Abstract

O câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais letais com um alto metástase e taxa de recorrência. Estudos recentes indicam que os tumores contêm um subconjunto de células cancerosas estaminais semelhante que possuem certas propriedades de células estaminais. Aqui, utilizou-se a Hoechst 33342 ensaio de efluxo de corante e citometria de fluxo para isolar e caracterizar a população lateral (SP) a partir de células de linha celular de cancro de pulmão humano NCI-H460 (H460). Nós mostramos que as células H460 SP abrigar células-tronco que eles também podem facilmente formar esferas flutuantes independente de ancoragem, possuem grande potencial proliferativo, e exibem tumorigenicidade aumentada. Importante, as células SP H460 foram capazes de se auto-renovar, tanto in vitro como in vivo. Finalmente, mostra-se que as células H460 SP preferencialmente expressar ABCG2 bem como SMO, um mediador fundamental da hedgehog (hh) de sinalização, que parece desempenhar um papel importante em células cancerosas de pulmão H460 como o seu bloqueio usando ciclopamina inibe grandemente do ciclo celular progressão. Coletivamente, nossos resultados corroboram a existência de células-tronco do câncer de pulmão e também implicam sinalização HH na regulação do cancro do pulmão de células grandes (caule) células

Citation:. Shi Y, Fu X, Y Hua, Han Y, Lu Y, Wang J (2012) a população Side in Line Cell Lung Cancer humano NCI-H460 é enriquecida em células-tronco como o câncer. PLoS ONE 7 (3): e33358. doi: 10.1371 /journal.pone.0033358

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de setembro de 2011; Aceito: 07 de fevereiro de 2012; Publicado: March 13, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pelo fundo de projeto chave da Shanghai Science and Technology Association, China (Grant No.05119554). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tem sido desde há muito apreciado que a maioria dos tumores são heterogéneas contendo um espectro de fenotipicamente diferentes tipos de células. Trabalho na última década indica que vários tumores sólidos humanos também contêm células tumorais funcionalmente divergentes em subpopulações possesing alto potencial tumorigénico e ser capaz de reconstituir a heterogeneidade fenotípica e histológico do tumor pai quando transplantadas em ratinhos imunodeficientes. Tais subconjuntos de células tumorais que possuem capacidade aumentada tumorigênico foram operacionalmente chamadas células iniciadoras de tumores ou células-tronco cancerosas (CSC), que já foram relatados na maioria dos tumores sólidos [1], [2]. A maioria das CSCs foram identificados, enriquecido, e purificou-se utilizando qualquer um dos marcadores da superfície da célula (s), entre os quais CD44 e CD133 são as mais populares, ou funcionais ensaios, que incluem população lateral (SP) [3] – [6] e ensaios Aldeflour [7], [8]. A estratégia de SP foi inicialmente desenvolvido para enriquecer as células-tronco hematopoiéticas [3] e é baseado na capacidade das células estaminais, que sobre-expressam desintoxicante bombas de superfície celular ABCG2 e MDR1 (isto é, a P-glicoproteína), ef luxar eficientemente a célula-permeável corante Hoechst 33342 e, consequentemente, no comprimento de onda FACS trama dupla para apresentar-se como uma população Hoechst-negativo sobre o “lado” (ou na cauda). O ensaio Aldeflour, por outro lado, tira vantagem de células estaminais que sobre-expressam desintoxicantes desidrogenases enzimas aldeído (ALDH) [7], [8] e, por conseguinte, a população de CSC-enriquecido pode mais eficientemente metabolizar um substrato de ALDH experimental para libertar mais fluoróforo.

