Abstract

As mutações no

gene TP53 Quais são as alterações mais comuns em tumores humanos.

TP53

padrões de mutações têm sido por vezes ligado a carcinógeno exposição. No carcinoma hepatocelular, um G específica transversão T no códon 249 é classicamente descrita como uma impressão digital de aflatoxina B

1 exposição. Da mesma forma G transvers�s T nos códons 157 e 158 têm sido relacionados com a exposição ao tabaco em cânceres de pulmão humano. No entanto, controvérsias permanecem sobre a interpretação do

TP53

padrão mutacional em tumores como a impressão digital de exposição genotoxin. Usando um ensaio funcional, a análise funcional de alelos Separado em Levedura (FASAY), o presente estudo descreve o padrão mutacional de

TP53

em fibroblastos humanos normais após

in vitro

exposição ao bem- agentes cancerígenos conhecidos: benzo

[a] pireno

, a aflatoxina B

1 e acetaldeído. Estes

in vitro

padrões de mutações foram então comparados com aqueles encontrados em tumores humanos, utilizando o banco de dados da IARC de

TP53

mutações. Os resultados mostram que o

TP53

padrões de mutações encontradas em tumores humanos pode ser apenas parcialmente atribuída a genotoxin exposição. A interação complexa entre o impacto funcional das mutações no fenótipo p53 e a história natural do câncer pode afetar esses padrões. No entanto, nossos resultados suportam fortemente que a exposição genotoxinas desempenha um papel importante na etiologia dos cânceres considerados

Citation:. Paget V, Lechevrel M, André V, Le Goff J, Pottier D, Billet S, et al . (2012) Benzo

[a] pireno

, Aflatoxina B

1 e acetaldeído mutacional Padrões em

Gene TP53

Usando um ensaio funcional: Relevância para Cancer Etiologia Humano. PLoS ONE 7 (2): e30921. doi: 10.1371 /journal.pone.0030921

editor: Andy T. Y. Lau, da Universidade Shantou Medical College, China

Recebido: 26 de agosto de 2011; Aceito: 26 de dezembro de 2011; Publicação: 03 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Paget et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du travail (AFSSET; Convenção n ° EST-2007-48), o Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (Convenção n ° 16848-2005), a Région Nord-Pas de Calais (Convenção n ° 08.070.005) e da Ligue Nationale Cancer Contre le, Comité de l’Orne. Os Unité de Chimie environnementale et Interactions sur le Vivant (UCEIV-EA 4492) trabalha em parceria com o Institut de Recherches en environnement Industriel (Ireni), que é financiado pela Région Nord-Pas de Calais, o Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, e fundos europeus (FEDER). V.P. recebeu uma bolsa de pós-doutoramento da região Nord-Pas de Calais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mutações somáticas são um evento chave na carcinogênese e é agora bem reconhecido que a carcinogénese envolve fatores genéticos hereditários, bem como mudanças epigenéticas. O ponto de viragem durante a iniciação do câncer é a aquisição de mutações somáticas específicas que confere às células uma vantagem seletiva para a proliferação clonal. Entre os muitos genes diferentes envolvidos neste processo,

TP53

continua sendo a mais frequentemente mutado em cancros humanos, representando mais de 70% de todas as mutações descritas até agora em cancros humanos [1]. A Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC)

TP53

banco de dados de mutação contém 27.580 somática

TP53

mutações (https://www-p53.iarc.fr/, R15 release) [2] . Em contraste com outros genes supressores de tumores, a grande maioria de

TP53

mutações são missense em vez de sentido directo ou mutações não frameshift, levando a vários padrões em diferentes tipos de cancro. Curiosamente, estes padrões têm sido por vezes ligada a exposição de factores etiológicos tais como a luz UV em carcinoma da pele [3], o tabaco em cancros do pulmão [4], aflatoxina B

1 em hepatocarcinoma [5] ou o ácido aristolochic em carcinoma renal [ ,,,0],6], [7]. No entanto, a interpretação do

