Abstract

O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A identificação de novos biomarcadores de câncer é necessário reduzir as taxas de mortalidade por meio do desenvolvimento de novos testes de rastreio e diagnóstico precoce, bem como novas terapias-alvo. Neste estudo, foi realizada uma análise proteômica das neoplasias gástricas noncardia de indivíduos de Norte do Brasil. As proteínas foram analisadas por electroforese bidimensional e espectrometria de massa. Para a identificação de proteínas diferencialmente expressas, foram utilizados testes estatísticos com reamostragem de bootstrap para controlar o erro tipo I em analisa a comparação múltipla. Foram identificadas 111 proteínas envolvidas na carcinogénese gástrica. A análise computacional revelou várias proteínas envolvidas nos processos de produção de energia e reforçou o efeito Warburg no câncer gástrico. ENO1 e expressão HSPB1 foram ainda avaliados. ENO1 foi escolhido devido ao seu papel na glicólise aeróbica que podem contribuir para o efeito Warburg. Embora observaram-se dois pontos sobre-regulada de ENO1 na análise proteómica, a expressão significativo de ENO1 foi reduzida em tumores gástricos por western blot. No entanto, significativo ENO1 expressão parece aumentar em mais tumores invasivos. Esta falta de correlação entre a proteómica blot e Western análises pode ser devido à presença de outros pontos ENO1 que apresentam uma expressão ligeiramente reduzida, mas com um elevado impacto na expressão proteica média. Em neoplasias, HSPB1 é induzida por stress celular para proteger as células contra a apoptose. No presente estudo, HSPB1 apresentada uma proteína de elevada expressão de mRNA e num subconjunto de amostras de cancro gástrico. No entanto, não foi observada associação entre a expressão HSPB1 e características clínico-patológicas. Aqui, nós identificamos vários biomarcadores possíveis de câncer gástrico em indivíduos do Norte do Brasil. Estes biomarcadores podem ser úteis para a avaliação do prognóstico e estratificação para a terapia se validados de maiores conjuntos de estudos clínicos

Citation:. Leal MF, Chung J, Calcagno DQ, Assumpção PP, Demachki S, da Silva IDCG, et ai. (2012) Diferencial proteômica Análise de Noncardia Câncer Gástrico de Indivíduos do Norte do Brasil. PLoS ONE 7 (7): e42255. doi: 10.1371 /journal.pone.0042255

editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 09 de fevereiro de 2012; Aceito: 03 de julho de 2012; Publicado: 30 Julho 2012 |

Direitos de autor: © Leal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; Dr. Chammas, Dr. Smith e Dr. Burbano) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Dr. Leal, Dr. Chung eo Dr. Calcagno ) como subsídios e bolsas de estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. A taxa relativa de sobrevida global em 5 anos é actualmente inferior a 20% [2]. No Norte do Brasil, GC é a segunda neoplasia mais frequente entre os homens eo terceiro nas mulheres [3]. No Estado do Pará, Norte do Brasil, a taxa de sobrevida em 5 anos é de cerca de 9-10% [4].

Os dois principais locais de tumor de GC são cárdia (proximal) e noncardia (distal). O GC cárdia afeta cinco vezes mais homens do que mulheres [5]. Além disso, as taxas de incidência de GC cárdia são relativamente elevados nas classes profissionais [6]. Em contraste, a GC noncardia tem uma relação homem-mulher de aproximadamente 2:01 e a incidência aumenta progressivamente com a idade, com um pico de incidência entre 50 e 70 anos [7]. Os fatores de risco para noncardia GC incluem

pylori

infecção por Helicobacter, baixo nível socioeconômico, tabagismo, ingestão de alimentos salgados e fumados, e baixo consumo de frutas e produtos hortícolas [8]. Ao longo das últimas décadas, a incidência de GC noncardia declinou substancialmente em regiões desenvolvidas do mundo. No entanto, este subtipo continua a constituir a maioria dos casos de GC em todo o mundo e continua a ser comum em muitas regiões geográficas, incluindo China, Japão, Europa Oriental e [8] Américas Central /Sul. A compreensão da biologia GC ea identificação de biomarcadores de câncer são necessários para reduzir as taxas de mortalidade por meio de exames de câncer em populações de alto risco, para aumentar o diagnóstico precoce, e para desenvolver novas terapias-alvo.

