Abstract

Fundo

Withaferin A, que é um esteróide lactona derivada naturalmente, tem sido encontrado para prevenir a angiogénese e metástase em diversos modelos de tumor. Ele também foi reconhecido por diferentes grupos para funções anti-cancerígenos proeminentes. No entanto, apesar destes estudos sobre withanolides, o seu mecanismo anti-metastática de acção detalhado permaneceu desconhecida. O presente estudo tem preparada para enfrentar a maquinaria envolvida na regulação invasão de derivado estável de Withaferin A, 3-azido Withaferin A (3-azidoWA) em células PC-3 HeLa e próstata cervicais humanos.

Métodos e principal Apreciação

-subtóxicas concentração de 3-azidowithaferin a (3-azido WA) inibiu a motilidade das células de cancro e invasão na cicatrização de feridas e invasão na câmara de Boyden por suprimir actividade de MMP-2 em zimografia de gelatina e a sua expressão provou ser um grande obstáculo na quimio-sensibilidade. Descobrimos um novo mecanismo de 3-azidoWA extracelular supressor de tumor candidato pró-apoptótica induzida Par-4 estimulação proteína no meio condicionado, e também notou uma concomitante redução acentuada pAkt e pERK sinalização por análise de imunotransferência. Além disso, os nossos resultados sugerem zimografia 3-azidoWA induzida inibição MMP-2 foi mediada através de secreção Par-4. A inibição de apoptose por 3-azidoWA não podia restaurar a actividade de gelatinase de MMP-2. Além disso, o nosso

in vivo

dados experiências com animais mostraram 3-azidoWA revogada neovascularização em forma dependente da dose no ensaio tampão Matrigel mouse.

Conclusão /Significado

Para este relatório, descobrimos que 3-azidoWA suprimida motilidade e invasão de células HeLa e células PC-3 na MMP-2 modo dependente. Nosso

in vitro

resultado sugere fortemente que doses sub-tóxicas de 3-azidoWA aumentou a secreção de extracelular Par-4 que aboliu a secreção de MMP-2 expressão e atividade. Esgotamento de secretora Par-4 restaurado MMP-2 expressão e invasão capacidade de células HeLa e PC-3. Além disso, as nossas constatações de que implicava 3-azidoWA atenuada fosfo-ERK interna e a expressão de fosfo-Akt em uma maneira dependente da dose pode desempenhar um papel-chave na inibição da angiogénese do rato por 3-azidoWA

citação:. Rah B, Amin H, Yousuf K, Khan S, Jamwal L, Mukherjee D, et al. (2012) A Novel MMP-2 Inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) anula Cancer Cell invasão e angiogênese através da modulação Extracelular Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10.1371 /journal.pone.0044039

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de maio de 2012; Aceito: 01 de agosto de 2012; Publicação: 04 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Rah et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vias secretoras extracelulares são considerados a desempenhar papel central na. fisiologia humana. hormonas vitais do corpo e factores de crescimento que são segregadas e que controlam o desenvolvimento e a diferenciação de órgãos, em condições fisiológicas normais. Da mesma forma, as proteínas sistêmicos (extracelular) atribuem grande

in vivo

função durante o crescimento do tecido e apoptose [1]. Próstata resposta apoptótica 4 (par-4) é expressa ubiquamente e evolutiva de proteína pro-apoptótica conservada cuja expressão foi principalmente correlacionado com as células que sofrem apoptose devido a insultos exógenos [2]. Para além da sua função intracelular, a nova perspectiva de secreção extracelular em células de cancro diferentes tem aumentado o potencial terapêutico de [3] Par-4. Recentemente, Burikhanov et ai. têm mostrado que as células de mamíferos em geral causada secreção de par-4. No entanto, a indução de apoptose por par-4 extracelular que ocorre através da superfície cell- GRP-78 foi encontrado para promover a invasão celular e a tumorigénese [3]. A estabilização de pró-angiogénico GRP-78 por par-4 foi designado um papel anti-invasiva de extracelular par-4.