TP53

padrão mutacional em tumores como uma impressão digital de exposição genotoxin permanece controverso [8]. De facto, mutações que resultam da exposição a genotoxinas e outros eventos celulares que surgem durante a carcinogénese afectar o perfil mutacional finais encontradas em tumores humanos, por exemplo selecção clonal de mutantes particulares, a instabilidade genética em células cancerosas ou influências epigenética (por exemplo, estado de metilação) [9] – [11]

Como muitos

TP53

mutações encontradas nos tumores afectar fortemente a p53. propriedades funcionais [12], um ensaio funcional, a análise funcional de alelos Separado em Levedura (FASAY) aparece como uma técnica útil para distinguir entre mutações silenciosas em

TP53

e aqueles que tornam a proteína inativa [13], [14]. ADN a partir de uma variedade de fontes pode ser rastreada por FASAY para a presença de um

TP53

alelo codificando uma proteína disfuncional. Nós previamente descritos padrões de mutação em fibroblastos humanos normais após

in vitro

exposição ao acetaldeído e aflatoxina B

1 (AFB

1) usando FASAY [15], [16]. Aqui, nós ter completado estes dados com os obtidos com uma genotoxin bem conhecido: benzo

[a] pireno

(B

[a]

P). A exposição a B

[a]

P e AFB

1 resulta na formação de adutos volumosos predominantemente segmentação guanina. Vamos discutir como estes podem levar a funcionalmente diferentes padrões de mutações em tumores diferentes.

Além disso, o experimentalmente gerado

TP53

padrões de mutação foram comparados com aqueles em tumores relacionados gravados no banco de dados da IARC [ ,,,0],2]. O padrão mutacional do B

[a]

P foi em comparação com aqueles dos cancros do pulmão e discutido exaustivamente no presente trabalho. Isto permitiu-nos para discutir a causalidade de exposição genotoxinas aos padrões de mutações de câncer humano.

Materiais e Métodos

linha celular e cultura de células

fibroblastos diplóides humanos AG1521 (Coriell Institute , Camden, NJ) foram escolhidos para este estudo. Ausência de mutações pré-existentes em

TP53

lócus nestas células foi confirmada por sequenciação do ADN genómico com um Sequenciador Automatizado Beckman (CEQ 8000). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar, em Eagle Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com soro bovino fetal inactivado a 10% (FBS). Antes da exposição à genotoxin, o meio foi completado com 200 ul (4%) de fracção de microssomas de fígado S9 de ratos tratados e phenobarbital–naphtoflavone (Biopredic, Rennes, França), NADPH (4 uM) e g6p (5 mM). A quantidade necessária de B

[A] (número Sigma, CAS: 50-32-8, até 200 uM)

P foi diluída no meio acima e utilizado para tratar as células durante 2 h a 37 ° C . Pós-exposição, as placas de cultura foram lavadas três vezes com PBS e incubadas em meio fresco. À medida que o tempo de duplicação destas células é de cerca de 3 dias, período de incubação de uma semana foi escolhido para permitir que dois ciclos celulares e assegurar a fixação de mutações.

A citotoxicidade estudo

AG1521 fibroblastos foram expostos a B

[a]

P em concentrações de 1 a 200 uM na presença de S9, durante 2 h a 37 ° C em 96 poços de micro-placas. As placas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 3 dias a 37 ° C. A citotoxicidade foi avaliada com um ensaio XTT (Sigma) de acordo com o protocolo Scudiero [17].

Pós-rotulagem

método Post-rotulagem foi adaptado de Reddy e Randerath [18]. O ADN genómico foi extraído utilizando o método do fenol /clorofórmio clássica após o tratamento por ARNase A e T1 seguido de proteinase K (Sigma-Aldrich) e ensaio de pós-marcação foi então realizada como previamente descrito [19]. A partir dos auto-radiogramas assim obtido, para os pontos correspondentes aductos foram excisados ​​para medição da radioactividade. Os resultados são expressos como Níveis aduto relativos (RAL), calculado como se segue: RAL = (cpm

adutos /cpm

BPDE) × 110,7 × 10

-8, onde cpm

adutos e cpm

BPDE correspondem a contagens por minuto a partir dos pontos excisadas e do controlo positivo emitido a partir de timo de vitela expostos a B

[a]

P-7,8-diidrodiol-9,10-epóxido (BPDE), e transportando 110,7 adutos para 10

-8 nucleótidos normais, conforme medido em outros lugares [20]. O controlo positivo foi gentilmente fornecido por F. Beland, Jefferson, EUA.

