Abstract

Wogonin é uma planta que monoflavonoid tem sido relatado para inibir o crescimento celular e /ou induzir a apoptose em diversos tipos de tumores. O presente estudo examinou o mecanismo de actividade e subjacente de indução de apoptose de ação da wogonin em células A549. Os resultados mostraram que wogonin era um inibidor potente da viabilidade de células A549. Alterações nas proteínas apoptóticas detectada após exposição a wogonin incluíram diminuição de XIAP e de Mcl-1 de expressão, o aumento da expressão clivado-PARP e aumento da libertação de AIF e cytotchrome análise de mancha ocidental C mostrou que a actividade de c-Myc /Skp2 e vias HDAC1 /HDAC2, que desempenham papéis importantes em progresso do tumor, foi diminuída. Quantitative PCR identificou o aumento dos níveis de ARNm de c-Myc e diminuição dos níveis de sua proteína. Os níveis de proteína de Fbw7α, GSK3β e Thr58-Myc, que estão envolvidos em c-Myc degradação dependente de ubiquitina, também foram analisados. Após a exposição ao wogonin, Fbw7α e expressão GSK3β diminuiu e expressão Thr58-Myc aumentada. No entanto, MG132 foi incapaz de evitar a degradação do c-Myc. Os resultados deste estudo sugerem que wogonin tem múltiplos efeitos anti-câncer associados à degradação da c-Myc, Skp2, HDAC1 e HDAC2. A sua capacidade para induzir apoptose independente de Fbw7α sugere uma possível utilização em cancro de resistência a drogas relacionadas com a deficiência de Fbw7. Mais estudos são necessários para determinar quais caminhos estão relacionados com c-Myc e Fbw7α reversão e se Thr58 fosforilação de c-Myc é dependente GSK3β

Citation:. Chen Xm, Bai Y, Zhong Yj, Xie Xl, longo Hw, Yang Yy, et al. (2013) Wogonin tem múltiplos efeitos anti-câncer, regulando c-Myc /Skp2 /Fbw7α e HDAC1 /HDAC2 Pathways e indução de apoptose em Human Lung Adenocarcinoma A549 Linha celular. PLoS ONE 8 (11): e79201. doi: 10.1371 /journal.pone.0079201

editor: Jian-Xin Gao, Xangai Jiao Tong University School of Medicine, China

Recebido: 23 Janeiro, 2013; Aceito: 20 de setembro de 2013; Publicação: 12 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por subsídios do Ministério da Ciência e Tecnologia da Província de Guizhou, China ([2012] 7006 e NY [2011] 3072); Guangzhou Medical College (2012C16); a Fundação para Jovens Cientistas do Comitê Educacional Guangzhou (2012C118). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar do grande número de ensaios clínicos que visam melhorar a sobrevida do paciente, o cancro do pulmão continua a ser uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, tanto em homens e mulheres. Aproximadamente 85% de todos os casos de câncer de pulmão são categorizados como o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que normalmente é diagnosticada em estágios avançados [1]. Adenocarcinoma pulmonar, o tipo histológico predominante de NSCLC, é responsável por 20 a 30% dos casos de câncer de pulmão primário entre os indivíduos com menos de 45 anos de idade, independentemente do histórico de tabagismo [2]. A maioria dos casos de NSCLC são inadequados para cirurgia e quimioterapia continua a ser a pedra angular do tratamento para a doença avançada.

histona desacetilases (HDACs) são enzimas que removem produtos de acetilação das histonas. Este processo compacta a estrutura de cromatina e reprime a transcrição [3]. As HDAC agir sobre vários substratos proteicos nonhistone que desempenham um papel na regulação da expressão do gene, a proliferação celular, migração celular, morte celular e angiogénese [4]. Dados de estudos pré-clínicos demonstraram que os inibidores de histona desacetilase que ocorrem naturalmente e sintéticos têm potente actividade anti-cancerígena.

