,0 × 10

7 células (0,2 suspensões celulares mL). Os tumores foram monitorados duas vezes por semana e, em seguida, diariamente como os seus volumes aproximou 1.200 mm

3. O tamanho do tumor, em mm

3, foi calculada a partir de: onde

w =

largura e

l =

comprimento em mm do tumor. Tumor volume = (

w

2

×

l

) /2. Todos os experimentos com animais seguiu as normas éticas e protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Uso de Animais e do Comité de Gestão da Universidade Nacional de Taiwan (IACUC homologação: 20100225)

Ratos

Fêmea camundongos nude-atímicos. tinham 8 semanas de idade, e tinha uma gama de peso corporal (BW) de 17,2-22,0 g, em D1 do estudo. Os animais foram alimentados com água ad libitum (osmose inversa, 1 ppm Cl) e PicoLab Dieta para Roedores de modificação 20 e irradiada Lab Diet ™ que consiste em proteína de 20,0% bruto, 9,9% de gordura bruta, e 4,7% de fibra bruta. Os ratos foram alojados na National Taiwan University Laboratório Central de Animal, NTUMC, em um ciclo de luz de 12 horas em 21-23 ° C e 60-85% de umidade.

Análises Estatísticas e gráficos

o teste de logrank foi usado para determinar o significado estatístico da diferença entre os valores de TTE de dois grupos, excepto quaisquer mortes NTR. As análises estatísticas e gráficos foram realizados com Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. As análises estatísticas bicaudais foram realizados no

P

= 0,05. Curvas de Kaplan-Meier mostram a percentagem de animais que permaneceram no estudo em função do tempo. Os gráficos de Kaplan-Meier utilizar os mesmos dados definidos como o teste logrank.

O crescimento do tumor curvas mostram o volume tumoral mediano grupo, numa escala logarítmica em função do tempo. Quando um animal sai do estudo devido ao tamanho do tumor ou morte TR, o volume do tumor finais registrados para o animal é incluído com os dados utilizados para o cálculo da mediana em momentos posteriores. Por conseguinte, o volume de tumor mediano final mostrada pela curva pode ser diferente do MTV, que é o volume médio do tumor para os ratinhos que permaneceram no estudo no último dia (excluindo todos com tumores que tenham atingido o ponto final). Se ocorre mais do que uma morte TR em um grupo, as curvas de crescimento do tumor são truncados no momento da última medição que precede a morte segundo TR. As curvas de crescimento do tumor também são truncados quando os tumores em mais de 50% dos animais avaliáveis ​​em um grupo ter crescido para o volume de extremidade. (*

p Art 0,05; **

p Art 0,01; ***

p Art 0,001; em comparação com o respectivo grupo de controlo).

In vitro

Statistical Analysis

os dados foram expressos como média ± SEM do número indicado para experimentos separados. A análise estatística dos dados foi realizada com o one-way ANOVA seguido pelo

t

teste, e

p Art 0,05 foram considerados significativos. (*

p Art 0,05; **

p Art 0,01; ***

p Art 0,001; em comparação com o respectivo grupo de controlo).

A síntese de MPT0E028 (1) é representado na Figura 1. comercialmente disponível metil indol-5-carboxilato de metilo (2) foi feito reagir H2> resultados

A síntese de MPT0E028

com cianoboro-hidreto de sódio na presença de ácido acético para se obter o metil indolina-5-carboxilato de metilo (3) com um rendimento de 93%. O

N

1-sulfonilação de indolina (3) com cloreto de benzenossulfonilo em piridina e, em seguida, LiAlH

4 mediada por redução de éster de C5, seguido pela oxidação PDC produziu o desejado 1-benzenesulfonylindoline-5-carbaldeído (4) em 42% de rendimento (3 passos). reacção de Wittig de metil (trifenilfosforanilideno) acetato de metilo com o 4T indolina-5-carboxaldeido e de tratamento de hidróxido de lítio (LiOH) em MeOH deu ácido cinâmico (5) com um rendimento de 73%. A conversão do ácido carboxílico (5) para o ácido hidroxâmico (1) foi realizado com um rendimento de 72% pelo tratamento de NH

2OTHP na presença de PyBOP e Et

3N, seguido de desprotecção mediados por ácido trifluoroacético. A informação experimental detalhado para a preparação de MPT0E028 está disponível na seção suplementar.

