Sumário
O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum, respondendo por aproximadamente 40% de todas as neoplasias do sistema nervoso central. Apesar do tratamento padrão, que consiste na ressecção cirúrgica, radioterapia e /ou quimioterapia, o prognóstico para GBM é pobre; com uma sobrevida mediana de 14,6 meses. A célula-tronco câncer ou modelo de célula de iniciação do câncer forneceu um novo paradigma para a compreensão do desenvolvimento e recorrência de GBM após o tratamento. Berbamine (BBM) é um composto natural derivado do
Berberis amurensis
planta, e, juntamente com os seus derivados, tem sido demonstrado que exibem actividade anti-tumoral em vários tipos de cancro. Aqui, nós relatamos que um novo derivado Berbamine sintética, BBMD3, inibe a viabilidade celular e induz a apoptose de câncer de células estaminais-like (CSCs) de uma maneira tempo e dependente da dose quando os CSCs de quatro pacientes com GBM (PBT003, PBT008, PBT022 , e PBT030) foram cultivadas. Estes CSCs cresceu em neurospheres e expressaram CD133 e nestin como marcadores. O tratamento com BBMD3 destruiu a morfologia neuroesfera, e levou à indução de apoptose na CSCs. A indução de apoptose nestas CSCs é dependente da activação da caspase-3 e a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). foi mostrado MicroRNA-4284 (miR-4284) a ser sobre-expresso cerca de 4 vezes nos CSCs seguintes BBMD3 tratamento. Além disso, a transfecção de oligonucleótido anti-sentido contra sintética humana miR-4284 bloqueou parcialmente os efeitos anticancerígenos de BBMD3 no GBM derivado CSCs. BBMD3 também aumentou a fosforilação da quinase c-Jun N-terminal (JNK) /activado tensão-proteína-cinase (SAPK), resultando num aumento da expressão de c-Jun fosforilada e total de c-fos; os componentes principais do factor de transcrição AP-1. A JNK-c-Jun /AP-1 via de sinalização desempenha um importante papel na indução de apoptose em resposta a irradiação UV e cerca de tratamentos com drogas. Segmentação de glioblastoma células estaminais-como com BBMD3 é, portanto, novela, e pode ter a promessa como uma estratégia terapêutica eficaz para tratar pacientes com GBM
Citation:. Yang F, Nam S, Brown CE, Zhao R, Starr R, Horne DA, et ai. (2014) Um novo derivado Berbamine inibe a viabilidade celular e induz a apoptose em câncer Células Estaminais-Like de Glioblastoma Humano, via aumento da regulação do miRNA-4284 e JNK /AP-1 Sinalização. PLoS ONE 9 (4): e94443. doi: 10.1371 /journal.pone.0094443
editor: Jeffrey K. Harrison, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 12 de novembro de 2013; Aceito: 17 de março de 2014; Publicação: 14 de abril de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento para o estudo foi fornecido por uma concessão do National Institutes of Health /Instituto Nacional do Câncer # CA-1155674 para RJ e financiamento start-up de RH do Instituto de Pesquisas Beckman. Pesquisa relatada nesta publicação incluiu o trabalho realizado no Translational Biomarcador Descoberta Core, que é apoiado em parte pelo National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30CA33572. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e letal. Apesar dos avanços atuais na terapia multimodal, que incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, o prognóstico permanece muito pobre para os pacientes, que normalmente têm um tempo médio de sobrevivência de menos de 15 meses [1], [2]. A maioria das lesões GBM desenvolver-se rapidamente a partir de uma lesão precursora menos maligno para a qual existe pouca ou nenhuma evidência clínica, radiológica, ou morfológica, e demonstrou-se que uma subpopulação altamente tumorigénicas das células cancerosas, chamadas células-tronco GBM, promove a resistência aos quimioterapia e radioterapia [3] – [5]. Essas células-tronco