HDAC1 e HDAC2 pertencem à classe I de histona-desacetilase família (HDAC). In vivo, estes enzimas formar complexos com Sin3, NURD e [5] Co-DESCANSO. HDAC1 e HDAC2 também ligar-se directamente a proteínas de ligação de ADN, tais como YY1, a ligação da proteína Rb-1 e Sp1 [5].

de c-Myc é um factor de transcrição que é responsável pela regulação de uma variedade de genes envolvidos no celular proliferação, o crescimento, a diferenciação e a apoptose [6]. Desregulada expressão de c-Myc é observada em aproximadamente 70% de todos os tumores humanos [10]. a expressão de c-Myc é regulada por transcrição do gene, e é dependente da estabilidade do mRNA e controlo pós-tradução da estabilidade da proteína [7] – [9].

regulação pós-tradução de c-Myc podem ser mediados por Skp2 (S- fase de quinase associada a proteína 2) e Fbw7 (F-box e repita WD domínio contendo 7) [11]. Skp2 e Fbw7 são duas subunidades de reconhecimento diferentes do SCF-tipo E3 ligase (SCF, Skp1 /Cullin /F-box complexos de proteína) que reconhecem substratos específicos para a degradação proteossómica. Regulamento de c-Myc envolve a fosforilação de c-Myc em Thr58, resultando em degradação proteossómica Fbw7-mediada. Glicogênio sintase-quinase 3β (GSK3β) é a única quinase conhecido para fosforilar c-Myc em Thr58 [24].

Skp2 é um alvo promissor para restringir células-tronco do câncer e progressão do câncer [12], é sobre-expressão é frequentemente observada no cancro humano e pode, portanto, actuar como um oncogene. Em apoio a esta hipótese, Skp2 foi mostrado para reconhecer quinase dependente de ciclina (CDK) inibidores e proteínas supressoras de tumor, tais como p27 KIP1 (1B inibidor de quinase dependente de ciclina), p57 Kip2 (1C inibidor de quinase dependente de ciclina), p130 ( 130 kDa proteína associada a retinoblastoma) e Tob1 (transdutor de erbB-2 1), mas não c-Myc [13] – [16]. formação mediada por Skp2 de ubiquitina a partir de c-Myc ocorre independentemente de fosforilação [25].

deficiência Fbw7 é pensado para ser envolvido na resistência a drogas em cancros humanos [22], [23]. Tem sido mostrado para ser inactivado por mutação, deleção, ou hipermetilação do promotor no cancro da mama [17], [18], o cancro do cólon [19], [20], leucemia e [21]. Fbw7 é expressa como três isoformas diferentes (designadas α, β, e y), respectivamente, localizadas no núcleo, α-β-citoplasma, e γ-nucléolo [26], [27]. Como não existem anticorpos para estes três isoformas utilizou-se o melhor descrito e mais longa das três isoformas Fbw7α, nas nossas experiências com wogonin.

Wogonin (5, 7-di-hidroxi-8-methoxyflavanon) é um naturalmente monoflavonoid extraído de

Scutellaria baicalensis

radix [28] que tem sido reconhecido como um candidato a fármaco anticancerígeno com potencialmente baixa toxicidade [29]. A actividade anti-cancro de wogonin tem sido relatada várias linhas de células humanas, incluindo células de mieloma [30], carcinoma hepatocelular SK-HEP-1 [31] e SMMC-7721 [32], células de cancro glioma [33], células de carcinoma da nasofaringe [meio RPMI 8226 ,,,0],34], as células de câncer de mama humanos [35], [36] e as células HeLa de carcinoma cervical humanos [37]. A sua actividade é mediada pela indução de apoptose e a diferenciação celular, e é regulada por vários genes e proteínas [38] – [41]

Neste estudo, avaliou-se os efeitos de wogonin sobre a viabilidade celular e a apoptose. no adenocarcinoma de pulmão linha celular epitelial humano A549. Nós também avaliou a regulação e função de c-Myc /Skp2 /Fbw7α e HDAC1 /caminhos HDAC2 envolvidos em seu efeito apoptótica.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Wogonin foi comprado de Cantão IDC (China) e MG132 (carbobenzoxi-Leu-Leu-leucinal) foi obtido a partir de (Beyotime, China). Foram utilizados os seguintes anticorpos: Fbw7 (CDC4, H-300) e p-c-Myc (Thr 58) (Santa Cruz, EUA); c-Myc, (factor de indução de apoptose, Grupo Proteintech, Inc., EUA) GSK3β, FIA; HDAC1, HDAC2, Skp2, Survivina, Bcl-2 (linfoma de células B 2), β-Actina (Boster, China); Mcl-1 (leucemia de células mielóides sequência 1), XIAP (inibidor ligada ao X de proteína apoptose, BIOSs, China); Citocromo c (Keygen, China); PARP (poli ADP-ribose polimerase, Sino Inc. Biológica, China).