o cancro do pulmão é a malignidade mais letal em todo o mundo. O trabalho nos últimos anos indica que tanto pequenas células (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) conter células cancerosas como tronco-[9] – [29]. Tal como na maioria dos outros tumores, ‘pulmão CSCs’ ter sido enriquecido e purificado utilizando marcadores de superfície celular CD44 ou CD133 ou utilizando os dois ensaios funcionais acima mencionados. Estes CSCs pulmonares foram demonstrados possuir alta clonal, clonogénicas, e frequentemente, o potencial tumorigénico e geralmente para ser resistente a tratamentos terapêuticos. As células-tronco do cancro do pulmão têm sido relatadas em culturas a longo prazo, bem como xenoenxertos em tumores de doentes e primários. De interesse, um estudo recente utilizando modelos genéticos do rato de câncer de pulmão mostra que os tumores de pulmão com diferentes origens genéticas têm fenótipos CSC distintas [30], levantando a possibilidade de que diferentes tumores de pulmão de pacientes podem ter diferentes fenótipos CSC. Embora a técnica de SP tem sido empregada para demonstrar CSCs em várias linhas celulares de cancro do pulmão [10], [11], [13], [25], não é conhecido se todas as linhas celulares de cancro de pulmão derivadas de tumores de doentes possuem um SP que é enriquecida em células estaminais de cancro semelhantes. Aqui nós aprofundar esta questão usando a grande humano linha de carcinoma de grandes células NCI-H460 (H460) e os nossos resultados revelam que H460 células possuem um SP que é enriquecida em células iniciadoras de tumores.

Resultados e Discussão

Cultivadas linhagem de células do cancro do pulmão humano NCI-H460 tem um

SP

em primeiro lugar, manchado H460 células com Hoechst 33342, que é expulso ativamente por transportadores ABC sensível ao verapamil em células-tronco [3]. Quando observamos as células coradas sob um microscópio de fluorescência, a maioria dos núcleos, tal como esperado, apresentavam-se azuis; no entanto, um pequeno número de núcleos foram negativos para a coloração de Hoechst (Figura 1, A e B;. As setas apontam para uma célula Hoechst-negativo). Em seguida, quantificou o SP por comprimento de onda duplo citometria de fluxo [3] – [6], [10], [11], [13], [25]. Detectamos, em várias culturas independentes H460, um SP de 3,80 ± 0,5% (n = 9), tal como ilustrado na Fig. 1C. Importante, a SP foi completamente eliminada na presença de verapamil (Fig. 1D), um bloqueador de canal de cálcio e um inibidor específico da ABCG2 e MDR1 utilizado no tratamento clínico de cancro do pulmão [31], indicando a especificidade do que SP detectada em células H460.

a-B, coloração Hoechst de células H460. Note-se que apesar da maioria das células foram coradas no núcleo, algumas células (indicados por setas) aparentemente não tinham coloração Hoechst nuclear. C-D, fenótipos SP, na ausência (C) ou presença (D) de verapamil.

células SP demonstram alto potencial proliferativo e pode se auto-renovar

Até agora a maioria As células-tronco do tipo têm sido demonstrado ter uma capacidade para formar esferas que flutuam livremente em condições independente de ancoragem [4] – [6], [10], [11], [13]. Além disso, têm sido relatados CSCs possuir um elevado potencial proliferativo. Para determinar se as células H460 SP têm propriedades semelhantes CSC-associados, primeiro cultivaram células SP e não-SP purificadas na condição de isento de soro (ver Métodos). Observou-se que as células H460 SP formado esferas flutuantes típico, com uma eficiência de 4,8 ± 0,1% (Fig. 2A), enquanto que as células não-SP mostrou principalmente padrão de crescimento aderente (Fig. 2B) com capacidade muito inferior formando-esfera (0,8 ± 0,3%). CCK-8 experimento proliferação (ver Método) também apresentou um maior potencial proliferativo nas células SP em comparação com as células não-SP (Fig. 2C). Quando as esferas derivadas de células SP primária foram dissociadas e passadas, elas prontamente formado esferas secundárias (dados não mostrados). Quando dissociadas esferas SP primárias foram cultivadas em meio completo contendo soro fetal de bovino (FBS) durante uma semana, novas células SP (6,2 ± 0,8%) foram detectados com as células maioria sendo de células não-SP (Fig. 3a). Mais uma vez, o fenótipo sp foi completamente bloqueada na presença de verapamil (Fig. 3B). Estes resultados sugerem que as células SP podem se auto-renovar

in vitro

.

A-B, purificada SP e não-SP células foram cultivadas em meio livre de soro em condições independente de ancoragem. As células SP formado esferas flutuantes típicos dentro de 4 dias (A), enquanto que as células não-SP, em grande parte aderente estabelecidas crescimento (B). C, as células SP mostrada maior capacidade proliferativa do que as células não-SP, tal como determinado por CCK-8 kit (

P

0,05 para todos os pontos de tempo, Estudante

t

-teste).

a-B, SP re-análise, quando as esferas SP foram desagregados células dissociadas e cultivadas em meio contendo soro normal durante uma semana. C-D, SP re-análise em tumores derivados de células de SP. E-F, SP re-análise em tumores derivados de células não-SP. A, C, E, sem verapamil. B, D, F, com verapamil.