cancerosas ou células iniciadoras de tumores compartilham algumas características críticas com células-tronco neurais normais, incluindo a expressão de vários biomarcadores, bem como a capacidade de auto-renovação, diferenciação e proliferação. Devido ao mau prognóstico para pacientes com GBM seguinte terapias atualmente disponíveis, o desenvolvimento de protocolos mais eficazes para o tratamento de GBM é urgentemente necessário. No entanto progredir abrandar o desenvolvimento de protocolo permanece dependente de reforçar ainda mais a nossa compreensão dos processos de condução invasão câncer, o aparecimento de resistência a intervenções e mecanismos de condução recorrência do tumor em pacientes com GBM terapêuticas. Assim, o tratamento eficaz de GBM requer que visam directamente estas células estaminais GBM dentro da massa do tumor, uma vez que são as células que são resistentes a terapias convencionais [6]. A este respeito, Brown et al [7] fornecida recentemente uma base racional para o desenvolvimento de uma abordagem imunoterapêutica para a erradicação do GBM haste população de células por meio de relatórios que haste de tumor humano /iniciando as células de pacientes GBM poderia ser reconhecido e mortas por células CD8
+ citotóxico linfócitos T.
em adição a esta abordagem imunológica, microARN (miARN), que é uma relativamente nova classe de molécula de RNA pequeno não codificante encontrada em células eucarióticas, tem sido demonstrado que regulam um vasto espectro de expressão do gene padrões através de um mecanismo pós-transcricional [8]. E um considerável corpo de evidências indica agora que os miRNAs têm um papel chave na patogênese do câncer, e pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumor [9]. Também tem sido relatado que a elevada expressão de miR-196 e miR10b em pacientes GBM correlaciona-se com um prognóstico pobre [10], e que a sub-regulação de miR-128 leva a uma redução na capacidade de auto-renovação das células estaminais glioma por inibir a expressão do gene Bmi1. Assim, os miRNAs são rapidamente emergindo como alvos promissores para o desenvolvimento de agentes terapêuticos anticancerígenos novos, mas altamente seletivos.
Há vários anos, Berbamine (BBM), um alcalóide natural bis-benzilisoquinoleínico, foi identificado a partir da medicina tradicional chinesa
Berberis amurensis
, e junto com vários de seus derivados, foi relatado para ter actividade antitumoral potente em direção linfoma, mieloma, carcinoma hepatocelular, cancro do pulmão e cancro da mama e baixa toxicidade não específica [12] – [16] . BBM foi relatado para induzir a apoptose em mieloma humano, e para suprimir o crescimento, a migração e a invasão de células de cancro da mama humano altamente metastáticos através de inibição da actividade de NF-kB (NF-KB) e os seus alvos a jusante, tais como ciclina D1, Bcl-xL e survivin [13], [14]. Assim, a baixa toxicidade não específica de BBM, e alguns dos seus derivados, torna o desenvolvimento continuado destes novos compostos potencialmente fármacos promissores como eficazes anti-cancro para uma variedade de tipos de cancro. Para este objetivo, o nosso laboratório analisou treze novos derivados BBM (BBMDs), que foram sintetizados a partir de BBM natural. Descobrimos que BBMD3 é o mais potente desta série de novos BBMDs para matar células cancerosas. BBMD3 exibido ao longo de um aumento de 6 vezes na actividade anti-cancro em relação às células de melanoma e cancro da próstata, em comparação com o BBM natural. Isto foi atribuído à inibição da via de sinalização de JAK2 /STAT3 [17]. Recentemente, foi também relatado que BBMD3 inibe a viabilidade celular, e induz a apoptose nas células do osteossarcoma humano, o qual, neste caso, foi atribuída à activação da via JNK /AP-1 de sinalização [18].