Cultura de Células

O pulmonar A549 linha de células de adenocarcinoma humano foi obtido a partir do celular Banco do Centro de Experimentação Animal, Norte escola Região, Sun Yat-Sen University. As células utilizadas nas experiências foram mantidos no nosso laboratório em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (Sijiqing, China), a 37 ° C e 5% de CO

2.

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio ( MTT) Ensaio celular Vaibility

células colhidas com tripsina foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 por poço. Após incubação durante a noite, o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas com diferentes concentrações de wogonin. Após a exposição ao wogonin para 24, 48 ou 72 horas, as células foram incubadas com MTT a 37 ° C durante um adicional de 4 h. Isto permitiu desidrogenase mitocondrial para converter MTT em cristais de formazano insolúvel. O meio de cultura foi, em seguida, descartado, e 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazano. A absorção de formazano solubilizado foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas EL340 (Bio-Tek. Instruments, Winooske, VT).

A coloração nuclear

A549 células foram coradas com uma solução DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) kit de coloração (kEYGEN, China). Após exposição a concentrações graduais de wogonin durante 48 h, as células foram lavadas e incubadas com uma solução DAPI de trabalho (1-2 ug /ml) durante 15 min a 37 ° C. As células foram então lavadas com metanol e tampão A (60% de glicerol em 10 mM de fosfato salino tamponado (PBS, pH 7,6)) foi adicionado à suspensão. As células A549 foram visualizadas utilizando um microscópio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japão).

mitocondrial potencial de membrana

O potencial de membrana mitocondrial (Δψm) de células A549 foi medida usimg um fluorescente, lipofílico, catiónico sonda, JC-1 (Beyotime, China), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células expostas a wogonin foram incubadas com solução de coloração 1X JC-1 durante 20 min a 37 ° C. Eles foram então lavadas duas vezes com JC-1 tampão de coloração e as imagens foram tiradas com um microscópio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japão).

Ensaio de Apoptose

As células foram marcadas com FITC anexina V e iodeto de propídio (PI), utilizando um kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC (kEYGEN Biotech, China), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após 48 h de exposição a diferentes concentrações de wogonin, as células foram lavadas com PBS frio e ressuspensas em tamp de ligao 1X. Alíquotas de 10

5 células foram misturados com 5 ul de anexina V-FITC e 5 mL de PI durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. A fluorescência (530 nm) foi detectada por citometria de fluxo (FACS Aria, BD Biosciences, EUA) a 1 h.

-PCR em tempo real A análise

RT-PCR quantitativo foi efectuado utilizando uma SYBR Green repórter. As células A549 foram expostas a wogonin lavadas com PBS e o ARN total foi purificado utilizando RNAiso Plus (TAKARA, Japão). O RNA resultante foi primeiro transcrito de forma inversa em ADNc utilizando um kit de RT PrimeScript® Master Mix (Takara, Japão). iniciadores específicos para o gene foram combinados com SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara, Japão) e amplificadas usando uma máquina em tempo real, PCR ABI 7500 (Applied Biosystems, EUA). Todas as reações de qPCR foram realizadas de forma independente em cinco amostras. A expressão de mRNA relativo foi calculado usando o

-ΔΔCt o método 2. As sequências dos iniciadores utilizados estão listados na Tabela 1.

Análise Western Blot

células foram lavadas com PBS foram lisadas com RIPA (Tris 50 mM (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 % de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, ortovanadato de sódio, fluoreto de sódio, EDTA e leupeptina, (Beyotime, China) suplementado com PMSF inibidor de protease (Beyotime, China). proteínas citoplasmáticas foram extraídos utilizando uma proteína nuclear e citoplasmática extraction kit (kEYGEN Biotech, China).