GC, como outras neoplasias , pensa-se que resultam de uma combinação de factores ambientais e a acumulação de alterações genéticas e epigenética generalizados e específicos, que afectam oncogenes, genes supressores de tumores, e controlar a instabilidade do genoma. Vários genes /proteínas têm sido propostos como biomarcadores GC. Na carcinogênese gástrica de vários estágios, alterações dos oncogenes MYC, KRAS2, CTNNB1, ErbB2 FGFR2, CCNE1 e HGFR, bem como dos supressores de tumor TP53, APC, RB, DCC, RUNX3 e CDH1 até agora têm sido relatados (ver comentários [9], [10]). Embora a desregulamentação destes genes /proteínas tem sido intensamente estudado em GC, um perfil mais completo é necessário compreender o processo de carcinogênese.

A última década nas ciências da vida foi profundamente influenciado pelo desenvolvimento da “genómica” tecnologias (genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica), dedicadas ao retratar uma visão global dos sistemas biológicos ea compreensão da célula viva [11]. Desde que as proteínas são responsáveis ​​pelo fenótipo maligno, análises proteômicas pode refletir o estado funcional das células cancerosas, e, portanto, têm vantagens distintas sobre genómica e estudos transcriptômica [12]. Além disso, as proteínas são atualmente as principais moléculas alvo de fármacos anti-cancerígenos [13].

Alguns estudos de proteômica baseada foram previamente realizados em tumores gástricos primários humanos (veja o comentário [14]). No entanto, a maioria desses estudos analisaram os tumores de indivíduos de população asiática e, consequentemente, não pode refletir os comportamentos biológicos e clínicos distintos entre os processos de GC. GC é marcada por variações globais na incidência, etiologia, curso natural, e gestão [15]. Embora, cerca de 90% dos tumores do estômago são adenocarcinomas [7], vários factores conduzem a biologicamente e clinicamente subconjuntos GC: condições tumorigénicas antecedente, tal como o

Helicobacter pylori

gastrite e outras patologias gástricas crónicas; localização do tumor primário (cárdia e região noncardia); subtipos de adenocarcinoma (difuso, intestinal, ou misturado [16]); etnia da população atingida (diferentes níveis de susceptibilidade e agressividade dos tumores); e um biomarcador preditivo (ERBB2) [15]. Assim, o termo “cancro gástrico” é usado para descrever várias neoplasias que afectam a região do estômago.

Neste estudo, comparou-se o perfil de noncardia GC e do tecido gástrico não neoplásico combinado de indivíduos de expressão Norte do Brasil (todos com

H. pylori

infecção), e identificou uma assinatura proteína que foi diferencialmente expressos entre os dois grupos por uma eletroforese bidimensional método (2-dE). À tela proteínas relacionadas à progressão da carcinogênese gástrica, também em comparação tecidos gástricos não neoplásicas com amostras GC de indivíduos com e sem metástases linfáticas. Para a seleção de proteínas diferencialmente expressos, foi utilizado um teste parametrics estatística com reamostragem de bootstrap. Temos vindo a desenvolver uma análise computacional abrangente de dados de proteômica de tecido para descobrir caminhos e redes envolvidas na oncogênese gástrica e progressão. As possíveis associações entre enolase 1 (ENO1) e choque térmico 27 ​​kDa 1 (HSPB1) características do gene e da proteína, e correlação clínica também foram avaliadas em indivíduos do Norte do Brasil. Estas duas proteínas têm sido relatados com frequência como moléculas desregulados em GC anterior estudos proteômicos em outras populações. No entanto, eles nunca foram avaliados em uma população brasileira.