O Efeito da MPT0E028 sobre a proliferação de linhas celulares de cancro

Para determinar se MPT0E028 exibe atividade anti-câncer no câncer humano células, testou-se a actividade anti-proliferativa de MTP0E028 utilizando linhas de células de cancro do painel de rastreio da NCI-60 [16]. Como mostrado na Tabela 1, MPT0E028 inibiu significativamente a proliferação de células em todas as linhas celulares de cancro humano examinadas em concentrações micromolares, mas foi especialmente potente na linha celular HCT116. Por isso, escolhemos células HCT116 para estudos da atividade anti-câncer do MPT0E028

in vitro

e

in vivo

.

MPT0E028 induzida significativamente HCT116 celular apoptose

em primeiro lugar, foi demonstrado que MPT0E028 inibe o crescimento de células HCT116 de um modo utilizando o ensaio SRB dependente da concentração (GI

50 = 0,09 ± 0,004 mM) (Figura 2A). Duas outras linhas celulares, MDA-MB-231 e NCI-ADR a partir do painel de triagem do NCI-60, também foram escolhidos para analisar a sensibilidade dos MPT0E028 (MDAMB231, GI

50 = 0,19 ± 0,04 mM; NCI-ADR, GI

50 = 0,14 ± 0,02 uM). MPT0E028 também inibiu significativamente a proliferação celular nestas duas linhas celulares (dados S2a, S2B) mas mostrou menos sensível em relação a HCT116. Também determinou a margem de segurança de MPT0E028 em células humanas normais (por exemplo HUVEC) e descobriu que MPT0E028 mostrar 20-40 dobras menos sensíveis contra células normais (GI

50 = 3,57 ± 0,45), sugerindo MPT0E028 visa especificamente células de tumor maligno (S2C de dados). Para investigar o efeito de MPT0E028 na progressão do ciclo celular, o conteúdo em ADN celular foi medida por citometria de fluxo. Nós mostramos que o tratamento com MPT0E028 aumentou o número de células na fase sub-G1 do ciclo celular (Figura 2B e 2C). O composto de referência foi um HDACi, ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA; vorinostat), com uma IG

50 de 0,82 ± 0,07 ^ M, que exibiram uma actividade antiproliferativa (Figura 2A) e a apoptose induzida em células HCT116 (Figura 2B e 2D) em um modo dependente da concentração, mas mostrou menos eficaz em comparação com MPT0E028. Tal como mostrado na Figura 2E, MPT0E028 também induziu população sub-G1 de um modo dependente do tempo, enquanto que o SAHA mostrou efeito mais fraco e retardada citotoxicidade. MPT0E028 também induziu activação de caspase 3 e PARP de um modo dependente da concentração (Figura 2F). apoptose induzida por MPT0E028 foi abolida quando co-tratamento com inibidor de caspase-z-VAD-fmk, sugerindo que MPT0E028 apoptose induzida pela via dependente de caspase. Estes resultados sugerem que induzido MPT0E028 células HCT116 citotoxicidade através da via da apoptose.

MPT0E028 é um inibidor de HDAC Actividade

próxima examinou o efeito de MPT0E028 sobre a actividade de HDAC, utilizando um painel de proteínas HDAC recombinantes humanos e comparou a sua actividade para SAHA. Como mostrado na Tabela 2, MPT0E028 inibiu significativamente HDAC1 e HDAC2 de classe I, bem como de classe HDAC6 Ilb em baixas concentrações nanomolares. Enquanto MPT0E028 foi mais potente do que a SAHA contra HDAC1 recombinante e 2, que tem pouca actividade contra HDAC4 e HDAC8 recombinante, que é semelhante ao padrão inibidora de SAHA. Confirmou-se que a actividade de HDAC inibida MPT0E028 nuclear na linha celular de adenocarcinoma cervical HeLa (IC

50 = 11,1 ± 2,8 nM) e em células HCT116 (IC

50 = 4,43 ± 0,5 uM), que eram aproximadamente 9-30 vezes mais potente do que a SAHA (IC

50 = 118,8 ± 13,2 nM e 129,4 ± 13,9 uM, respectivamente) (Figura 3A e 3B). O efeito inibidor de HDAC potentes MPT0E028 também pode ser observada em MDAMB231 e células NCI-ADR (dados S3). Estes resultados sugeriram que MPT0E028 é um novo e potente inibidor de HDAC.