A metástase é um processo multi-passos que envolve a migração celular e a proteólise pericelular de ECM que medeia células cancerosas protrusão [4]. As metaloproteinases de matriz (MMP ‘s) são responsáveis ​​pela degradação de barreiras ambientais, tais como a membrana basal da matriz extracelular e [5], [6]. Entre os membros da família MMP, MMP-2 e -9 são geralmente considerados como sendo a malignidade de vários tumores, bem como mau prognóstico de muitos cancros [6]. Assim, MMP são capazes de tipo de clivagem colágeno membrana IV cave (MMP-2 e -9) e adicionar valor para o desenvolvimento de medicamentos. estudos pré-clínicos convincentes de diversos laboratórios têm fornecido um apoio esmagador para a relação direta entre MMP-2 sobre expressão e invasão tumoral /metástase [7], [8]. Durante a fase de desenvolvimento, muitos dos inibidores de MMP não nos ensaios clínicos de fase precoce devido a extensa homologia entre os domínios catalíticos de MMP. Além disso, a maioria dos sintéticos inibidores /semi-sintéticos de MMPs foram retiradas durante os ensaios clínicos devido a imprevisto longo prazo intolerância droga reduziu o cumprimento da droga [9]. Por outro lado, recentemente, produtos naturais ou derivados de produtos naturais têm sido considerados extremamente potencial para revogar MMP-2 e -9 mediada invasão /metástase quer

in vitro

ou

in vivo

configurado . Estes incluem extrato aquoso de canela [10], extrato de chá verde [11], a curcumina [12], e saponina esteróide de feno-grego [4], chitooligosacharides (COS) a partir de produtos naturais marinhos [13].

Withaferin A (PI) é um protótipo da classe withanolide de produtos naturais que exibem diversas actividades farmacológicas, incluindo, antitumorais, anti-inf lamatórios, e efeitos imunomoduladores cardioprotectores antiangiogénicos [14], [15]. As propriedades bioactivas de Withaferin A inclui citoesqueleto remodelação por ligação a anexina II [16], anti-angiogénico [17], [18] e actividade antitumoral [19], [20], através da inibição do proteossoma quimotripsina [21] e a indução de apoptose pela inibição de proteína cinase C [22]. Recentemente, Oh et ai demonstraram a activação de caspase-3 através Withaferin A [23]. Para além da sua actividade anti-cancerosa, Withaferin A também foi documentada pela sua propriedade anti-inflamatória através da supressão de alfa-2-macroglobulina [24]. Com o nosso sucesso recente para o desenvolvimento de uma biblioteca de análogos semi-sintéticos Withaferin A, a estratégia de rastreio racional levar à geração de 3-azidoWA, o candidato potente anticancerígeno [25]. Embora a importância da funcionalidade α-β-insaturadas do anel A de Withaferin A e o potencial anticancerígeno de 3-azidoWA tornou-se óbvio, ainda seu modo de ação não estava clara.

Neste estudo foi avaliado o papel mecanicista de 3-azidoWA (3-azido WA), um derivado de azido Withaferin na motilidade e invasão de células cancerosas. Também queríamos co-relacionar este estudo com as vias de sinalização

viz

, ERK, Akt, que são ativados em diferentes tipos de câncer e potencializa invasão e metástase das células cancerosas diversas. Os resultados destes estudos nos fornecer informações importantes sobre o papel mecanicista de 3-azidoWA na revogação da invasão das células cancerosas do colo do útero e da próstata que podem ser en-encaminhado através extracelular Par-4.

Materiais e Métodos

Cultura celular e Anticorpos

Todas as linhas celulares foram adquiridos da Colecção Europeia de Cultura de células (ECACC), de soro fetal bovino (FBS), RPMI-1640, Meio Essencial mínimo (MEM), penicilina G , estreptomicina, Tripsina-EDTA foram obtidos da Invitrogen Corp. 5-difeniltetrazólio (MTT), paraformaldeído, violeta de cristal, A estaurosporina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Dithiothretol (DTT), NP-40, Cocktail de Inibidor de Protease, gelatina, Brij- 35, de Comassie Brilliant Blue (R-250), brefeldina A (BFA), tunicamicina, TRAIL, anexina V-FITC a apoptose kit de ensaio de detecção, dimetilsulfóxido (DMSO), o reagente de Bradford foi obtido a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO ) Propedium Iodeto e Ultracruz DAPI meio de montagem foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Z-VAD Pan inibidor de caspase, recombinante humano VEGF-165 e de FGF recombinante humano (146 aa de base) foram obtidos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). As células foram cultivadas em RPMI 1640 /MEM contendo 10% de soro fetal de bovino na presença de 70 mg /L de penicilina e 0,1 g /L de estreptomicina e foram incubadas a 37 ° C com ar a 95% e 5,0% de dióxido de carbono. Todas as células foram usadas em experiências durante a fase linear de crescimento. Os anticorpos foram obtidos a partir de sequência de fontes comerciais: anti-Par-4, anti-MMP-2, anti-Akt, anti-ERK e anti-TIMP-1 a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), anti-P-Akt de e anti-caspase-3 (Cell Signaling) e anti-β-actina, anti-p-MAPK (Sigma Chemical, St. Louis, MO).