Métodos

espécimes clínicos

Para a análise de perfis de proteínas, as amostras de GC noncardia e correspondentes não-neoplásica tecido gástrico (local distante do tumor primário; grupo controle) foram coletados de 15 pacientes. Foram incluídas amostras pareadas adicionais para western blot e PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) analisa. espécimes de tecidos dissecados foram congelados instantaneamente em azoto líquido após dissecção cirúrgica e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Todas as amostras gástricas foram obtidas cirurgicamente de João de Barros Barreto Hospital Universitário (HUJBB) no Estado do Pará, Norte do Brasil. No Estado do Pará, a população humana é composta de cruzamentos interétnicos entre três principais grupos de origem: Europeu (representados principalmente pelo Português), africanos e ameríndios [17]. Todos os pacientes tinham histórias negativos da exposição a quimioterapia ou a radioterapia, antes da cirurgia e não houve outros co-ocorrência de cancros diagnosticados. consentimento informado por escrito com a aprovação do comitê de ética da HUJBB foi obtido de todos os pacientes antes da coleta da amostra.

Todas as amostras foram classificadas de acordo com Lauren [16] e os tumores foram encenado usando critérios padronizados pela TNM encenação [18] . A presença de

H. pylori

, um carcinógeno de classe I, em amostras gástricas foi detectada por ensaio PCR para o gene da urease [19], e pela sua citotoxina vacuolar factor de virulência (CagA) [20] utilizando o ADN purificado em simultâneo com as proteínas e o ARNm. Em cada experiência de PCR, foram incluídos controlos positivos e negativos.

Para reduzir a heterogeneidade da amostra, a análise 2-DE incluído apenas noncardia GC e amostras gástricas apresentando

H. pylori

infecção CagA +, o que parece ser frequente em nossa população (dados não publicados). A Tabela 1 mostra as características clinicopatológicas de amostras utilizadas para a análise de perfis de proteínas.

Proteína, ARNm e ADN purificação

A proteína total, ARNm, ADN e foram simultaneamente isoladas a partir de amostras de tecido utilizando gástrica AllPrep o Kit de ADN /ARN /proteína (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O pelete de proteínas foi dissolvido em tampão contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma), e 0,5% de cada um cocktail Fosfatase Inibidor 1 e 2 (da Sigma-Aldrich, EUA ). A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (Sigma-Aldrich, EUA). A concentração de RNA e qualidade foram determinados utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemanha) e 1% de agarose gel. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

2-DE proteómica profiling

As proteínas foram separadas por 2-DE [21]. As amostras de proteína (300 ug) foram carregados em tiras de IPG (pH 3-10 L, 18 cm, GE Healthcare, EUA). As tiras foram re-hidratada durante 12 h a 50 V. A focagem isoeléctrica foi realizada utilizando o seguinte programa: 200 V 2 h, 300 V 30 min, a 500 V de 30 min, a 1000 V 1 h, 8000 V 1,5 h e 80000 Vh. As tiras foram focadas reduzida com 50 mM de DTT e alquiladas com iodoacetamida 100 mM em tampão contendo ureia 6 M, Tris-HCl a 50 (pH 8,8), glicerol a 30%, SDS a 2%, e de rastreio de azul de bromofenol. Para electroforese secundário, as tiras tratadas foram carregados no topo de 12,5% de SDS-PAGE (200 mm), em conjunto com os ™ fosfoproteína Molecular Padrões de Peso PeppermintStick (Invitrogen, USA). Em todas as experiências, GC e amostras de controlo correspondentes foram realizados simultaneamente. Todos os geles 2-DE foram realizadas em duplicado.