A concentração de proteína solúvel foi determinada com um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, China). Os lisados ​​celulares foram fervidas durante 5 min em tampão de carga e separado num SDS gel de PAGE. Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore, EUA). as membranas foram bloqueadas com leite desnatado, sondado com vários anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados com HRP, e visualizada com quimioluminescência aumentada (ECL) reagentes de detecção (Beyotime, China).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada usando SPSS versão 17.0 do software. Os resultados são expressos como médias e desvios-padrão (média ± SEM) de pelo menos três experiências independentes. one-way análise de variância (ANOVA) foi utilizada para determinar a significância estatística entre os grupos. Os valores de P 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Wogonin Inibe a viabilidade celular e induz a apoptose celular

A viabilidade celular foi avaliada através de um ensaio MTT em associação com coloração DAPI. e análise de citometria de fluxo após a exposição a diferentes concentrações de wogonin. A análise de MTT indicaram que wogonin viabilidade celular inibida de uma maneira dependente da dose e dependente do tempo (Fig. 1B). (Fig. 1C). Isto foi confirmado pelos resultados da análise por citometria de fluxo utilizando AnnexinV-PI

(A) Estrutura química da wogonin (C

16H

12O

5, MW: 284,27 ). viabilidade (B) celular foi analisada utilizando o ensaio de MTT. As células foram incubadas com wogonin durante 24 h, 48 h ou 72 h. As barras representam os valores médios ± SEM (n = 3). (C) A apoptose avaliado por anexina V /coloração de PI em células A549. As células foram incubadas com wogonin em concentrações de 0, 15, 25, 35 ug /mL, durante 24 h, 48 h e 72 h. (D) núcleo corado por DAPI e observadas por microscópio de fluorescência. As células apoptóticas são indicados por setas. *

P Art 0,05 vs grupo controle, **

P Art 0,01 vs grupo controle

Em comparação com o grupo controle, a taxa de ambos. precoce e fase tardia de apoptose aumentou após exposição a todas as concentrações de wogonin. A taxa de apoptose total foi superior a 50% no grupo de 35 ug /mL.

coloração com DAPI (Fig. 1D) identificados núcleos condensados ​​e clivados em células expostas a 35 ug /mL wogonin, enquanto apenas núcleos claros com azul pálida coloração foram observadas no grupo de controlo.

Como se mostra na Fig. 2A, Wogonin foi associada a uma diminuição dependente da dose no potencial mitocondrial (Δψm) o que resultou na diminuição da fluorescência vermelha (JC-1 de polímero) e o aumento de fluorescência verde (JC-1 monómero). Isso pode ter sido relacionado com a regulação negativa de Mcl-1, pois não houve diminuição evidente nos níveis de Bcl-2. Wogonin também promoveu o lançamento do FIA e do citocromo C para o citoplasma fornecendo mais evidências de dano mitocondrial (Fig. 2C). A sub-regulação de XIAP, survivina, e de fragmentos de PARP clivada indica que o processo de apoptose após lesão continuaram as mitocôndrias (Fig. 2B).

(a) a análise do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) usando JC -1 coloração após a exposição ao wogonin durante 48 h. Um microscópio de fluorescência foi usada para visualizar os resultados. despolarização mitocondrial foi indicado por um aumento na fluorescência verde e uma diminuição na intensidade de fluorescência vermelha. (B) Os níveis de proteína de Bcl-2, Mcl-1, XIAP, PARP survivina e ensaiada por western blot. (C) proteínas citoplasmáticas foram extraídas para análise western blot de lançado citocromo c e FIA. Nestas experiências, as células foram expostas a wogonin 0, 15, 25, 35 ug /mL durante 48 h. *

P Art 0,05 vs grupo controle, **

P

. 0,01 vs grupo controle

Wogonin Down-regula HDAC1 e HDAC2 em Ambas as mRNA e níveis de proteína

Os níveis de proteína de HDAC1 e HDAC2 foram sub-regulada de uma forma dependente da dose após a exposição a diferentes concentrações de wogonin durante 48 h (Fig. 3B). Este resultado é consistente com a sub-regulação de ARNm detectada por qPCR mostrando que HDAC1 foi diminuída de 0,69 vezes e 0,73 HDAC2 por vezes, (incertezas associadas a dobrar-alterações foram 2) (Fig. 3A). Estas alterações podem resultar em um aumento proporcional na acetilação de histonas e promover a expressão de proteínas supressoras de tumor.