FASAY

extração de RNA e transcrição reversa (RT)-PCR foram realizadas como descrito anteriormente [15]. Para amplificar os iniciadores de ADNc contendo uma ligação fosforotioato na extremidade 3 ‘foram desenhados: P3 [5′-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA (s) de C-3′] e P4 [5’-ACC-CTT-TTT-CTT GGA-GTG-CAG-GCT-GGA-GT-(s) G-3 ‘]. FASAY foi feito de acordo com Flaman

et al.

[14], com algumas modificações, como descrito anteriormente [15]. Plasmídeo pSS16 e cepa de levedura YIG397 foram generosamente doados pela JM Flaman (INSERM U614, Rouen, França) e J. Cachot (LEMA EA3222, Le Havre, França), respectivamente

TP53

. – plasmídeos que expressam foram resgatados de colônias vermelhas isoladas que foram devolvidas à cultura e lisadas com

Zymolyase

(MP-Biomedicals). Breve PureLink plasmídeo miniprep Kit® (Invitrogen) foi utilizado para resgatar os plasmídeos. Antes de sequenciamento,

cDNA TP53

foi re-amplificado com iniciadores P5 [5′-TCT-GTC-ACT-TGC-ACG-TAC-TCC-3 ‘] e P6 [5’-AGA-GGA-GCT -GGT-GTT-GTT-GG-3 ‘], projetado para cobrir o exão 4-9 de acordo com a sequência descrita no GenBank (NM_000546). Dois conjuntos de iniciadores foram escolhidos para sequenciar os locais de recombinação de ambos os lados do

cDNA TP53

: em 5 iniciadores da região ‘PA [5’-CAG-TCA-GAT-CCT-AGC-GTC-GAG-3 ‘] e PB [5′-CTC-CGT-CAT-GTG-CTG-TGA-TC-3’]; a 3 ‘PC iniciadores da região [5′-AAG-GAA-ATT-TGC-GTG-TGG-AG-3′] e PD [5’-CAG-GCC-CTT-CTG-TCT-TGAAC-3 ‘].

ferramentas seqüência análise

o banco de dados Thierry Soussi (https://p53.free.fr/) foi utilizada uma referência para o

TP53

sequência de tipo selvagem e o banco de dados da IARC liberação R14 (https://www-p53.iarc.fr/) foi utilizado para a comparação de diferentes

TP53

padrões de mutações [2]. ferramenta BLAST de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) foi utilizado para análise das semelhanças de sequência.

A análise estatística

A análise estatística foi feita usando o software SAS libertar 9.2. Um teste do qui-quadrado com um grau de liberdade foi aplicado para avaliar a correspondência entre as freqüências observadas e teóricas de mutações fora das substituições de bases nos exons 4 a 9. As comparações entre os padrões de substituições que pertencem aos genotoxinas foram feitas usando o teste exato de Fisher . Todos os testes foram duas faces com um nível de significância de 0,05.

Resultados

estudos de citotoxicidade em fibroblastos AG1521

O crescimento celular após 2 horas de exposição da AG1521 fibroblastos humanos para B

[a]

P em várias concentrações mostrou uma citotoxicidade moderada de B

[a]

P nestas condições, o IC50 foi estimado ser acima de 200 pM (Figura 1). Então, escolheu concentrações de exposição variando de 1 pM correspondente à concentração mais elevada sem qualquer inibição do crescimento a 50 um que corresponde a uma inibição de crescimento de 25%. Assim, o dano celular foi minimizado e retomada da cultura era mais fácil após a exposição. A gama de concentrações de acetaldeído e AFB

1 utilizados foram previamente descritas e discutidas [15], [16]. Acetaldeído foi usado em 0,1-7,5 mM e AFB

1 a 16-800 nM.

citotoxicidade do B

[a]

P para fibroblastsAG1521 humanos após 2 horas de exposição e 3 dias de recuperação (4 poços por concentração, médias e desvios-padrão).