As proteínas nos geles 2-DE foram visualizados utilizando SYPRO® rubi Gel Stain (Invitrogen, EUA) seguindo as recomendações do fabricante. Imagens de géis corados com SYPRO® Rubi foram escaneados com uma excitação 582 nm e um filtro de emissão de banda 610 nm 30 em um imager Typhoon Trio (GE Healthcare, EUA). Para a excisão local e subsequente análise por espectrometria de massa, os géis foram visualizados com Coomassie Brilliant coloração azul G250.

A análise de imagem e local de identificação

imagens do gel foram analisados ​​com a versão PDQuest software avançado 8,0 (Bio -Rad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. A detecção automática de vista de cada gel foi verificada por inspeção visual. Algumas manchas foram usadas como pontos de referência ao alinhar as imagens. As intensidades local foram normalizados para equalizar as densidades totais de cada imagem do gel utilizando o Modelo de Regressão Local. volumes pontuais proteína normalizados nos proteomas foram comparados entre os grupos experimentais

Nós criamos dois conjuntos de análises para identificar pontos diferencialmente expressos:. (1) a comparação da expressão da proteína entre tumor e combinados controle usando teste T pareado; (2) a comparação da expressão da proteína entre as amostras de controle, GC sem linfonodo metástases e GC com metástases do nó de linfa utilizando One-Way análise de variância para amostras independentes (one-way ANOVA). Além disso, as comparações post-hoc foram realizadas com o teste de Tukey para as variáveis ​​com distribuição normal e com Games-Howell para distribuições onde variâncias iguais não poderiam ser assumidos. As análises de testes paramétricos foram realizados com bootstrapping, um método de reamostragem. O método de bootstrapping [22] proporciona um p-valor crítico ajustado, controlando um erro de tipo I (falso positivo), reduzindo o excesso de ajuste de polarização e validar as estimativas de precisão. A técnica de bootstrapping pode proporcionar uma taxa de erro familywise mais preciso e menos conservadora (FWER) do que os métodos padrão (por exemplo, ajustamento de Bonferroni) para análises multicomparison [23]. Realizamos todas as análises para identificar proteínas diferencialmente expressos com base em 1000 amostras de bootstrap. Em todas as análises, o intervalo de confiança (IC) foi de 95% e p valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Para a identificação de proteínas por espectrometria de massa, nós filtradas pontos significativos que apresentarem alteração dobra abaixo de 1,5 vezes em a densidade entre dois grupos experimentais. Estas manchas foram observadas em menos do que 30% das amostras em um grupo [24].

A análise por espectrometria de massa

As manchas de interesse foram excisadas manualmente para análise de espectrometria de massa subsequente [25]. Além disso, em branco pedaços de gel de uma região livre de defeito, e pontos de referência (proteínas marcadoras conhecidos do 2-DE) foram excisadas, serviram como controle para a digestão de tripsina, e foram executados em paralelo com as manchas de proteínas de interesse. Após descoloração e lavagem, as partículas de gel foram submetidos a digestão em gel com 20 ng /mL de tripsina ouro (Espectrometria de Massa de Grau, Promega Corporation, EUA) em bicarbonato de amónio 25 mM a 37 ° C durante a noite. péptidos digeridos foram recuperados, colocado numa centrífuga Speed-Vac até à secura, e foram reconstituídos em 15 mL de ácido fórmico a 0,1% em água. A mistura de péptidos foi analisado usando cromatograf ia líquida de desempenho ultra-C18 (UPLC, nanoACQUITY, Waters, EUA) em conjunto com ESI-quadrupolo TOF espectrómetro de massa (ESI-QTOF Ultima, Waters /Micromass, EUA). O gradiente era de 0-80% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1% ao longo de 20 ou 10 min. Todos os espectros MS /MS foram pesquisadas no banco de dados IPIhuman 379 usando motor de busca MASCOT (Matrix Science), aceitando um perdeu clivagem tríptica e carbamidomethyl (C) como a modificação fixa e oxidação (M) como modificações variáveis. tolerância peptídeo foi ± 0,1 Da e MS /MS tolerância foi ± 0,1 Da. Maior identificação confiança tinha estatisticamente significativa pontuação de busca e identificação de proteínas foram baseadas em um mínimo de 2 hits peptídicas.