A superfamília de proteína-quinases activadas por mitogénio (MAPK) inclui: proteína quinase c-Jun N-terminal (JNK) /activado tensão-proteína-cinase (SAPK); p38; e quinase regulada por sinal extracelular (ERK). Em geral, JNK e p38 são mediadores chave da resposta ao estresse e inflamação, enquanto a cascata da ERK é mais frequentemente induzida em resposta à estimulação do factor de crescimento [19], [20]. A via JNK estresse participa em muitos processos intracelulares diferentes, incluindo o crescimento celular, diferenciação, transformação e apoptose [21], [22]. As proteínas quinases JNK são codificadas por três genes, dos quais
JNK1
e
JNK2
são expressos por todos os tecidos, e
gene JNK3
está confinado a um padrão mais limitada de expressão, tal como no cérebro e no coração [22]. JNK foi originalmente identificada pela sua capacidade para fosforilar especificamente o factor de transcrição de c-Jun no seu domínio de trans-activação N-terminal em Ser63 e Ser73 [23]. c-Jun é uma componente importante da proteína de activação de-1 (AP-1), que é um factor de transcrição diméricos, e é composta de proteínas a partir de várias famílias de genes [24]. Embora a JNK /c-Jun ou JNK /AP-1 via têm um papel duplo na apoptose, é evidente que a activação da via JNK está envolvida na indução da apoptose por estímulos de morte de células específicas, tais como irradiação UV, e o tratamento com alguns drogas [25] – [27].
em nosso estudo, mostramos que um romance sintético derivado BBM (BBMD3) induz a apoptose em câncer de células estaminais-like, que são cultivadas a partir de pacientes com GBM. Mostramos também que morte celular está associada com aumento da regulação do miRNA-4284 e /via de sinalização JNK AP-1.
Materiais e Métodos
Reagentes e anticorpos
BBMD3 foi sintetizado por reacção do BBM natural com NH
2 contendo substituintes. A estrutura e pureza dos produtos foram analisados por meio de espectroscopia de H-RMN. BBMD3 exibidos mais de 98% de pureza por análise de RMN. inibidores de miRNA humanos (oligonucleotídeos sintéticos) contra HSA-miRNA-4284 e tem-miRNA-27A foram adquiridos de GeneCopoeia. RNAiFect reagente de transfecção foi adquirido de Qiagen Inc. factor de crescimento humano recombinante epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (FGF) foram obtidos a partir de R D Systems Inc., e Accutase foi adquirido a partir de Innovative Cell Technologies. B-27 suplemento isento de soro (50X) para o crescimento e manutenção de neurónios foi obtido a partir de Gibco. A heparina (1000 unidades /ml) foi adquirido a partir de APP Pharmaceuticals, LLC. anticorpos secundários rábano marcado com peroxidase anti-ratinho e anti-coelho foram adquiridos a partir da GE Healthcare. O anticorpo anti-nestina foi adquirido a Merck. Todos os outros anticorpos foram adquiridos de sinalização celular, Inc.
Cell Cultures
espécimes GBM utilizados neste estudo, (foram avaliados por um neuropatologista assistir, e atribuída uma classificação de grau IV, utilizando o Mundial da Saúde organização (OMS) diretrizes estabelecidas), foram obtidas de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico no Centro Médico City of Hope, de acordo com o Conselho de revisão Institucional (IRB) protocolos -aprovado. espécimes de tumor foram dadas único tumor cerebral paciente números (PBT), (isto é PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030). GBM neuroesfera (NS) As culturas foram cultivadas e expandidas como descrito anteriormente [7]. Resumidamente, culturas NS foram mantidas em meio de células estaminais neurais (DMEM /F-12), suplementado com suplemento B27 01:50 isento de soro, de 20 ng /mL de EGF, 20 ng /ml de FGF básico e 0,84 unidade /ml de heparina. neuroesferas humanos normais ou não malignos neuroesferas foram cultivadas a partir de tecido de cérebro fetal humano, nas mesmas condições de cultura como as neuroesferas GBM. A linha de células U87 de glioblastoma humano estabelecido, foi adquirido a partir da American Type Culture Collection (ATCC), e tanto o U87 e as células fixadas ou diferenciadas derivadas das neuroesferas GBM (células como stem-), foram cultivadas em meio DMEM (contendo L -glutamina), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico (AA). Todas as células foram cultivadas em cultura a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO
2.