Post rotulagem de B

[a] adutos de DNA induzida

P

Figura 2a mostra o padrão de DNA adutos volumosos após 2 horas de exposição a B

[a]

P 1, 10 e 50 uM na presença da fracção de metabolização exógeno (S9mix). O controlo positivo foi obtido a partir de ADN de timo de vitela nu exposto a 35 nM BPDE, o metabolito activo (Figura 2B). Um dos principais pontos de migrar de forma semelhante nas placas de cromatografia em camada fina era visível nas quatro amostras. Após B

[a]

exposição P, um segundo, mas muito fraco local também foi observado para os 2 maiores concentrações. O RAL no DNA de B

[a]

células expostas-P após metabolização exógeno foram significativamente superiores ao limite de quantificação de 1,75 × 10

-8. Este valor foi determinado após um processo interno de validação (dados não publicados). Isto demonstra a eficácia do processo de metabolização. No entanto, um efeito patamar é atingido a 10 uM.

(A) células AG1521 após 2 horas de exposição a B

[a]

P. (B) de ADN de timo de vitela após exposição a 35 nM B (a) P-7,8-diidrodiol-9,10-epóxido (controlo BPDE). valores RAL são a média de dois ensaios independentes.

As taxas de mutação em FASAY

A Tabela 1 mostra os resultados globais para o B

[a]

P. Cada concentração foi testada em triplicado. Como reprodutibilidade entre triplicados foi muito alta, o número total de colónias para cada concentração é mostrado.

Entre as colônias vermelhas que surgem a partir de células de controlo não tratadas, apenas algumas mutações urso na parte central da

TP53

, ou seja exons 4 a 9. as outras colónias vermelhas foram consideradas como artefatos como eles realizados plasmídeo pSS16 não digerido ou mutações localizadas nos locais de recombinação. Entre as 3 colónias vermelhas de células de controlo possuindo uma mutação na parte central de

TP53

, 2 mostraram uma inserção AGT no exão 7/8 que é provável que um defeito de splicing, em vez de um verdadeiro evento mutacional, como descrito anteriormente [15]. É digno de nota que a taxa de este defeito splicing foi comparável entre as experiências com os três genotoxinas discutidos aqui. Apenas uma verdadeira mutação foi encontrada nas células de controlo, permitindo o cálculo de uma taxa de mutação espontânea de 0,05%. Esta taxa foi de cerca de 9 a 18 vezes menor do que as taxas de mutação calculados em células expostas. Esta única mutação espontânea, era uma G A transição dentro de uma sequência CpG no codão 267 (CGG TGG). Este tipo de mutação é classicamente atribuída a desaminação espontânea da 5-metilcitosina, embora não se possa excluir a possibilidade de um erro introduzido pela ADN-polimerase durante a etapa de RT-PCR

.

As taxas de mutação em células expostas eram constituídos entre 0,45-0,92%. Como observado com dados pós-rotulagem, um platô é alcançado a 10? M.

Identificação

TP53

mutações no B

[a]

P exposta fibroblastos humanos AG1521

a Tabela 2 mostra os verdadeiros 37 mutações encontradas em B>

células expostas-P. Cinco mutações foram um ou mais de base inserções /eliminações, levando a um desvio de enquadramento. As mutações remanescentes foram substituições de nucleotídeo único, incluindo um absurdo e 25 mutações missense. O padrão mutacional é mostrada na Figura 3C: L transversões de T foram as mais prevalentes (8/37, 21,6%). Eles são seguidos por G A, G A em CpG e a transições G (7/37, 18,9% para cada um deles), deleções (4/37, 10,8%), L transversões de C (2/37 , 5,4%), a transversões de T (1/37, 2.7%) e uma base de inserção (1/37, 2.7%). Este padrão mutacional é então discutida em comparação com o que anteriormente obtido após AG1521 fibroblastos exposição ao acetaldeído (Figura 3A) e aflatoxina B

1 (AFB

1, Figura 3B) [15], [16].