análise bioinformática

As proteínas identificadas (de apenas os pontos onde foi identificada uma proteína) foram classificados em grupos de acordo com a compartimentalização subcelular, processo biológico, ea função molecular com base na informação anotada na Gene Ontology (GO) bancos de dados do Consórcio (https://www.geneontology.org/). Esta análise foi realizada usando a classificação da ferramenta DAVID anotação funcional (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [26]. A localização cromossômica de proteínas identificadas foi acessado usando a ferramenta Biomart mineração de dados diretamente do banco de dados Ensembl (https://www.ensembl.org/biomart/martview).

O sistema PANTHER (www.pantherdb.org/) , software MetaCore (GeneGo Inc.), e o Engenho Acesso Análise 9,0 (IPA, Engenho Systems, Inc.) foram utilizados para a via, de rede, e análises funcionais de proteínas diferencialmente expressas. Todos os caminhos relatados e os processos biológicos são listados de acordo com a sua pontuação de enriquecimento GO fornecidas pelos pacotes de software como -log (valores de p) e com uma taxa de detecção False (FDR) de 0,05%.

A análise de agrupamento não supervisionado foi realizada por meio de correlação de Pearson dos (z-score) valores normalizados de todas as proteínas diferencialmente expressos significativas (identificação única por spot) de 30 amostras no conjunto de análise. mapas de calor foram gerados usando o construtor Heatmap (https://ashleylab.stanford.edu/tools_scripts.html) para organizar perfis de expressão de proteínas e amostras com base em sua semelhança. Cada célula colorida no mapa bidimensional representa o valor a expressão da proteína da amostra. valores cada vez mais positivos são indicados por vermelhos de intensidade crescente, e valores cada vez mais negativas por verdes de intensidade crescente. Dendrogramas na parte superior do mapa de calor mostra o agrupamento de amostras e sobre o lado do agrupamento por expressão da proteína.

ENO1 e HSPB1 expressão

A proteína e ARNm utilizado para a ENO1 e HSPB1 expressão análises foram purificados em simultâneo com a amostra de proteína usada para geles 2-dE.

para a análise western blot, a proteína reduzida (20 ug por ENO1 e 30 ug por HSBP1) de cada amostra foi separada em SDS a 12,5% homogénea -Página gel e electro-transferidas para uma membrana de PVDF (Hybond-P, GE Healthcare, EUA). A membrana de PVDF foi bloqueada com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween 20, 5% de leite com baixo teor de gordura e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários correspondendo a anti-ENO1 (SC-100812, 1:3000, Santa Cruz Biotechnology, EUA ), anti-HSBP1 (SC-13132, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, EUA), e anti-ACTB (Ac-74, 1:3000, Sigma-Aldrich, EUA). Após lavagem extensiva, um anticorpo secundário conjugado com peroxidase foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente. bandas imuno foram visualizados utilizando o reagente Luminol Western blot e as imagens foram obtidas usando um sistema de imagem digital ImageQuant 350 (GE Healthcare, Suécia). ACTB foi utilizado como um controlo de referência carregamento.

Para a análise de RT-qPCR, o ADN complementar foi sintetizada utilizando High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Polónia) de acordo com o protocolo do fabricante. Todos em tempo real ensaios de RT-qPCR foram realizadas em triplicata para ambos gene alvo (

ENO1

: Hs00361415_m1;

HSPB1

: Hs03044127_g1, Applied Biosystems, EUA) e controles internos (

ACTB

: Hs03023943_g1;

GAPDH

: Hs99999905_m1, Applied Biosystems, EUA), utilizando os iniciadores e sondas TaqMan. A quantificação relativa (RQ) da expressão do gene foi calculada de acordo com o método Pfaffl [27]. Uma amostra de controlo foi designado como um calibrador de cada tumor emparelhado.