Tratamento de BBMD3
BBMD3 foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e diluiu-se com células cultura médium. Para obter células isoladas a partir de neuroesferas GBM, neuroesferas foram tratados com Accutase durante 10 min a 37 ° C e passados através de um filtro de células (70 ^ M de nylon). As células foram então semeadas em frascos de cultura celular ou pratos com meio de cultura de células estaminais completo de acordo com o protocolo descrito na secção de desenho experimental. Cinco horas mais tarde, diferentes concentrações de BBMD3 diluídas foram adicionados às células; enquanto que os controlos receberam quantidade igual de apenas o veículo.
Viabilidade Celular Ensaios
ensaios de viabilidade celular foram realizadas com o CellTiter 96 Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação de Promega, que contém 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS). Cada poço de uma placa de 96 cavidades foi semeada com 5.000 células suspensas em meio de cultura. As células foram tratadas com diferentes concentrações de droga. Depois de 24 h ou 48 h de tratamento, o MTS foi adicionado às células de acordo com o protocolo do fornecedor, e a absorvância do produto de reacção formado por as células de cultura foi medida a 490 nm utilizando um leitor de placas de ELISA.
Ensaio de apoptose
as células (2 x 10
5) derivado das neuroesferas foram semeadas em placas de 6 poços, com meio completo de células estaminais. No dia seguinte, as células foram tratadas durante mais 48 horas, com as concentrações indicadas de BBMD3. Após o tratamento, todas as células foram recolhidos, e as células apoptóticas foram detectadas utilizando uma anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). As células foram coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fornecedor. As células viáveis e apoptóticos foram detectados por citometria de fluxo em nossa Analytical Citometria Núcleo aqui no City of Hope National Medical Center. células em apoptose incluem tanto a parte de apoptose precoce (anexina V-positivo) e a porção de apoptose tardia (anexina V e PI-positivo).
Fotografia
cultura normal NS, não tratados culturas GBM NS derivado de tumores cerebrais do paciente (ie, PBT003, PBT008, PBT022, PBT030) ou PBT003 NS tratados com diferentes concentrações de BBMD3 foram fotografados no aumento de 10x usando um microscópio Nikon Eclipse TE2000-U.
Proteína total Preparação e Protein Assay
Depois de uma incubação de 24 horas com 5 uM BBMD3, células derivadas de tumores do cérebro do paciente (isto é, PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030) foram recolhidos e lavados com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, cada sedimento de células foi adicionada a 150 ul de Cell Signaling tampão de lise (Merck), em que se tinha colocado um comprimido cocktail inibidor de protease (Roche, Inc., Indianapolis, IN). Após três ciclos sucessivos de congelação num banho de gelo seco /etanol e descongelação num banho de água a 37 ° C, a concentração total de proteína do ligado foi determinado utilizando um kit de ensaio de proteína Bio-Rad.
Análise de imunotransferência
Vinte microgramas de proteína total foram resolvidas através de um gel de gradiente de Tris-HCl a 4-15% poliacrilamida pré-fundido adquiridos de Bio-Rad (Hercules, CA). Após electroforese em gel, as proteínas foram transferidas para membranas Hybond-C (Amersham), bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente (TA) em leite em pó a 10% não-gordo, o qual foi dissolvido em PBST (1X PBS contendo 0,1% de Tween-20 ), e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários (que reconhece as proteínas descritas no texto) suspenso em PBST contendo 2% de leite seco não gordo. Após lavagem das membranas em PBST, os anticorpos secundários anti-murganho ou anti-coelho marcada com peroxidase de rábano foram incubados com as membranas durante 1 hora à TA. A localização na membrana de Hybond-C das proteínas antigénicas especificamente ligados aos anticorpos foi detectada com o substrato SuperSignal West Pico (Pierce).