Síntese da 3-azido WA

adicionou-se trietilamina a uma solução de TMSN

3 (1,2 equiv.) em metanol seco (3,0 ml) à temperatura ambiente (TA) para manter o pH de 8,5. Withaferin A (1,0 equiv., 470 mg e 1,0 mmol) foi dissolvido separadamente em metanol seco (2,0 ml) e a solução foi adicionada à solução de metanólica de TMSN

3 e mantida durante 3,5 h a. O progresso da reacção foi monitorizado através de TLC. Depois de se completar, a mistura reaccional foi completamente seco, dissolvido em água (5,0 ml) e extraiu-se com CHCl

3 (10 ml) três vezes para se obter o produto 3-azidoWA. Para azidoWA 3-tratamento, 3-azidoWA foi dissolvido em 100% de DMSO e diluídos com meio de cultura de modo a que a concentração de trabalho de DMSO foi inferior a 0,2%.

Ensaio clonogénico

O ensaio foi realizada de acordo com o método anteriormente descrito [10]. Resumidamente, as células HeLa foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de (1 × 10

3 células /poço) em placas de grau de cultura de tecidos de 6 poços. Após 24 h, o meio de cultura foi mudado e foi adicionado novo meio e as células foram expostas a várias concentrações de 3-azidoWA DMSO /veículo, durante 5 dias a 37 ° C na incubadora de 5% de CO

2. Mais tarde, as colónias obtidas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e foram coradas com solução de violeta de cristal a 0,5%. As colónias das placas foram contadas e média dos campos observadas aleatoriamente (n = 3) e fotografado com a Olympus C-7070 Wide câmera microscópio 700 M invertido.

Proliferação Celular Ensaio

A célula a viabilidade foi determinada pelo método de absorção de corante MTT padrão [10]. Resumidamente, células HeLa, PC-3, A549 e células DU-145 (3 × 10

3 células /poço) foram plaqueadas numa placa de cultura de 96 tecidos bem e tratado com diferentes concentrações de 3-azidoWA em triplicado de modo a que a última concentração de DMSO foi de 0,2% de solvente. Após 48 h de incubação, foi adicionada uma solução de MTT e as células foram cultivadas durante mais 4 h a 37 ° C em 5,0% de CO

2 incubadora. A quantidade de derivado de formazano corado foi determinada medindo a densidade óptica (DO) utilizando um leitor de microplacas TECAN (Infinito M200 PRO) a 570 nm. A viabilidade percentual foi determinado de acordo com o protocolo descrito [10].

Motilidade do zero (Cicatrização de Feridas) Ensaio

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [4]. Resumidamente, células HeLa e células PC-3 foram plaqueadas numa placa de 6 poços a uma concentração de (5,5 × 10

5 células /poço) e deixou-se formar uma monocamada confluente durante 24 h, foi então privadas de soro durante 24 h . Depois que a monocamada foi riscada com uma ponta de pipeta estéril (200 mL), lavou-se com meio isento de soro para remover células e flutuou individual e fotografado (tempo 0 h). As células foram sucessivamente tratados em meio contendo baixo teor de soro (1,0%) em presença de diferentes concentrações de 3-azidoWA (0,25, 0,50, e 0,75 uM), juntamente com veículo de DMSO, durante 24 h. áreas feridos foram progressivamente fotografado com a Olympus C-7070 com 700M de câmara (aumento de 100x) .O percentual de fechamento da ferida foi estimado pela seguinte equação: o fechamento da ferida% = [1- (área ferida em t

1 /ferida área no t

0) x 100%], onde t

1 é o tempo após o ferimento e t

0 é o momento imediatamente após o ferimento.