(A) os níveis de ARNm relativos de HDAC1 e HDAC2 foram detectados utilizando PCR em tempo real com GAPDH como um controlo interno. Os resultados são expressos como a média ± SEM de cinco experiências independentes.

#

P Art 0,01 vs grupo controle. (B) Os níveis de proteína de HDAC1 e HDAC2 ensaiada por western blot. Nestas experiências, as células foram expostas a wogonin 0, 15, 25 e 35 ug /mL durante 48 h. *

P Art 0,05 vs grupo controle, **

P

. 0,01 vs grupo controle

Wogonin Down-regula c-Myc e Skp2 em o nível de proteína, e aumenta o nível de ARNm de c-Myc

Ambos c-Myc e Skp2 foram sub-regulada ao nível da proteína após exposição a wogonin (0, 15, 25, 35 ug /mL) durante 48 h (Fig. 4B). Como mostrado na Fig. 4A, o nível de mRNA de Skp2 diminuiu 0,81 vezes, enquanto que o nível de mRNA de c-Myc aumentou cerca de 1,6 vezes (incertezas relacionadas a dobrar-mudanças, tanto 2). Estes resultados indicam que uma via de degradação proteossómica pode estar envolvido na regulação da c-Myc e Skp2. No entanto, como wogonin resultou numa diminuição da expressão da proteína em Skp2, experiências adicionais focados no reconhecimento subunidade proteassoma, Fbw7α, que tem como alvo c-Myc.

(A) os níveis de ARNm relativos da c-Myc e foram detectadas utilizando Skp2 PCR em tempo real com GAPDH como um controlo interno. Os resultados são expressos como a média ± SEM de cinco experiências independentes.

#

P Art 0,01 vs grupo controle. níveis (B) das proteínas c-Myc e Skp2 ensaiada por western blot. Nestas experiências, as células foram expostas a wogonin 0, 15, 25 e 35 ug /mL durante 48 h. *

P Art 0,05 vs grupo controle, **

P

. 0,01 vs grupo controle

Wogonin Diminuição Fbw7α e GSK3β, e aumentou Thr58- myc ao nível da proteína

os níveis de proteína de Fbw7α diminuiu após a exposição a wogonin, (Fig. 5B), mas não houve nenhuma diminuição correspondente na expressão de ARNm (Fig. 5A). Thr58 fosforilação de c-Myc aumentou (Fig. 5B). Thr58 fosforilação de c-Myc é um componente obrigatório da sua degradação e é mediada por GSK3β. No entanto, a expressão GSK3β diminuiu em ambos os ARNm (0,78 vezes a 35 ug /mL) (Fig. 5A) e o nível de proteína (Fig. 5B). Estas descobertas sugerem que a fosforilação de c-Myc em Thr58 pode ocorrer independentemente da GSK3β. No entanto, isso requer um estudo mais aprofundado.

(A) os níveis de mRNA relativos de Fbw7α e GSK3β foram detectadas utilizando PCR em tempo real com GAPDH como um controlo interno. Os resultados são expressos como a média ± SEM de cinco experiências independentes.

#

P Art 0,01 vs grupo controle. os níveis de (B) de proteína de Fbw7α, Thr58-Myc e GSK3β ensaiada por western blot. níveis (C) das proteínas c-Myc ensaiada por western blot. Nestas experiências, 1 uM MG132 foi adicionado incubada com ou sem 25 ug /mL wogonin durante 48 h. *

P Art 0,05 vs grupo controle, **

P

. 0,01 vs grupo controle

Os experimentos foram conduzidos com o MG132 inibidor do proteassoma para mais compreender a via de degradação proteossómica envolvida na regulação de c-Myc. Os resultados na FIG. 5C mostram que MG132 foi incapaz de reverter a degradação de c-Myc induzida por 25 ng /mL wogonin. portanto, são necessárias mais pesquisas para definir o percurso exato envolvido na degradação de c-Myc.

Discussão

Wogonin é um monoflavonoid ocorrência natural extraído de

Scutellaria baicalensis

radix [28] . Tem sido relatado como tendo actividade anti-neoplásica em vários tipos de cancro, indução de apoptose e a diferenciação das células [30] – [37], e para ser regulada por vários genes e proteínas [38] – [41]. Sabe-se que o c-Myc /Skp2 /Fbw7α e vias HDAC1 /HDAC2, estão associados com a progressão do tumor. Aqui nós investigar seu papel nos efeitos anticancerígenos de wogonin em células A549 NSCLC.