(A)

In vitro

Acetaldehyde expostas fibroblastos humanos AG1521 (FASAY) (n = 35 mutações, os dados a partir de [15]), (B)

In vitro

AFB

1-exposta fibroblastos humanos AG1521 (FASAY) (n = 37 mutações, os dados de [16]), (C)

In vitro de pousadas

[a]

fibroblastos humanos expostos-P AG1521 (FASAY) (n = 37 mutações).

Localização de mutações entre

TP53

exons 4 a 9

a Figura 4 mostra a localização das mutações de B

[a]

P (este estudo), AFB

1 e acetaldeído [15], [16]. B

[a]

P padrão mostra dois hot-spots, códons 248 e 127, enquanto AFB

1 hot-spots são códons 179 e 220 e os acetaldeído códons 248, 245 e 283.

padrão mutacional como visto em fibroblastos AG1521 após B

[a]

P (barras de laranja, n = 32 mutações); AFB

1 (barras de rosa, n = 29 mutações); e acetaldeído (barras azuis, n = 32 mutações) exposição. Códons digitadas em itálico são as principais hot-spots em tumores humanos de acordo com a base de dados da IARC.

A fim de avaliar se o padrão de B

[a]

P mutações poderia ser uma questão do acaso, foram analisados ​​os dados como descrito por Shen

et al.

[21]. Para esta análise de hot-spots, apenas substituições de bases que ocorrem nos exões 5-9 foram tomados em conta. Hot-spots foram definidos como as 24 mutações que respondem por 50% das mutações relatados no câncer de pulmão no banco de dados R14 IARC. Em ordem decrescente de freqüência, estes são códons: 273, 248, 249, 245, 158, 157, 175, 179, 282, 220, 242, 163, 176, 154, 280, 266, 298, 237, 193, 281, 159, 135, 234 e 244. Se estes 24 hot-spots foram assumidos a ser mutado aleatoriamente, então eles seria previsto para ser atingido 24/205 (número total de códons nos exons 5 a 9), ou seja, com uma frequência de 11,7 %. Dos 30 substituições de bases nos exões 5 a 9, no nosso estudo, 11 (36,7%) correspondem a um dos pontos de acesso acima identificados para os cancros do pulmão, uma taxa significativamente mais elevada do que o previsto para acontecimentos aleatórios (11,7%; p = 2,10

-5). A mesma análise foi realizada usando ou apenas hot-spots encontrados no cancro do pulmão de fumantes, ou outra definição de hot-spots, ou seja, frequência de mutação superiores a 2% de todas as mutações como proposto por Olivier

et al.

[ ,,,0],22]. Estas análises foram altamente significativos sejam quais forem os parâmetros usados ​​(dados não mostrados).

Estas observações, em conjunto com a comparação dos locais de mutação com o câncer de pulmão hot-spots como mostrado acima, argumentam fortemente contra uma distribuição aleatória de mutações no nosso ensaio

Discussão

Iremos abordar duas questões importantes:. em primeiro lugar, são experimentalmente gerados perfis de mutação representativos daqueles que ocorre naturalmente para um determinado genotoxin? Em segundo lugar, baseado em uma compilação de dados experimentais e epidemiológicos sobre mutações associadas a tumores humanos, pode mutações do

TP53

em locais específicos quimicamente induzida (códons) ser identificado como um evento chave na carcinogênese?

Relação entre B

[a]

P mutagenicidade e

TP53

mutações

Muitos metabólitos genotóxicos são produzidos a partir de B

[a]

P. A forma principal, que envolve CYP1A, CYP1B, CYP3A e epóxido hidrolases, leva ao metabolito genotóxico final (±) -anti-BPDE que se liga ao DNA e formas predominantemente adutos de DNA no

N2

posição de guanina e em menor escala, no

N6

posição de adenina [23] – [25]. Outra via envolve diidrodiol desidrogenases AKR1A1 e 1C1-4 que oxidam B

[a]

P dihydrodiols para catecóis [26]. Catecóis pode então submeter oxidizations mono-eletrônicos levando a

o

-quinones que formam adutos de DNA, como o B

[a]

P-7,8-dione-

N

2

-dG eo B

[a]

P-7,8-dione-

N

6

-da [27], [28]. Neste estudo, durante a exposição de fibroblastos AG1521 para B

[a]

P, enzimas metabolizadoras foram fornecidos exogenamente, de acordo com as práticas padrão em testes de genotoxicidade. A análise pós-rotulagem revelou uma mancha principal que co-migrou com o observado no DNA de controle expostos ao BPDE. Isto sugere fortemente que B

[a] resultados

P exposição predominantemente em adutos BPDE-DNA.