Análise Quantitativa de microARNs
microARN total foi isolado a partir PBT003 , PBT008, PBT022 e PBT030 neuroesferas na sequência de um 15 horas de tratamento com 5 uM BBMD3 ou o controlo de veículo utilizando o miRNeasy Mini kit (Qiagen). Quantificação da abundância relativa de cada microRNA individuais, com ou sem tratamento BBMD3, foi concluída no Integrative Genomics Núcleo do City of Hope National Medical Center. Resumidamente, micro-RNA sequenciação foi realizada utilizando o Illumina HiSeq2000 seguindo o protocolo do fabricante (TruSeq RNA pequeno Sample kit Prep, Illumine, Inc.) com a otimização menor. 500 ng de micro-ARN foi ligado ao ‘adaptador (5’ 3 TCTCTGTAGGCACCATCAATC) com T4 RNA ligase 2 durante 1 hora a 22 ° C. Os adaptadores não ligados 3 ‘foram bloqueados por emparelhamento-los com iniciador de RT (5’ ATTGATGGTGCCTACAGAGA) a 75 ° C durante 5 min e 25 ° C durante 15 minutos. A biblioteca de micro-ARN quantificado desnaturado foi carregado em 1 ml de tampão de hibridação com uma concentração final de 22:00.
Tratamento de micro-ARN Inibidores
8000 células únicas derivadas de PBT008 e PBT030 neuroesferas na haste completa meios de cultura de células foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços. Cinco horas mais tarde, os inibidores anti-sentido 60 nM miR-4284 ou miR-27A foram transf ectados para as células por reagente de transfecção RNAiFect. As células de controlo foram transfectadas com um inibidor de controlo de micro-ARN. 24 horas após a transfecção com inibidores de micro-ARN, 5 uM BBMD3 foi adicionada às placas de cultura de células. 24 horas após o tratamento BBMD3, foi determinada a viabilidade celular.
Estatísticas
Student
foi utilizado t
teste para avaliar a significância estatística das diferenças entre os dois grupos e
p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
neuroesferas cultivadas a partir de amostras de GBM pacientes apresentam características de células-tronco cancerosas
Nós cultivadas e expandidas curto. neurospheres prazo tumorais em meio de células-tronco sem soro, (suplementado com EGF e FGF), que foram derivadas de quatro pacientes com GBM primários, (ou seja, PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030). Estes neuroesferas GBM exibiu uma morfologia semelhante à de células normais estaminais neurais (Fig. 1a). Relata-se que as células estaminais GBM-like (GBMSCs) e células estaminais neurais normais (NSC) partilham a expressão de vários marcadores, tais como CD133 e nestina [28]. CD133 é um marcador da superfície celular expressa em NSC humanos normais, e a sua expressão é regulada negativamente em linhas de células diferenciadas. Nestina, uma proteína de filamento intermediário produzido durante o desenvolvimento em células estaminais provenientes do sistema nervoso central dos mamíferos. Co-expressão de CD133 e nestin está associada a um mau prognóstico para pacientes com glioma maligno [28]. Observou-se por análise de Western blot que CD133 e nestina foram expressos em neuroesferas GBM cultivadas a partir de cada um dos quatro pacientes GBM, enquanto que nenhuma expressão de CD133 e nestina foi observado numa linha estabelecida GMB célula, (isto é, células U87), (fig. 1B). β-actina níveis de expressão foram monitorizados para assegurar que quantidades equivalentes de proteína de célula foram carregados em cada faixa do gel. Quando cultivadas em meios com soro, as neuroesferas derivado de PBT003, PBT008, PBT022 e pacientes PBT030 GBM têm a capacidade de se diferenciar em células aderentes e Neuron-semelhantes, (Fig. 1C). As culturas de células derivadas das amostras dos quatro pacientes GBM (PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030) cresceu em neurospheres típicos, e reteve a capacidade de auto-renovação e expressou marcadores neurais de células-tronco, como CD133 e nestin quando cultivadas in sérica mídia livre. Estes neuroesferas também tinha a capacidade de se diferenciar em meio de crescimento contendo soro. Neste relatório, nós, portanto, definidos estes neurospheres como quer GBM células-tronco semelhantes ou câncer de células estaminais-like.