Efeitos de MPT0E028 sobre α-tubulina e Histona H3 A acetilação em células HCT116

Como α-tubulina e histona H3 são alvos a jusante comuns de HDAC, foram examinados os efeitos de MPT0E028 sobre α-tubulina e histona H3 acetilação em células HCT116 utilizando análise de western blot. Como mostrado na Figura 4, MPT0E028 induzida forte hiperacetila�o de histona H3 do que a SAHA (Figura 4A e 4B), o que é consistente com o seu efeito inibidor potente na classe I de HDAC1 e 2. Em contraste, a SAHA exibiu mais potente acetilação α-tubulina que MPT0E028 (Figura 4A e 4C), sugerindo que SAHA é mais potente contra a classe IIb HDAC6, o que é consistente com a nossa descoberta na Tabela 2.

MPT0E028 inibe o crescimento de cólon humano Cancer xenoenxertos

in vivo

Finalmente, foi avaliada a eficiência do MPT0E028 e SAHA usando

in vivo

xenotransplantes HCT116 tumor em um nu modelo de ratos (Figura 5A e 5B) (Tabela 3). Uma vez que um tumor era palpável com o tamanho de cerca de 55 milímetros

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de controlo e de tratamento de veículo (8 ratinhos por grupo). Os ratinhos de controlo receberam o veículo (0,5% de carboximetilcelulose de + 0,1% de Tween 80). Tumores em todos os 3 grupos foram autorizados a chegar a um volume de endpoint de 1.200 mm

3. O tempo mediano até ao ponto final (TTE) para os ratos de controle foi de 16,6 dias. Em murganhos que foram tratados por via oral com SAHA (200 mg /kg, por dia), o ETT aumentou para 27,0 dias, o que corresponde a um T-C de 10,0 dias e um atraso do crescimento do tumor por cento (TGD) de 63%. De acordo com a análise logrank, SAHA produzida atividade antitumoral significativa (

P

= 0,0251). O tratamento oral com MPT0E028 (200, 100, e 50 mg /kg, diariamente) aumentou o ETT médio para 36,9, 19,2 e 15,5 dias, respectivamente, correspondendo a um TC de 20, 2,6, e 0 dias e um por cento TGD de 122 %, 16%, e 0%, respectivamente. Com base na análise de logrank, MPT0E028 exibe actividade antitumoral significativa a 200 mg /kg (

P

= 0,0031). Notavelmente, 3 ratos num grupo que foram tratados com 200 mg /kg MPT0E028 e um rato em um outro grupo que foi tratado com 100 mg /kg MPT0E028 mostrou regressão completa do tumor após o tratamento (Tabela 3). Além disso, os murganhos também foram doseados uma vez por dia durante 15 dias por meio de administração oral para avaliar a inibição do crescimento do tumor após o tratamento MPT0E028. verificou-se que o crescimento do cancro HCT116 células xenoenxertos foi suprimida por 73,5%, 32,0%, e 21,9% (percentagem de inibição do crescimento do tumor [TGI] valores) após o tratamento com MPT0E028 a 200, 100, e 50 mg /kg, respectivamente, enquanto SAHA de 200 mg /kg suprimiu o crescimento do tumor de 47,7% (% TGI) (Figura 5C). Não foi observada diferença significativa no peso corporal ou outros efeitos adversos no tratamento com MPT0E028 (Figura 5D). Determinou-se também o efeito de MPT0E028 sobre a expressão de caspase3, PARP, H3 histona acetil-e-acetil-tubulina μ

In vivo

em tecidos de tumor de xenoenxerto de HCT116. Os ratinhos foram tratados com 200 mg /kg ou MPT0E028 SAHA durante 7 dias (por via oral, por dia) e, em seguida, os tumores foram cuidadosamente removidas e sujeitas a análise de Western blot. Como mostrado na Figura 5E, caspase 3, PARP e H3 acetil-histonas foram substancialmente induzida no grupo tratado com MPT0E028 enquanto acetil-μ-tubulina foram encontrados mais profundamente no grupo tratado com SAHA, o que é consistente com a nossa conclusão

in vitro

. Tomados em conjunto, MPT0E028 induzida um atraso dose-dependente e inibição do crescimento do tumor e apresentaram atividade anti-tumoral forte

in vivo

de SAHA.