De acordo com os dados da literatura, descobrimos que a maioria das substituições de bases induzida por B

[a]

P estavam localizados em G: pares de bases C dos quais apenas 6 dentro das regiões CpG. Guaninas em seqüências CpG metiladas são alvos típicos para adutos de DNA [10], [23]. É provável que a metilação do ADN é pobre em um modelo celular, tais como a uma empregue aqui, mas Shen

et ai.

, Usando a mesma estirpe de levedura transformada por plasmídeos repórter quimicamente modificados, observou-se que a metilação do DNA não afectou a geração de adutos BPDE [21].

Usando UvrABC endonuclease em combinação com PCR (LMPCR) mediada por ligadura, a distribuição de adutos BPDE em exons 5, 7 e 8 do

TP53

em As células HeLa foram mapeados [29], [30]. formação de aduto forte ocorreu nos guaninas nos códons 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 e 273, a maioria dos quais são descritos como hot-spots em cancros do pulmão (157, 158, 245, 248 e 273; IARC banco de dados, a versão R14). Na verdade, o códon 248 foi mais frequentemente alvo de B

[a]

P em nosso ensaio. Em segundo lugar, usando metilado e fragmentos de DNA contendo o exão 5 da BPDE-expostos

TP53

, adutos foram encontrados em três outras codões: 152, 175, 181, todos os quais foram descobertos no presente estudo também [10] .

B

[a]

P padrões de mutações induzidas têm sido extensivamente estudadas em muitos genes em vários sistemas biológicos. Os ensaios realizados em células de roedores

in vitro

ou

in vivo

em genes repórter, tais como

HPRT

ou

LacI

têm consistentemente relataram a predominância de G transversões de T e, em menor extensão, da G a transições e deleções [31] – [34]. A taxa de G T transversões parece ser [31], dependente da concentração. Curiosamente, usando um ensaio de levedura com diferentes estirpes deficientes na reparação de excisão de nucleótidos, foi demonstrado que as polimerases de ADN e η ζ foram necessárias em combinação para a reparação translesão através aductos BPDE, levando a L transversões de T [35]. Pol ζ sozinho também foi capaz de gerar grandes deleções neste ensaio.

Dependendo da abordagem experimental, foram observadas discrepâncias entre os padrões de mutações em

TP53

induzida pela

in vitro

e

in vivo

exposição ao B

[a]

P ou BPDE. Utilizando o mesmo ensaio de levedura como nós, mas após uma exposição BPDE direta de um plasmídeo desnaturado tendo o ser humano

TP53

sequência, Yoon

et al

ter encontrado uma clara predominância de G . Transvers�s T Considerando Shen

et al

ter encontrado principalmente G . A transição [11], [21]. A sequenciação directa de

TP53

no homem-p53 knock-in (Hupki) fibroblastos embrionários murinos após

in vitro

exposição ao B

[a]

P mostraram principalmente G transvers�s T [36], [37]. Da mesma forma, G mutações T também foram encontrados predominantemente em tumores de pele após B

[a]

exposição P [38]. A sequenciação do

TP53

de vários tumores induzidos depois de

in vivo

exposição de ratos para B

[a]

P ou alcatrão de carvão levou à mesma medida de G T , G mutações C [39]; A e G T transversion é a marca do B

[a]

P ou exposição BPDE. A este respeito, fomos surpreendidos ao encontrar esses transvers�s respondendo por apenas 22% das mutações no nosso estudo, mas passando de 17% em 1 mM a 27% a 50? M. Como sugerido por Wei

et ai.