As células H460 SP demonstrar tumorigenicidade maior do que as células não-SP

O padrão ouro para o ensaio de propriedades CSC é para executar correspondente limitação de diluição experiências de transplantação do tumor [1], [2], e para comparar a tumorigenicidade, vulgarmente medidos por incidência de tumores, a latência (isto é, o tempo entre a implantação de células tumorais quando os tumores podem primeiro ser palpado), taxa de crescimento (isto é, o volume do tumor), e o peso do tumor endpoint. Nós purificado a H460 SP e células não-SP e injectado aumento do número de células em Matrigel por via subcutânea (s.c.) em ratinhos não obesos diabéticos /imunodeficiência severa combinada (NOD /SCID) (Fig. 4A). Descobrimos que as células SP mostrou tumorigenicidade global mais elevada do que as células não-SP. Por exemplo, as células SP regenerado tumores no número de células menor (isto é, 5000), implantado ao passo que as células não-SP não regenerar qualquer tumor a esta dose de células (Fig. 4A). As células SP regenerado 6/6 tumores (isto é, 100%) enquanto as células não-SP deu origem a 4/6 tumores (67%;

P

= 0,039, testes qui-quadrado). Além disso, as células SP tumores estabelecidos, com uma latência mais curta do que as células não-SP correspondentes (Fig 4A;.

P

= 0,007). Além disso, os tumores derivados de células H460 SP cresceram mais rapidamente conduzindo a tumores muito maiores do que os tumores derivados de células não-SP (Figura 4A-C;.

P

0,01). Histologicamente, os tumores de xenoenxerto regenerados tinha características morfológicas do câncer de pulmão de células grandes. Em particular, os tumores exibida SP abundância de células mitóticas e figuras e mostrou-se evidente invasão capsular (Fig. 4D, esquerda). Em contraste, os tumores não-SP exibiu mais áreas necróticas (Fig. 4D, direita).

A, Tabela apresentação do potencial tumorigénico de células H460 SP e não-SP. Três parâmetros de tumorigenicidade, ou seja, a incidência tumoral, latência, e volume (*

P Art 0,01) foram mostrados. Todos os animais foram terminadas (prazo.) 28 dias após a implantação. B, as células SP regenerado tumores maiores do que as células não-SP correspondente em cada dose de célula. C, imagens tumorais brutas quando os tumores foram colhidos no dia 28 após s.c. injecção das células de SP e não-SP em NOD /SCID. D, microfotografias Representante HE-manchados de tumores SP e não-SP.

Foi surpreendente e potencialmente interessante que as células não-SP, em 50.000 e 100.000, também regenerado tumores, embora os tumores eram menores (Fig. 4B-C). Uma vez que as células não-SP não formam tumores a 5000 células (Fig. 4a), a explicação mais fácil seria que a população de células não-SP pode estar contaminado com um pequeno número de células de SP, o que daria origem a tumores quando grande foram implantados número de células não-SP. Alternativamente, células não-SP pode ser capaz de ‘des-diferenciar’ de volta para as células SP a uma taxa baixa, tal que in vivo algumas células não-SP foram convertidas em células SP, que, em seguida, deram origem a tumores. Este último caso foi recentemente demonstrado por outros em vários sistemas de células de tumor em cultura [32]. Para começar a explorar estas diferentes possibilidades, analisamos a composição SP em ambos os SP e não-SP derivada de células H460 tumores. Observou-se que os tumores SP continha 8,4 ± 0,6% de células de SP (Fig. 3C-D), enquanto que os tumores não-SP continha 1,4 ± 0,2% de células de SP (Fig. 3E-F). Embora estes resultados não poderiam definitivamente distinguir a contaminação da conversão, eles não fornecem uma explicação para por que as células não-SP ainda deu origem a tumores – que era porque os tumores não-SP continha células SP