A análise estatística dos ENO1 e HSBP1 dados expressão

O primeiro avaliou a distribuição normal de todos os dados usando o teste de normalidade de Shapiro-Wilk para determinar o uso subseqüente de testes apropriados para comparação estatística.

ENO1

níveis de mRNA e dados de expressão HSPB1 não foram distribuídos normalmente e foram transformados (z-score) para análise. Emparelhado T-teste foi realizado para comparar a média de expressão ENO1 e proteína HSPB1 entre amostras de controlo e GC. As associações entre os parâmetros clínico e a média de ENO1 e HSPB1 expressão foram avaliados através de teste t para amostras independentes. O teste do qui-quadrado (χ

2) foi também usado para avaliar a relação entre dados de expressão e fatores clínico-patológicos. A correlação entre o ENO1 e mRNA HSPB1 e expressão da proteína (western blot e 2-DE análises) foi analisada pelo teste de Spearman. Em todas as análises, o CI foi de 95% e p valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados e Discussão

Análise proteômica de tecido gástrico

Analisamos o proteoma de 15 amostras noncardia GC – 6 sem metástase linfonodal e 9 com linfonodo metástases – e 15 tecidos controle pareados (Tabela 1). Usando 2-DE com gama de pI de 3,0-10 e gama molecular entre 10 kDa e 120 kDa, cerca de 1,000 manchas foram claramente detectadas por electroforese em gel e subsequentemente analisadas quanto a expressão diferencial de proteínas. A Figura 1 mostra imagens de gel representativas com as manchas e sua ID de proteínas. Algumas proteínas foram refletidos por vários locais mais prováveis ​​devido a modificação pós-tradução levando a mudanças no gel 2-DE. Detalhes das identificações de proteína, valor teórico pI, peso molecular, contagem de proteínas, cobertura sequência, número de peptídeos correspondentes, bem como a variação relativa média e p-valores são mostrados em quadros suplementares S1 e S2. Estes quadros mostram também que as proteínas foram previamente observados em estudos proteomic GC.

As proteínas foram resolvidas através da gama de pI 3-10, seguido de 12,5% de SDS-PAGE e coradas com SYPRO® rubi. As proteínas identificadas que apresentaram alterados significativamente a expressão na carcinogênese gástrica são rotulados com os respectivos IDs de proteína.

Apesar de alguns estudos de proteômica baseada foram previamente realizados em tumores gástricos primários humanos, a nosso conhecimento, apenas três estudos se concentrar em noncardia GC [28], [29], [30]. A maioria de GC estudos proteômicos identificados diferencialmente expressos proteínas com base apenas em uma mudança vezes entre duas condições [24], [28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Outros estudos proteômicos GC anterior realizado análises estatísticas para comparar a expressão da proteína entre os grupos [29], [36], [37], [38], [39], mas sem controlar o que eu erro (falsos positivos) tipo. É interessante notar que em relação a caracterização de proteínas de tumores e amostras não-neoplásicas, utilizando testes paramétricos com bootstrapping para a identificação de proteínas diferencialmente expressas. Os métodos de reamostragem, comumente usados ​​em estudos microarray [40], têm sido usados ​​para fazer ajustes p-valor para vários procedimentos de teste que controlam a FWER e ter em conta a estrutura de dependência entre as estatísticas de teste [41]. O objetivo é criar muitos conjuntos de amostras de bootstrap redefinindo com as substituições a partir dos dados originais [22].

A comparação das amostras de tumores e de controlo pelo teste T pareado eo uso de bootstrapping revelou 133 pontos que foram significativamente alteradas com mais do que 1,5 vezes a mudança. Após uma pesquisa do banco de dados Mascot utilizando os dados MS adquiridos, foram identificados 97% dos pontos. Entre estes pontos, 18% foram identificados com mais do que uma proteína. As análises das manchas com um proteínas identificadas únicas mostrou que 33 manchas de 26 proteínas foram sobre-regulada e 72 de 56 proteínas foram sub-regulada em amostras de GC em relação ao tecido não neoplásico.