Immunoblotting

HeLa ou PC-3 de células (1 × 10

6 células) foram incubadas durante a noite e expostas a diferentes concentrações de 3-azidoWA juntamente com DMSO como veículo. As células foram, por conseguinte lavadas com PBS, tripsinizadas e recolhidas após 24 h e, em seguida, lisadas com tampão de lise (HEPES 1,0 mM /L, KCl a 60 mM /L, NP-40 a 0,3%, EDTA 1,0 mM /L, DTT 1,0 mM /L, orthovandate de sódio 1,0 mM /L, PMSF 0,1 mM /L, cocktail inibidor de protease). Os extractos celulares foram centrifugados a 12000 rpm durante 10 min a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford padrão. quantidade igual (20 ug) de proteína de cada amostra foi sujeito a SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para uma membrana (Millipore), bloqueados com 5,0% (w /v) de leite magro em PBS contendo 0,1% de Tween-20 e sondadas com anticorpos relevantes durante 3 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente transferências foram lavadas e sondadas com anticorpos secundários específicos de espécies acoplados a peroxidase de rábano. proteínas imunorreactivas foram detectados por quimioluminescência aumentada mais (Amersham).

A apoptose, anexina V-FITC e PI coloração

seguintes tratamentos com 3-azidoWA /veículo de DMSO, as células aderentes (HeLa e PC- 3) foram colhidas por digestão com tripsina e lavadas duas vezes com PBS arrefecido. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos seguido de incubação com meio de montagem contendo DAPI durante 15 min /temperatura ambiente no escuro e a apoptose foi detectada por microscopia de fluorescência (ampliação de 100x) .A Anexina V-FITC experiências foram realizadas usando a Anexina V -FITC Apoptosis Detection Kit de acordo com o manual do fabricante. Resumidamente, os sedimentos celulares foram ressuspensos em 600 ul de tampão de ligação (HEPES 10 mM [ácido N-2- hidroxietilpiperazina-etanossulfónico-N-2], NaCl 140 mM e CaCl2 2,5 mM, pH 7,4), e coradas com 6,0 ul Anexina V-FITC e iodeto de 10 ul de solução de coloração de propídio durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. As amostras foram sucessivamente analisadas por FACS (BD FACS Aria II) usando software BD Diva.

Gelatina zimografia

A actividade gelatinase de MMP-2 foi avaliada por método padronizado previamente. Por conseguinte, HeLa e células PC-3 em cultura confluente sub (densidade celular ~70-80% da cultura confluente) foi trocado com meio novo e foi mantido durante a incubação com concentrações crescentes de 3-azidoWA durante 48 h. Os meios condicionados obtidos a partir de ambas as amostras tratadas e não tratadas foram empregadas para a estimativa da proteína e uma quantidade igual de proteínas totais (20 ug) foram misturadas com tampão de amostra (2,0% de SDS, 25% glicerol, 0,1% de azul de bromofenol e Tris-HCl a 60, pH 6,8). Gelatina zimografia das amostras foram realizadas utilizando 7,5% de gel de SDS-poliacrilamida contendo 0,1% de gelatina a 100V durante 3 h a 4 ° C. Os geles foram em conformidade enxaguados com tampão de lavagem (2,0% de Triton X-100 em água dd) à temperatura ambiente para remover o SDS, seguido por incubação durante a noite a 37 ° C em tampão de TCNB (Tris-HCl a 50, pH 8,0, CaCl 10 mM

2, 0,02% de NaN

3). Os géis foram corados com azul de Comassie R-250 (Sigma) (0,125% de azul de Comassie R-250, 50% de metanol, 10% de ácido acético) durante 1-1,5 h e descorado com solução de descoloração (20% de metanol, 10% de ácido acético, 70% de água dd). atividade de gelatinase foi detectada pela observação de bandas coradas em um fundo azul Comassie gel corado.