A célula-tronco. marcadores ABCG2 e SMO são altamente expresso em células SP

O fenótipo SP em células estaminais hematopoiéticas é mediada principalmente por ABCG2 com algum envolvimento de MDR1 ou proteína de resistência a múltiplas drogas 1 [31]. Muitos CSC-enriquecido superexpressam de SP ABCG2 [4], [6]. Por isso, analisaram os níveis de ARNm ABCG2 e observou-se que, em comparação com células normais de FBS-cultivadas em monocamada H460 (Fig. 5A, pista 1), duas esferas (FIG. 5A, pista 2) e células SP purificado (Fig. 5A, pista 3) expresso aumentou significativamente os níveis de mRNA ABCG2 enquanto que as células não-H460 SP purificados praticamente não tinham expressão ABCG2 (Fig. 5A, pista 4). Da mesma forma, os tumores SP (Fig. 5A, pista 7) também expressaram níveis mais elevados de ABCG2 do correspondente tumores não-SP (Fig. 5A, pista 8). Uma apresentação quantitativa foi mostrado na Fig. 5B.

A, imagens gel Representante de RT-PCR. M, marcador; pista 1, as células NCI-H460 normalmente cultivadas em meio contendo soro; pista 2, as esferas H460; pista 3, células SP purificado; pista 4, purificado células não-SP; pista 5, o grupo controle tomatina; pista 6, o grupo experimental ciclopamina; pista 7, tumores SP; pista 8, tumores não-SP. B, apresentação quantitativa dos níveis de ARNm e ABCG2 SMO como determinado por densitometria (

P

0,001, excepto ARNm ABCG2 pista 6 vs pista 8 e ARNm SMO vs pista 1 e pista 5 vs pista 4 viela 6).

cancro do pulmão células tumorigénicas, incluindo células SP foram mostrados para expressar preferencialmente moléculas de auto-renovação, como Oct-4, Nanog, Bmi-1 e c-Kit [14], [ ,,,0],16], [17], [22], [29], componentes de sinalização Notch [18], [28], e Wnt /β-catenina [23]. Emergentes evidência sugere que o Hedgehog (HH) via de sinalização também pode estar intimamente envolvido no desenvolvimento e progressão [33] câncer de pulmão, [34]. A activação de sinalização de Hh requer a proteína transmembranar Smoothened (SMO) como um mediador fundamental da sinalização hh [35] e podem actuar ABCG2 na regulação a montante da via de sinalização Hh para proteger o compartimento do stemness de SP [36]. Por conseguinte, determinados os níveis de ARNm de SMO no mesmo conjunto de amostras que foram utilizados para análise ABCG2. Surpreendentemente, muito parecido com ABCG2, os níveis de ARNm de SMO foram significativamente elevados em esferas H460, células de SP, e tumores derivados de células de SP (Fig. 5A-B). Para nosso conhecimento, este achado pode representar a primeira a ligar SMO superexpressão de células de câncer de pulmão CSC-enriquecido.

O ciclopamina inibidor SMO inibe a proliferação celular H460

via de sinalização HH tem sido implicado na a manutenção de células estaminais ou progenitoras, em muitos tecidos de adulto. Esta via regula a proliferação celular, a polaridade do tecido, e diferenciação celular durante o desenvolvimento normal. Importante, HH anormal activação da via, tais como elevados níveis de expressão SMO, pode desempenhar um papel na manutenção da capacidade das células-tronco do tumor, favorecendo a auto-renovação, e proliferação da sua progénie [36], [37]. Para determinar se a sinalização de Hh desempenha um papel em células H460, foram empregados ciclopamina, um alcalóide de esteróide que inibe a actividade de SMO. Como um controlo para ciclopamina, utilizou-se um alcalóide estruturalmente relacionado, tomatina, o que não afecta a actividade SMO e sinalização de Hh. Comparado a tomatina, ciclopamina parece reduzir os níveis baixos de ARNm endógenas SMO (Fig. 5A, pistas 5 e 6). Em comparação com o grupo de controlo de veículo e tomatina, ciclopamina dose e dependente do tempo inibiu o crescimento de células H460 quando usado em 2-40 umol /L (Fig. 6A-E). A análise do ciclo celular demonstrou que ciclopamina, a 20 umol /L, tempo-dependente causada H460 células para prender na fase G1 /S do ciclo celular (Fig. 6F). Especificamente, o tratamento ciclopamina aumentou as células G1, da ~71% às 24 h para ~93% em 96 h enquanto que diminuiu as células em fase S de 18% às 24 h a 2% em 96 h (Fig. 6F). Após 96 h, ligeiramente aumento da apoptose (isto é, ~ 2%) foi também observada (Fig. 6F). Deve notar-se que ambos os grupos de veículo e de controlo tomatina também apresentaram um aumento dependente do tempo em células em fase G1 e diminui relacionados com o tempo de células em fase S (Fig. 6F), provavelmente devido ao facto de que todas as células foram cultivadas durante até 96 h sem reabastecer mídia. Por conseguinte, o esgotamento de factores de crescimento e nutrientes causada paragem do ciclo celular parcial nos grupos de controlo. Juntos, estes resultados demonstram que a sinalização de Hh é vital em células H460 e bloqueio de HH de sinalização faz com que dramaticamente paragem do ciclo celular. Desde SMO é preferencialmente expresso em SP e esferas (Fig. 5), supomos que a sinalização HH impõe seus prováveis ​​efeitos sobre os CSCs pulmonares.