A comparação de tumores e amostras de controlo por ANOVA one-way revelou 143 pontos diferencialmente regulados e foram identificados 98% destes. Observou-se que 94 pontos eram comuns no teste T pareado e análises ANOVA. Em relação aos pontos com uma proteína identificada único, observou-se que 54 proteínas foram regulados negativamente e 9 foram regulados positivamente no tumor sem metástase ganglionar relativamente ao controlo de amostras. Também foi observado que 68 proteínas foram regulados negativamente e 15 foram regulados positivamente em tumores com metástase ganglionar em comparação com amostras de controlo. Detectamos 38 proteínas diferencialmente expressos entre amostras não neoplásicas e tumores independentes do estado do linfonodo.

Quatorze proteínas apresentaram alterações significativas entre os tumores com e sem metástase ganglionar (Figura S1). A expressão de NNMT aumentado continuamente enquanto ATP5H e UQCRFS1 mostrou uma redução contínua de não-neoplasia para tumorigênese com metástase axilar. NNMT foi previamente relatada com a expressão elevada de GC em comparação com amostras não neoplásicas [24], [42]. A expressão reduzida de ATP5H UQCRFS1 e pode ser devido a uma menor dependência da fosforilação oxidativa para a produção de energia, devido ao efeito de Warburg em estado avançado (ver bioinformática resultados abaixo).

classificação funcional de proteínas expressas diferencialmente em GC

A análise biomarcador GeneGo revelou que a maioria das proteínas identificadas marcadores para doenças gastrointestinais, incluindo GC (Figura 2A, representativa de tumor contra comparação não tumorais) previsto. Isto suporta os dados atuais e indica que os resultados devem ser investigados para identificar ou validar alvos clinicamente relevantes para o diagnóstico e /ou prognóstico da GC.

A) Enriquecimento da doença GeneGo utilizando as proteínas diferencialmente regulados entre amostras não neoplásicas neoplásicas e combinados; B) compartimentos celulares, C) Os processos biológicos, d) funções moleculares e E) cromossômica localização de todas as proteínas identificadas.

As proteínas identificadas foram agrupadas em classes diferentes com base em informações funcional disponível. A maioria das proteínas identificadas foram as proteínas de organelos intracelulares e faziam parte dos organelos ligados à membrana, especialmente as mitocôndrias (Figura 2B). Estas proteínas estão envolvidos principalmente em processos metabólicos celulares e de redução de oxidação (Figura 2C). A comparação de tumores com metástases em linfonodos e amostras de controlo revelou o transporte e o estabelecimento de localização como processos biológicos enriquecidos. Isso não foi observado na comparação de tumores ausência de metástases linfáticas e amostras de controlo. A actividade de oxidoredutase seguido por actividade de ligação a coenzima foram as principais funções moleculares das proteínas envolvidas na carcinogénese gástrica (Figura 2D).

que se refere à localização cromossómica, a maior parte das proteínas foram codificados por genes localizados no cromossoma 1 (11 %), cromossoma 19 (8%), e cromossoma 11 (7%) (Figura 2E). cariótipos complexos de tumores gástricos envolvem preferencialmente esses cromossomos, bem como cromossomos 3, 6, 7, 8, 13 e 17 (veja o comentário [9]). Ganho e perda de regiões cromossômicas de 1, 19 e 11 foram relatados anteriormente por nosso grupo de pesquisa em amostras de GC [43], [44]. Assim, esses cromossomos podem conter vários loci com genes sensíveis à dosagem.