neurospheres (A) Morfologia da PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030 em meio de cultura de células-tronco. (B) neurospheres GBM expressa biomarcadores específicos para células-tronco neurais normais. (C) neurospheres GBM exibem a capacidade de diferenciar.
BBMD3 rompe a estrutura do neuroesferas e inibe a viabilidade de câncer de células estaminais-como Cultivadas dos pacientes GBM Quatro
GBM cancerosas células estaminais derivadas semelhante, são menos sensíveis a, (ou se tornam resistentes a), a quimioterapia convencional [4], [5]; destacando a necessidade crítica para encontrar novas e mais seletivamente potentes drogas para o tratamento de glioblastoma. Berbamine, um produto natural derivado do
Berberis amurensis
planta, parece ter atividade citotóxica para uma variedade de cancros; fazendo com que a preparação de uma série de análogos de Berbamine. Estes análogos foram avaliados para determinar se qualquer um deles pode ser mais eficaz em matar células de cancro do que o composto progenitor. Descobrimos que a eficácia anticancerígena de um dos novos derivados sintéticos, (isto é, BBMD3), sobre o melanoma e células de cancro da próstata excedeu a dos outros análogos [17]. Assim, foram investigados os efeitos anticancerígenos de BBMD3 em GBM células-tronco semelhantes, que foram derivadas de neuroesferas cultivadas a partir de GBM paciente PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030. Durante o estudo, as células foram tratadas durante 24 ou 48 horas na presença de meio de cultura de células estaminais completo contendo 1, 3, 5, 8 ou 10 uM BBMD3. culturas de células de controlo foram tratados apenas com veículo (DMSO) em vez de BBMD3, e a viabilidade celular foi determinada tal como descrito nos Métodos. BBMD3 inibiu fortemente a viabilidade de cada conjunto de células cancerosas como tronco-GBM, derivado das neuroesferas individuais dos pacientes, em um tempo e modo dependente da dose (Fig. 2A). Um tratamento de 48 horas das neuroesferas com 10 uM BBMD3 inibiu a viabilidade das células de quase 100%, e interrompido a estrutura de neuroesferas de uma forma dependente da dose. A Figura 2B mostra que PBT003 derivado neuroesferas, tratou-se com 0, 1, 3, 5 ou 10 uM BBMD3 durante 48 horas, interrompida a morfologia esférica das neuroesferas seguintes tratamento BBMD3, e que a perturbação da forma neurospherical foi companied pelo aparecimento de flutuação células mortas.
(a) as células de PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030 neuroesferas foram tratados com 0, 1, 3, 5, 8, 10 uM BBMD3 durante 24 e 48 horas e a viabilidade foi determinada utilizando o ensaio MTS, tal como descrito nos Métodos. Cada experiência foi realizada em triplicado. O topo de cada gráfico de barras representa a média de 3 experiências, e
barras de erro representam
± o desvio padrão da média (DP). (B) BBMD3 rompe a estrutura das neuroesferas, e morte celular induzida de uma maneira dependente da dose nestes neuroesferas PBT003 derivado, quando as células são tratadas durante 48 horas com o medicamento.