A-C, microfotografias representativos de células H460 72 h CSC-enriquecido após o tratamento com o controlo de veículo (A), tomatina (B), ou ciclopamina (C). maginifications originais: × 200. D, ciclopamina dependentemente da dose inibiu a proliferação de células H460 (

P

0,05; ANOVA unidireccional). E, claro Tempo de inibição ciclopamina de células H460 (

P Art 0,05, ANOVA one-way). Ciclopamina foi utilizado a 20 umol /L. M, Efeitos da ciclopamina sobre o ciclo celular de células H460.

Em resumo, neste estudo nós apresentamos provas de que a linha celular de carcinoma do pulmão H460 humano de células grandes contém um SP detectável. Além disso, mostramos que as células H460 SP abrigar células-tronco que eles também podem facilmente formar esferas flutuantes independente de ancoragem, possuem grande potencial proliferativo, e apresentam maior capacidade de regeneração de tumor. Importante, as células H460 SP parecem ser capazes de auto-renovação in vitro (evidenciado por replating células esfera em meio de cultura normal; A Fig. 3A) como in vivo (evidenciado pelos tumores SP contendo uma pequena percentagem de células SP com a maioria sendo as células não-SP; A Fig. 3C). Finalmente, mostra-se que as células H460 SP preferencialmente expressar ABCG2 bem como SMO, um mediador importante da sinalização de Hh, que parece desempenhar um papel importante em células cancerosas de pulmão H460 como o seu bloqueio usando ciclopamina inibe significativamente a progressão do ciclo celular. Coletivamente, nossos resultados fornecem apoio adicional para a presença de células cancerosas estaminais-como em linhas celulares de cancro do pulmão e cultivadas também implicam sinalização HH na regulação do cancro do pulmão de células grandes (caule) células.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes éticas institucionais. Todos os estudos relacionados com animais foram aprovados pela comissão Universidade Tongji institucional IACUC. NOD /SCID (o número de autorização: SYXK20070005) a nível SPF foram usadas para experiências de implantação de células de tumor neste estudo. Todos os outros estudos aqui apresentados foram investigador-iniciado e não necessitam de aprovação de outros órgãos reguladores.

As linhas celulares e animais

Pulmão humano linha de células de carcinoma de grandes células NCI-H460 foi comprado a partir do Xangai Institutos de Ciências Biológicas, CAS (Xangai, China) e mantidas em meio recomendado pela ATCC. Todos os meios foram suplementados com 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS; Invitrogen-Life Technologies). As células foram incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C, fornecido com 5% de CO2. As células foram mantidas rotineiramente em 75 cm

2 frascos de cultura de tecidos (Corning Incorporated, EUA) e colhida usando 0,25% de tripsina quando eles estavam em fase logarítmica de crescimento para análise SP. A imunodeficiência combinada não obesos diabéticos /severa (SCID /NOD) ratinhos foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Animais de Laboratório Co. Ltd.