Discussão

HDACs são alvos importantes para a terapia do cancro devido à sua capacidade de regular a transcrição da expressão de genes que estão envolvidos na proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [17], [18]. HDACi estão actualmente em ensaios clínicos para o tratamento de tumores sólidos e em pacientes com leucemia. Dois HDACi, SAHA e FK228, ter recebido a aprovação FDA para o tratamento de pacientes com linfoma cutâneo de células T. Neste estudo, que refere a síntese de um novo composto químico 3- (1-benzenossulfonil-2,3-di-hidro-1H-indol-5-il) –

N

hidroxi-acrilamida (MPT0E028), que tem uma actividade potente HDACi. MPT0E028 foi concebido com base na nossa pesquisa prévia com agentes desestabilizadores microtúbulos utilizando indolina-1-arilsulfonamidas como uma estrutura de núcleo [13], [14]. Após acoplamento de um

N

-hydroxyacrylamide grupo funcional na posição 5 do anel de indole, que proporcionou o MPT0E028 desejado.

Além disso, avaliou-se a actividade anti-cancro de MPT0E028 i

n vitro

e

in vivo

. Descobrimos que MPT0E028 citotoxicidade induzida em várias linhas de células humanas de câncer do NCI-60 painéis e realizou estudos sobre os mecanismos em células HCT116, que apresentou alta sensibilidade à MPT0E028. Quando comparado com SAHA, o tratamento com MPT0E028 induzida inibição mais forte da célula cancerosa (GI

50 = 0,82 ± 0,07 mM e 0,09 ± 0,004 M, respectivamente), mas não o crescimento celular normal (GI

50 = 3,57 ± 0,45 mm) e produziram um número significativamente maior de células (apoptose) sub-G1, tal como determinado por citometria de fluxo. Além disso, MPT0E028 induzida mais profundamente caspase 3 e ativação de PARP. Tomados em conjunto, MPT0E028 inibe o crescimento de células cancerosas e induz a morte celular por apoptose.

Nós demonstramos que MPT0E028 inibe a atividade de HDAC1, HDAC2 e HDAC8 na classe I, bem como HDAC6 na classe IIb, mas não HDAC4 em sala de aula IIa, e induz consistentemente acetilação da histona H3 e α-tubulina. HDACs de classe I têm sido mostrados para ser sobre-expressos em células de câncer colorretal humanos [19], que podem contribuir para a proliferação de células cancerígenas perturbado, diferenciação e apoptose tanto pela modificação epigenética ou não epigenética [20], [21]. A inibição da actividade de HDAC induziu a via apoptótica intrínseca e extrínseca, que leva à morte de células de cancro [22], [23]. Além disso, HDACi poderia induzir a expressão de p21 por meio da estabilização e indução de actividade de transcrição de RUNX3, levando à indução de apoptose de células de cancro [24], [25]. A inibição da actividade de HDAC por MPT0E028 era 10-30 vezes mais forte do que por SAHA em células HeLa e células HCT116.

Finalmente, examinámos a eficiência de MPT0E028 contra o crescimento celular de adenocarcinoma colo-rectal humano HCT116 em ratinhos. crescimento tumoral mediano e análise da curva de Kaplan-Meier demonstraram forte actividade antitumoral de MPT0E028. A administração diária de MPT0E028 resultou em actividade antitumoral significativa. Além disso, em comparação com SAHA, MPT0E028 apresentou actividade antitumoral mais forte. Com base nestes resultados, MPT0E028 é um romance HDACi sintético com propriedades farmacológicas únicas que devem ser testados na terapia do cancro colorectal humano.

Em resumo, nós identificamos um novo inibidor da actividade de HDAC, MPT0E028, com atividade antitumoral

in vitro

e

in vivo

. Os resultados aqui apresentados mostram que MPT0E028 inibe a atividade HDACs e tem propriedades anti-tumorais que são mais potentes do que a SAHA, que está atualmente em uso clínico em linfoma de célula T subcutânea. Assim, MPT0E028 é adequado para testes adicionais como um agente anti-câncer romance.

Informações de Apoio

Dados S1.

Química. ressonância magnética nuclear (

1H RMN) foram obtidos com Bruker DRX-500 espectrómetro (a operar a 500 MHz), com o desvio químico em partes por milhão (ppm,

δ

) abaixo do TMS interno como um padrão. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) foram medidos com um espectrómetro de massa JEOL (JMS-700) de impacto de electrões (EI).