Networks análise de proteínas diferencialmente expressos em GC

Temos realizado uma análise computacional abrangente de dados de proteômica de tecido para descobrir caminhos e redes envolvido na oncogénese gástrica e progressão. A Tabela 2 mostra as principais vias canónicos, usando a base de dados Engenho Pathway Analysis (IPA). As principais vias canônicas no processo de carcinogênese gástrica foram envolvidas nas vias do metabolismo energético, incluindo disfunção mitocondrial, metabolismo do piruvato, fosforilação oxidativa, círculo citrato, e glicólise /gluconeogénese. O presente estudo demonstrou um grande número de diferencial expressa proteínas metabólicas que não foram relatadas antes na carcinogênese gástrica noncardia (Tabela S1 e S2).

A nossa análise proteômica revelou que várias enzimas do ciclo de citrato ( ciclo de Krebs) e da fosforilação oxidativa foram regulados negativamente em células GC. Estes dados mostram possíveis alterações na função mitocondrial e uma mudança na produção de energia nas células GC presentes, sugerindo o efeito Warburg [45]. células de tumor em proliferação reprogramar as suas vias metabólicas para gerar energia e, assim, apoiar a divisão celular rápida sob condições metabólicas de stress que são característicos do microambiente tumoral anormal [46]. Mesmo sob as concentrações de oxigénio normais, as células tumorais mudar de geração de ATP através da fosforilação oxidativa a geração de ATP através da glicólise, a conversão de mais de glucose que entra em lactato [45]. Tem sido proposto que a glicólise altamente activa fornece uma vantagem de biossíntese para as células tumorais. A glicólise fornece intermediários metabólicos suficiente, evitando a oxidação da glucose, que é essencial para a síntese de macromoléculas, tais como lípidos, proteínas e ácidos nucleicos, durante a divisão celular [47], [48], [49].

a lactato desidrogenase (LDH) e desidrogenase de piruvato (PDH) complexos controlam o metabolismo dos ácidos pirúvico, transformação, quer ácidos láctico ou de acetil-CoA, em seguida, entrar no ciclo de citrato. A infra-regulação de subunidades dos complexos de HDL e PDH sugere uma redução no fluxo de piruvato no ciclo de citrato e uma diminuição da taxa de fosforilação oxidativa e o consumo de oxigénio, o que reforça o fenótipo glicolítica. Outras proteínas de baixo-regulados, tais como LipF e GOT1, destaque a ativação de outras vias metabólicas com o comprometimento do ciclo e fosforilação oxidativa citrato. Várias alterações metabólicas que observamos em GC noncardia também foram descritos por Cai

et ai.

[36], em estudo proteómico cárdia GC, o que sugere que estas alterações metabólicas não são específicos para um subtipo de GC com base no local do tumor.

Pelo sistema PANTHER, a via mais significativamente enriquecida é a via p53 observada na comparação entre amostras de tumores e de controlo. Adicionalmente à sua função na resposta a danos no ADN e apoptose, p53 é também um regulador de metabolismo de células [50]. p53 promove a fosforilação oxidativa [51] e também inibe a via glicolítica-se por regulação negativa da expressão da glicólise induzida por TP53 e o regulador de apoptose (TIGAR) [52]. Portanto, a perda de p53 contribui para a aquisição do fenótipo glicolítica. A perda de

TP53

lugar é um achado comum em GC de indivíduos de Norte do Brasil [53]. Além disso, 20% da analisados ​​por GC-2 apresentada DE p53 imuno-reactividade (dados não mostrados). A imunorreactividade de p53 depende geralmente na acumulação de proteínas mutadas na célula, o que leva a uma maior semi-vida [54].

As redes de topo de interacções e funções moleculares também foram identificados utilizando o software IPA (Figura S2 ; Tabela 3; Subnetwork da análise MetaCoreTM não foram mostrados). Nós mostramos várias proteínas diferentemente regulamentados tarefas de montagem celular e organização, e em processos inflamatórios. A montagem e organização celular foi a rede principalmente enriquecido observada na comparação entre os controles e os tumores com metástase axilar.