SP análise

O protocolo básico foi baseado em Goodell et al [3 ]. Resumidamente, as células NCI-H460 foram ressuspensas a 1 x 10

6 /mL em DMEM pré-aquecida (Invitrogen-Life Technologies). Corante Hoechst 33342 foi adicionado a uma concentração final de 5 ug /mL na presença ou ausência de verepamil (50 umol /L; Sigma) e as células foram incubadas a 37 ° C durante 90 min com agitação intermitente. No final da incubação, as células foram lavadas com HBSS arrefecido em gelo (Invitrogen-Life Technologies), centrifugou-se para baixo a 4 ° C, e ressuspensas em HBSS arrefecido com gelo. iodeto de propídio (Sigma) a uma concentração final de 2 ug /mL, foi adicionado às células para células viáveis ​​portão. As preparações de células foram filtradas através de um filtro de células de 40 mícrons, a suspensão de célula única. Citometria de fluxo análises e classificação foram realizadas em uma fluorescência classificador de células activadas (FACS, Beckman Coulter Epics Altra).

experiências de implantação de células tumorais

células H460 SP e não-SP

FACS purificadas foram mixted com Matrigel (Becton Dickinson), e, em seguida, por via subcutânea (sc) em ratinhos injectados NOD /SCID. Grupos de ratinhos foram inoculados com células SP ou células não-SP em 5 × 10

3, 5 × 10

4 e 1 × 10

5, respectivamente. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e os volumes dos tumores individuais foi medido utilizando um calibrador digital e aproximada de acordo com a fórmula V = 1 /2ab

2 (uma sendo o diâmetro longo e curto b diâmetro do tumor). No final das experiências, os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas e os tumores colhidos, medido, e fotografados. Os órgãos internos, como pulmões e fígado foram cuidadosamente observados para nódulos de metástases e secções de tumor foram examinadas sob o microscópio. Finalmente, tumores também foram digeridos para fazer a suspensão de uma única célula de SP re-análise.

ensaios de formação de Esfera em culturas isentas de soro

As células SP e não-SP foram cultivadas em sérica livre de DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), suplementado com 20 ng /factor mL de crescimento epidérmico (EGF), 10 ng /ml de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), 5 ug /ml de insulina (todos de Sigma). As células (1000 /poço) foram plaqueadas em 96 placas de cultura bem em 200 uL de meio de crescimento e 20 uL de meio por poço foram adicionados a cada 2 dias. O número de esferas (Φ 150 uM) para cada poço foi avaliada após 5 dias de cultura

análise de RT-PCR

As células foram colhidas e o ARN total foi extraído e preparado para RT-. PCR usando um Kit de PrimeScript ™ RT-PCR (Takara, Quioto, Japão). Os parâmetros do ciclo para ABCG2, SMO, e GAPDH cDNAs foram 30 seg a 94 ° C, 30 seg a 58 ° C (para ABCG2 e GAPDH) ou 55 ° C (para SMO), e 45 seg a 72 ° C durante 35 ciclos, respectivamente. Os iniciadores para RT-PCR eram como se segue: ABCG2 (F) 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA-3 ‘, ABCG2 (R) 5′-CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3′, SMO (F) 5’-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3 ‘, SMO (R) 5’-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3 ‘, GAPDH (F) 5′-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3′, e GAPDH (R) 5’-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3 ‘.

proliferação celular Ensaio

proliferação celular os ensaios foram realizados utilizando o Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japão). As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 5 x 10

4 células por poço e cultivadas em meio de crescimento. Ciclopamina e tomatina (todos de Sigma) foram adicionados, respectivamente, a uma concentração de 20 umol /L e meio de crescimento adequado foi adicionado nas amostras de controlo. CCK-8 foi adicionado em cada poço a 24, 48, 72 e 96 h, e, depois de uma cultura adicional de 4 h, a absorvância de cada poço foi determinada e curva de crescimento foi representada graficamente. Os perfis do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo.

A análise estatística

Os dados foram geralmente apresentados como a média ± diferenças SD e estatísticas entre os grupos experimentais foram analisados ​​por Student

t-

teste, ANOVA de uma via, ou de regressão linear usando software estatístico SPSS11.5 e de acordo com a natureza dos dados analisados. A

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todos os casos

Reconhecimentos

Estamos gratos ao Dr. Guoping Zhang (de Institutos de Ciências Biomédicas da Universidade de Fudan, Xangai, China) para obter ajuda com as medições de citometria de fluxo.