Matrigel Invasion Ensaio

O efeito do tratamento de 3 azidoWA na invasão celular foi determinada utilizando BD Biocoat Tumor Invasion Assay sistema (BD Bioscience, Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células HeLa e PC-3 (1,25 × 10

6) As células foram cultivadas na presença de 0,25, 0,50, e 0,75? M 3-azidoWA ou veículo DMSO durante 24 h em meio isento de soro para a parte superior das câmaras /inserções, e os poços inferiores foram cheias com quimio-atractor (meio completo com 10% de FBS). As células foram deixadas migrar a 37 ° C. Depois de 24 h, os filtros de policarbonato de Matrigel-revestidos foram removidos, as células não-migração foram separados a partir da câmara superior com uma cotonete e o inserto foram fixadas com metanol e coradas com solução de violeta de cristal a 0,1%. Para cada réplica (n = 3), a migração das células foi quantificada por contagem das células marcadas (células por cinco campos) sob microscópio invertido.

Transfecção Transiente

PC-3 e HeLa células foram cultivadas em meio apropriado conforme descrito na seção método, transfectadas com GFP e GFP-Par-4 (generosas doações de Dr. Vivek Rangnekar, da Universidade de Kentucky, KY) usando lipofectamina-2000, de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células com fluorescência verde foram visualizados sob microscópio de fluorescência com câmera e meio condicionado foi utilizado para zimografia.

Imunocitoqu�ica

Para imunocoloração HeLa e células PC-3 foram semeadas em lamelas em placas de 6 poços a uma densidade de sementeira de 0,5 x 10

6 células por poço. Após 24 h, as células foram tratadas com 3-azidoWA (1,0 uM) ou veículo de DMSO e estaurosporina controlo positivo (25 nM) na presença ou ausência de inibidor da pan-caspase durante 48 h. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e fixadas em 2,5% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5,0 min e foi sucessivamente bloqueadas em BSA a 0,5% durante 1 h. Para a detecção da actividade da caspase, as células foram incubadas com anticorpo primário de caspase-3 (1:5000 diluição em tampão de bloqueio) durante 1 h e, consequentemente, lavadas três vezes com PBS, que foi, em seguida, incubadas com vermelho do Texas (Invitrogen) anticorpo secundário conjugado ( 1:10000 diluição) durante 1 h e lavadas, montadas com meio de montagem ultracruz e analisados ​​com Zeiss LSM-510 microscópio metaconfocal. As imagens foram capturadas em 63x de ampliação.

In vivo Matrigel angiogênese Ensaio

Quatro a 6 semanas de idade C57 /BL6J (Indian Institute of Integrative Medicine Animal House Central, Jammu, Índia) foram mantidas a 20-22 ° C num ciclo de luz-escuro de 12 h. Os estudos em animais foram realizados de acordo com protocolos experimentais que foram aprovados pelo comitê de ética animal de Indian Institute of Integrative Medicine, Jammu, Índia. Os animais foram injectados subcutaneamente, nos flancos direito com 0,5 ml de Matrigel gelada (BD Bioscience), suplementado com VEGF-A (250 ng /mL) e bFGF (500 ng /mL). Os ratinhos de controlo foram injectados com Matrigel sem VEGF-A e bFGF. No final de cada estudo os animais foram sacrificados para remover tampões e fotografias que mostram a extensão da vascularização Matrigel foi feita usando Nikon. A neovascularização de tampões de Matrigel foi quantificada usando 4 ml de reagente de Drabkin, adicionando assim homogeneizou 20 ul de Matrigel neovascularised. Após mistura cuidadosa, a absorvância foi medida por espectrofotometria no comprimento de onda de 540 nm para estimar a hemoglobina. A estimativa de hemoglobina foi calculada usando a fórmula Hb (g /dL) = absorvância da amostra /absorvância de concentração × padrão de padrão.

Um estudo preliminar foi realizado para determinar o tempo de neovascularização Matrigel óptima de ignição para desenvolver . A fim de fazer isso, os plugues foram removidos a partir de ratos de controlo (sem adição de VEGF-A e bFGF) no final do dia 4, 7 e 11. Os tampões que continham VEGF-A e bFGF foram removidos a partir de ratos no final do dia 2, 4, 7 e 11 após a injecção de Matrigel. Padronizar o tempo óptimo para a neovascularização, foi realizado um estudo de resposta à dose, utilizando 3-azidoWA em que o composto foi administrado a 1, 10, 20, 30, e 50 mg /kg /d, por via i.p. durante 3 dias (8

th, 9

th e 10

th). No final da duração, tampões de Matrigel foram removidos para a visualização e quantificação. Após a identificação de doses de 3-azido WA que inibe a vascularização, o número de doses para inibir a neovascularização (estudo preventiva) ou interromper vasculatura estabelecida (tratamento de estudo) foi investigada. Para os ratinhos do estudo preventivas foram doseados com (30 mg /kg /d, i.p.) durante 1-4 dias depois de 24 h de Matrigel injecção. Sete dias após a injecção de Matrigel conecta os ratinhos foram sacrificados e os tampões removidos para a visualização e quantificação.