O primeiro avaliou o anti-viabilidade e os efeitos apoptóticos de wogonin usando MTT e ensaios de dupla marcação anexina V-PI. Os nossos resultados indicaram que wogonin causou inibição dependente da dose e dependente do tempo da viabilidade celular (IC

50 35 ng /ml às 48 h). O aumento no início de taxa de apoptose em resposta a wogonin ocorreu em paralelo, com células de anexina V positiva tornando-se gradualmente anexina-V negativo

.

No IC

50 (/mL 35 ug) de células mostraram evidências de marcada apoptose, de acordo com as alterações na morfologia nuclear observados com coloração DAPI.

a expressão de proteínas relacionadas com apoptose, tais como Bcl-2, Mcl-1, PARP, XIAP, Survivina, citocromo C e foi avaliada a FIA identificar ainda mais os efeitos apoptóticos de wogonin ao nível da proteína. Os resultados indicam que wogonin é capaz de influenciar a estabilidade da membrana mitocondrial e diminuir o potencial de membrana mitocondrial (Δψm). Isto foi evidenciado por JC-1 coloração, diminuição da expressão mcl-1 e a libertação de citocromo C e FIA ​​para o citoplasma. Clivada PARP e diminuição de XIAP e de expressão survivin também pode ter contribuído para a progressão da apoptose.

HDAC1 e HDAC2 estão Classe I HDACs que desacetilar histonas e proteínas não-histona [5]. Eles suprimem a expressão de genes, e modificar proteínas específicas de tumores envolvidos na progressão [4]. Os nossos resultados mostram que os níveis de mRNA e proteína de HDAC1 e HDAC2 foram ambos diminuída na presença de wogonin, indicando que a proteína histona acetilada pode promover a expressão de proteínas supressores do tumor e, assim, inibir a progressão do tumor.

uma inter-relacionamento existe entre c-Myc e Skp2 tal que c-Myc promove a expressão Skp2, e Skp2 Objectivos da c-Myc para degradação dependente de ubiquitina [11], [12], [24], [25]. Nas nossas experiências, wogonin regulada para baixo de c-Myc e Skp2 ao nível da proteína, mas a expressão de ARNm de c-Myc aumentou 1,6 vezes. Estas descobertas sugerem que a via de degradação proteossómica pode ser relacionada com a reversão de c-Myc. No entanto, uma vez que a expressão Skp2 diminuiu, nós nos concentramos nossas novas experiências com Fbw7α, outra subunidade reconhecimento proteassoma que tem como alvo c-Myc.

é necessária Thr58 fosforilação de c-Myc para Fbw7α mediada degradação c-Myc [24]. Como Thr58 é fosforilada por GSK3β, avaliou-se os níveis de Fbw7α, Thr58 c-Myc e GSK3β expressão. Nestas experiências Fbw7α expressão diminuída ao nível da proteína, mas não ao nível do ARNm. Thr58 fosforilação de c-Myc aumentada em certa medida e de expressão GSK3β, tanto a nível de ARNm e de proteína diminuíram. Estes resultados falta destaque da conformidade entre mRNA Fbw7α e os níveis de proteína, a diminuição da expressão de GSK3β, eo aumento da fosforilação de c-Myc em Thr58.

Um estudo anterior demonstrou que a fosforilação de Thr58 em células A549 ocorreu independentemente de GSK3β [42]. No entanto, GSK3β é a única conhecida que quinase fosforila a c-Myc em Thr58. Nos nossos estudos, o inibidor de proteassoma MG132 foi incapaz de impedir a degradação de c-Myc sugerindo que a diminuição da Fbw7α Skp2 e pode estar envolvido neste processo. No entanto, o mecanismo exato envolvido requer mais pesquisas.

Em conjunto os nossos resultados sugerem que a capacidade de wogonin para influenciar diferentes vias bioquímicas podem explicar a sua actividade contra uma variedade de diferentes tipos de câncer. Nossos dados também podem em parte explicar por que algumas células deficientes de genes (por exemplo, aqueles com deficiência Fbw7α) são resistentes a wogonin.