[31], que pode ser uma questão de dose. Muitos

in vitro

estudos têm utilizado BPDE na faixa? M [11], [35] enquanto que nós utilizamos B

[a]

P no mesmo intervalo, o que obviamente levou a uma menor exposição para BPDE em nosso protocolo. Alguns

in vitro

estudos utilizaram B

[a]

P no intervalo? M, mas nestes estudos, o tempo de exposição variou de 4 a 9 dias em vez das 2 horas em nosso protocolo [ ,,,0],36], [37]. Isto sugere que o G transvers�s T poderia ser a marca de uma forte exposição a B

[a]

P, um cenário que parece plausível no contexto da exposição à fumaça do tabaco em fumantes pesados, enquanto que a exposição moderada pode levar para a G T, G a, L C e deleções, como encontrado em diversos estudos. Esta hipótese é suportada pela prevalência de G T transversões em cancros do pulmão no que diz respeito à exposição do tabaco. De acordo com o banco de dados da IARC (Figura 5), ​​essa prevalência varia de 25% nos não fumadores e 32% em fumantes e 55% em fumantes pesados ​​

Da esquerda para a direita:.

in vitro

B

[a]

fibroblastos humanos expostos-P AG1521 (FASAY) (n = 37); cancros do pulmão humanos, não fumantes (n = 288); cancros humanos pulmão, fumantes (n = 870); cancros do pulmão humanos, fumantes pesados ​​(n = 20). dados de câncer de pulmão a partir de banco de dados IARC R14. mutações raras foram omitidos nesses padrões

Por outro lado a taxa de G . T transversion, encontramos uma alta taxa de G A transições (38%), metade dos quais sendo localizado em sequências CpG . Isso pode ser parcialmente explicada por mutações espontâneas como pode ser visto nas células de controlo. Mas um viés técnico pode ser considerada desde o nosso protocolo não distinguir entre dois decorrentes independentemente, mas idênticos eventos de mutação e uma das seguintes situações: (i) vários transcritos de mRNA da mesma célula mutante que são posteriormente capturado de forma independente em plasmídeos ou (ii) a expansão clonal de uma célula mutante antes da colheita do conjunto de células tratadas. Na Tabela 2 apenas 3 mutações podem ser potencialmente relevante de tal viés, o que sugere que a duplicação artefatual de mutações pode ser pouco frequentes. Além disso, mutações duplicados são na sua maioria G A transições em locais CpG. Isso pode erroneamente aumentar a taxa de esta mutação particular.

Comparação de

TP53

perfis mutacionais obtidos para os genotoxinas, B

[a]

P, acetaldeído e AFB

1 |

os resultados obtidos a partir da aplicação de FASAY para avaliar os efeitos mutagénicos da

in vitro

exposição de fibroblastos humanos normais para B

[a]

P, acetaldeído e AFB

1 foram comparados. O teste exato de Fisher revelou que, em termos do tipo de mutação, B

[a]

P e AFB

1 padrões não foram estatisticamente diferentes (p = 0,6735), enquanto que as diferenças entre os padrões para acetaldeído e quer B

[a]

P ou AFB

1 foram estatisticamente de significância limítrofe (valores de p de 0,0546 e 0,0705, respectivamente). Estes três compostos são conhecidos por causar vários tipos de danos de ADN, que poderia, por sua vez, estar relacionadas com mutações específicas. padrão induzida por acetaldeído é caracterizado principalmente por uma proporção muito elevada de G A transições (66%), principalmente localizado dentro de sequências CpG, que é uma base provável para a formação de aductos de ligação cruzada intercadeias em sequências CpG [15]. Em contraste, a taxa elevada de G transvers�s T observada entre B

[a]

P- e AFB

1 induzidas mutações, tem sido reconhecida como uma característica da sua mutagenicidade,

in vitro Comprar e

in vivo

[4], [40]. Isto é principalmente atribuível à presença de adutos volumosos

B

[a]

P padrão revela duas características únicas em comparação com aqueles de AFB

1 e acetaldeído:. A ocorrência de G transições C e uma maior taxa de exclusões (11% vs 5-6%). Considerando AFB

1 e acetaldeído induzida eliminações de base única, B

[a]

P poderia gerar deleções até 24 nucleotídeos. Este recurso pode ser o resultado de uma determinada via de síntese translesão de B

[a]

adutos P como discutido acima.