Para o estudo de tratamento, neovascularização foi deixada a desenvolver durante um período de 7 dias. Grupos de animais foram doseados com os compostos no dia 8 (dosagem de 1 dia) ou 8-10 dias (3 dias de dosagem) a 30 mg /kg /d, por via i.p. Os efeitos sobre a vasculatura estabelecido foram avaliadas 11 dias após a injecção dos tampões de Matrigel.

Análises Estatísticas

Os dados foram expressos como média ± SEM. Comparações usado

t

teste de Student. P 0,05 valores foram atribuídos significado

Resultados

3-azidoWA é uma apoptose Anti-proliferativa Agent e induz em células HeLa PC-3 e

Withaferin A é um. agente citotóxico potente e mostraram propriedades inibidores do crescimento em experiências de cultura de células de tumor [19], [26]. Tão bom como molécula parente Withaferin A, o derivado de Withaferin, 3-azidoWA (Fig. 1, A) significativamente exibiram efeito anti-proliferativo num painel de linhas celulares testadas (tendo IC

50 dentro de uma gama de 800 nm – 1,0? M) [25] (Fig. 1, B). Para nova confirmação da apoptose por 3-azidoWA, foi realizada a coloração de anexina V-FITC da 3-azidoWA tratada células HeLa. Como representado na Fig. 1, as células C 59,1% precoce de apoptose em comparação com 72,5% com 25 nM de estaurosporina, apareceu quando as células HeLa foram tratadas com 1,0 uM de 3-azidoWA durante 24 h. Por coloração com DAPI observou-se que 1,0 uM de 3-azidoWA, 0,5 uM não induziu a apoptose em células HeLa e células PC-3 em 24 h de incubação, em comparação com estaurosporina de controlo positivo (Figura 1, D). células apoptoic início A Passaging residual relacionada foram observados nos dados de FACS (com menor concentração de 0,25 mM de tratamento de 3 azidoWA), no entanto, maior concentração (1,0 M) de 3-azidoWA, levam as células no sentido de apoptose com a condensação da cromatina em torno do nuclear periferia acompanhada de redução do tamanho nuclear (pontas de seta brancas, a Fig. 1, D). Caspase-3 activa, quantificado por análise de Western blot mostrou a clivagem de caspase-3 a 1,0 uM de 3-azidoWA tratamento, mas não em doses sub-tóxicos (0,5 uM) (Fig. 1, E). Colectivamente, estes resultados demonstram que o 3-azidoWA é um agente citotóxico potencial e induzir apoptose derivado de produtos naturais.

(A) Síntese de 3-azidoWA. (B) Efeitos de 3-azidoWA sobre a proliferação celular de A549 (cancro do pulmão), PC-3, DU-145 (cancro da próstata) e HeLa (cancro do colo do útero), linhas celulares foram determinadas por ensaio MTT. (C) 3-azidoWA juntamente com veículo de DMSO e células tratadas com estaurosporina controle positivos foram analisadas por FACS, (como indicado); representação gráfica dos resultados mostram percentagem de células não apoptóticas (Q3), precoce de apoptose (Q4), necrótica (Q1) e células apoptóticas tarde (Q2). células (D) HeLa (5 x 10

4) foram cultivadas em lâminas de câmara e tratada com 3-azidoWA (0,25, 0,50 e 1,0 uM), juntamente com veículo de DMSO e estaurosporina controlo positivo (25 nM) durante 24 h. Após a fixação, as células foram coradas com corante nuclear DAPI e fotografado sob microscópio de fluorescência (100x ampliações) para identificar os núcleos apoptóticos (pontas de seta brancas). células (E) HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de 3-azidoWA como indicado, pro-caspase-3 e caspase-3 clivada expressões foram determinados por Western blotting com controle de carregamento β-actina.

3- azidoWA inibe a motilidade celular, invasão e Colony Formação

Como withanolides eram conhecidos por inibir a capacidade de invasão das células cancerosas [27], pretendeu-se estudar o efeito de 3-azidoWA sobre o potencial invasivo de células HeLa e PC-3 células

in vitro.

Wound healing ensaios foram utilizados para determinar se a concentração sub-tóxicos de 3-azidoWA poderia inibir a motilidade de células HeLa e células PC-3. Após 48 h, em monocamada de células de foram feridos, as células tratadas com veículo de DMSO estava completamente preenchido na área limpa (Fig 2, A.), Enquanto que o tratamento com 0,50 e 0,75 uM de 3-azidoWA significativamente (p 0,05) inibiu a motilidade das Hela e células PC-3, como fez o tratamento com estaurosporina (Fig. 2, A e B) (Fig. S1, A e B).

(A) células HeLa (0,5 × 10

5 células /poço) foram cultivadas até à confluência em placas de cultura de tecidos de seis bem e riscado com ponta estéril; 3-azidoWA foi adicionado às culturas, conforme indicado. áreas riscadas foram fotografadas (ampliação 100x), no tempo zero e depois subsequentemente novamente 24 h mais tarde, para avaliar o grau de cicatrização da ferida. (B) As áreas riscadas foram quantificados em três campos aleatórios em cada tratamento, e os dados foram calculados a partir de três experiências independentes. (C) de HeLa (1 × 10

3) células /poço foram cultivadas e tratadas com várias concentrações do composto 3-azidoWA durante 5 dias a 37 ° C e em seguida coradas com violeta de cristal (para mais detalhes ver Materiais e Métodos), número de colónias coradas foram contadas, de dados (D) fotografado (100x) e foram calculados a partir de três experiências independentes. Colunas dizer; barras de desvio padrão de três experiências independentes. P 0,05, ** P 0,01 comparado com o controlo não tratado. (E) A migração celular foi determinada através do ensaio de câmara de Boyden modificada como descrito em Materiais e Métodos. células HeLa (2 × 10

5) foram semeadas na câmara de topo, na presença ou na ausência de 0,25, 0,50, e 0,75 uM de 3-azidoWA. As células foram deixadas migrar durante 24 horas, altura em que as células migratórias ponto na metade inferior da membrana de inserção foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas sob uma ampliação de 200x. (F), as células invasivas foram contadas utilizando software de imagem como o número de células que migraram por campo de alta potência (HPF). Cinco campos foram contadas em triplicado (n = 3) de cada inserção. imagens de células foram obtidas utilizando microscópio Nikon Eclipse E200 embutido com câmera. Colunas dizer; barras de desvio padrão de três experiências independentes. P 0,05, ** P 0,01 comparado com o controlo não tratado

Colony capacidade formação de células HeLa e células PC-3 foram atenuadas por tratamento de 3-azidoWA de uma forma dependente da dose.. Como mostrado na Fig. doses 2, C sub-letais de 3-azidoWA diminuiu colónia capacidade formação de células HeLa em forma estatisticamente significativa (P 0,05). (Fig. 2, D) (Fig. S1, C e D)

Um evento crítico na invasão tumoral e metástase, é a capacidade das células tumorais para invadir através da matriz extracelular, permitindo que as células tumorais para se mover para além dos limites do ambiente do tumor primário [28]. Para examinar o efeito de 3-azidoWA na invasão celular, ensaio de invasão de câmara de Boyden foi realizado para determinar a capacidade de HeLa e células PC-3 para invadir através de matrizes biológicas

in vitro

. Como mostrado na Fig. 2, E e F, (Fig S1, E e F, P . 0,01) do tratamento com 3-azidoWA (0,50 e 0,75 uM) inibiu a invasão de células (P 0,05) .Para ignorar a possibilidade de alteração da invasão celular devido a morte celular programada, escolhemos cuidadosamente as concentrações fisiologicamente relevantes da 3-azidoWA. Todos estes resultados indicam colectivamente que as doses sub-tóxicos de 3-azidoWA alterar a cinética de crescimento de células HeLa e células PC-3. Este poderia ser um indicador positivo para testar a sua actividade antineoplásico em células de cancro do colo do útero e da próstata.