Assim, uma análise preliminar usando o FASAY nos permitiu gravar e distinguir diferentes experimentalmente gerados padrões de mutação no

TP53

, que foram então usados ​​para comparar com os dados epidemiológicos existentes em mapas de adutos de DNA e mutações de tumor em

TP53

.

Ocorrência de experimental

TP53

mutantes em tumores humanos e impacto funcional de mutações

a distribuição agrupada dos códons mutantes obtidos após a exposição a cada um dos três genotoxinas discutidos aqui nos permitiu identificar 6 grandes hot-spots em humanos tumores, códons 248, 273, 175, 245, 282, 249 (Figura 4).

ao nível fenotípico, entre as 63 mutantes resultantes de uma substituição de nucleotídeos, os dois mais frequentemente recuperados em tumores humanos também foram encontrado em nossos padrões experimentais, ou seja Arg175His e Arg248Gln (Tabela 3). Além disso, quatro substituições (Arg175His, Arg248Gln, e Arg273Cys Gly245Ser) representam em conjunto mais do que 10% dos mutantes encontradas em tumores humanos. Apenas três mutantes foram encontrados no nosso estudo nunca foram descritos nos tumores humanos (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Isto sugere fortemente que FASAY recupera mutantes portadores de uma alteração funcional permitindo a seleção durante o processo de carcinogênese.

Foi avaliada a conseqüência funcional de mutações que ocorrem depois de

in vitro

exposição aos três produtos químicos no luz do dados de Dearth

et al.

que analisou o impacto de 76

TP53

mutantes frequentemente observada em tumores humanos [12]. Catorze dos 76 mutantes analisados ​​foram recuperados em nossos três padrões experimentais (Tabela 3). Como esperado, estes 14 mutantes eram desprovidas de atividade em

RGC

sequências que foi utilizado em nosso protocolo FASAY. Esta análise indica que a maioria das mutações experimentais porto maior prejuízo funcional, isto é, a perda completa da actividade de transcrição em 22 As sequências de ADN de ligação de p53 (DBS) e efeito dominante negativo (DNE). Por outro lado, algumas das mutações que são frequente em tumores humanos não são susceptíveis de ser obtidos pelo FASAY porque retêm actividade de transcrição [12]. Isto inclui, por exemplo, Arg175Leu ou Glu285Lys que não foram encontrados no nosso ensaio.

No entanto, a análise funcional de mutantes por FASAY não nos permitem discriminar entre diferentes tipos de cânceres. Na verdade, se FASAY nos permitem recuperar mutantes que ocorrem com frequência em tumores humanos, estes mutantes não eram nem particularmente frequentes, nem pouco frequente em tumores relacionados com a exposição a um genotoxin particular. Por exemplo, Arg175His e Arg248Gln encontrado em B

[a]

P e AFB

1 padrões são os mutantes mais frequentemente identificado em tumores humanos, respondendo por 4,25% e 3,21% de todos os mutantes respectivamente (Tabela 3), mas eles representam apenas 1,2% dos cancros do pulmão ou mutantes hepatocarcinoma de acordo com a base de dados da IARC. Da mesma forma, Arg273Cys descritos no padrão de acetaldeído é mais frequente no espectro total humano tumor (2,44%) do que nos que para o câncer esofágico (1,3%).

Esta análise destaca a capacidade de produtos químicos para induzir freqüente e altamente prejudicada

TP53

mutantes que podem ser um evento-chave envolvidos na carcinogênese. Em comparação com os ensaios de mutagénese clássicas usando genes repórter, este

in vitro

abordagem funcional fornece fortes argumentos para a plausibilidade biológica de carcinogenicidade para uma genotoxin. No entanto, ele recapitula apenas o passo inicial da carcinogênese e, consequentemente, é imprecisa para prever quais determinada mutação poderia ser uma força motriz durante os passos subsequentes de carcinogênese em um dado tecido.