A inibição da metaloproteinase de matriz 2 Gelatinase atividade e expressão por 3 azidoWA

invasão de células tumorais através da matriz e tecido obstrução precisa os efeitos combinados de aumento da motilidade celular e degradação proteolítica controlada de matriz. Altos níveis de MMP nos tecidos tumorais têm sido correlacionadas com a degradação da matriz de células de cancro, invasão e metástase [29]. Como 3-azidoWA inibiu a motilidade celular, foi investigado se o 3-azidoWA exerce uma actividade anti-gelatinase. Como pode ser visto na Fig. 3, A e B (Fig. S2, A), fila superior, aumentando a concentração de 3-azidoWA actividade de gelatinase revogada selectivamente e expressão de 72 kDa de MMP-2 de banda, como confirmado por zimografia em gelatina e análise de Western blot. O efeito de inibição de MMP-2 por 3-azidoWA foi mais pronunciada do que a molécula parental withaferin A (Fig. 3, C) (Fig. S2, B) .Further nós examinamos se a 3-azidoWA poderia inibir outras gelatinase (MMP-9) e resultados revelaram que 3-azidoWA bloquear especificamente a actividade de MMP-2 em células HeLa e células PC-3, mas não de MMP-9 (Fig. 3, uma linha do meio) (Fig. S2, uma linha do meio). Juntos, estes resultados sugerem que a 3-azidoWA fortemente e anula selectivamente MMP-2 e expressão de actividade de um modo dependente da dose.

(A) As células HeLa foram deixados sem tratamento ou tratada com 0,50 uM e 0,75 uM de 3- azidoWA durante 48 h, o meio condicionado foi analisado para a MMP-2 actividade de gelatinase -9. (B) As células HeLa foram deixados sem tratamento ou tratada com 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 uM de 3-azidoWA durante 48 h, o meio condicionado obtido foi empregue para a análise de transferência de western, seguido por coloração com azul de Coomassie para revelar a banda de 68 KDa de BSA para controle de carregamento . (C) Células HeLa foram tratadas com várias concentrações de pai withaferin Um durante 48 h e a actividade da MMP-2 foi determinado por zimografia em gelatina. (D) células (E) HeLa foram tratados com TRAIL durante 180 minutos e com Tumicamycin durante 60 minutos (como indicado). Os meios condicionados foram submetidos a análise de zimografia de gelatina para a MMP-2 e actividade de análise de Western blot para extracelular par-4, seguido por coloração com azul de Coomassie para o controlo de carga.

3-azidoWA Induz Extracelular par-4 Secreção pela Via Clássica

Como casais de agentes de indução de apoptose facilitar a secreção de [3] extracelular Par-4, procurou-se analisar um painel de plantas medicinais derivados de produtos naturais puros que possam promover a apoptose e /ou melhorar a secreção de par-4 (dados não apresentados). Surpreendentemente verificou-se que tão baixo quanto 0,5 uM (muito abaixo da dose citotóxica) de 3-azidoWA, mas não a molécula progenitora Withaferin A (dados não apresentados) induzida a extracelular par-4 secreção de um modo dependente da dose (Fig. 3, o meio B linha), verificada por Western blot. Além disso, observou-se 3-azidoWA tratamento aumentou a secreção extracelular de PAR-4 nos meios condicionais que essencialmente imitavam os efeitos de 300 ng TRAIL (TNF-a apoptose relacionada ligando indutor) e 1,0 uM de tratamento tunicamicina (Fig. 3, D e E linha do meio). Para avaliar se essa secreção de Par-4 ocorreu pela via BFA-sensitive clássica envolvendo a rota ER /Golgi, nós terminado tráfego de proteínas do RE para Golgi com Brefeldin A (BFA) e encontrou secretado nível Par-4 foi desacelerou no meio condicionado após 3-azidoWA e tratamento TRAIL em presença de Brefeldina a (Fig. 4, a e B da linha de cima). Aqui, sugerimos que o 3-azidoWA induz extracelular Par-4 secreção pela via sensível clássica BFA.

de células PC-3. (A) As células de PC-3 foram deixadas não tratadas ou pré-tratadas com BFA (1,0 uM) durante 120 minutos, em seguida tratada com 3-azidoWA como indicado, durante 48 h. Como mostrado na Fig. (B). (B).