BBMD3 Induz Caspase -3 Dependente apoptose de Câncer células-tronco semelhantes cultivada a partir de quatro pacientes com GBM
como o tratamento BBMD3 matou GBM câncer derivadas de células estaminais-like, examinamos se morte celular foi mediada por um processo de apoptose. As células (2 x 10
5) a partir de PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030 neuroesferas foram semeadas em seis placas de cultura de tecido, e tratou-se durante 48 horas com diferentes concentrações (0, 1, 3, 5, 10 uM) de BBMD3. Todas as células foram recolhidas e analisadas quanto à expressão de anexina V utilizando anti-anexina V-FITC e coloração do anticorpo seguida por iodeto de propídio a quantificação relativa por meio de citometria de fluxo. As células apoptóticas, mostrado na Figura 3A, foram Anexina V (células apoptóticas precoces) positivos, ou anexina V e de propídio (células apoptóticas tarde) duplo-positivos de iodeto. Os nossos resultados mostram que a apoptose induzida BBMD3 nestes GBM células estaminais do tipo de uma forma dependente da dose. Um tratamento de 48 horas com 10? M BBMD3 matou quase todas as células tumorais. A activação de caspase-3, um indutor crítica do processo apoptótico [29], resultou na clivagem de poli polimerase (ADP-ribose) (PARP), o que ajuda a manter a sua viabilidade células [30]. Para confirmar ainda que a morte celular induzida por BBMD3 é um processo apoptótico, análises de mancha Western foram realizados para detectar a activação da caspase-3 e a clivagem de PARP em um lisado celular total após um tratamento de 24 horas com 5 uM BBMD3. BBMD3 aumento da clivagem de caspase-3 na sua forma activa, e a clivagem de PARP em sua forma inactiva em células derivadas das quatro culturas de neuroesferas (Fig. 3B). Estes dados apontam para BBMD3 indução de apoptose nestas células estaminais-GBM como através da activação da cascata de caspase-3. Os nossos dados também sugerem que vários mecanismos podem estar envolvidos na indução de morte celular e a perda de viabilidade celular, uma vez que, no ponto de tempo testado, PBT003 NS incubadas com 5 pM BBMD3 induziu uma perda quase total da viabilidade celular, com uma apoptose taxa de aproximadamente 60%; enquanto que para a viabilidade celular PBT030 NS foi de aproximadamente 20% após incubação com 5 uM BBMD3, enquanto que a apoptose foi quase 100% nesta cultura.
As células apoptóticas (A) foram analisados para a Anexina V-FITC e PI reactividade coloração por citometria de fluxo. As células a partir das neuroesferas PBT003, PBT008, PBT022 PBT030 e foram tratados com BBMD3 (0, 1, 3, 5, 10 uM) durante 48 horas. As células apoptóticas foram identificadas como sendo reactivas com o anticorpo Anexina V-FITC (fase precoce de apoptose) ou PI e Anexina V-FITC /PI (fase tardia de apoptose) de duplo positivo células. Cada experimento foi realizado em duplicado ou triplicado, e repetido duas vezes como uma réplica independente. O topo de cada gráfico de barras representa a média dos valores observados de estas repetições, e
barras de erro representam
± o desvio padrão da média (DP). (B) A extensão de clivagem de caspase-3 e PARP foi determinada após um tratamento de 24 horas com BBMD3 utilizando análises de transferência de Western. β-actina serve como um controlo interno.
BBMD3 também reduz a viabilidade e induz a apoptose em Non-stem-like GBM Cells
Como já relatado, BBMD3 é citotóxica para conter -como células tumorais GBM; sugerindo que também deve ser citotóxica para as células cancerosas GBM-não estaminais semelhantes. Para examinar esta possibilidade, usamos células U87 cultivadas, que são uma linha de células de câncer de GBM-non-tronco como estabelecido. Observou-se que as células U87 não expressam o neural marcadores de células-tronco CD133 e nestina (ver Fig. 1B para comparação com as linhas celulares de tumores GBM estaminais semelhante). Como esperávamos, BBMD3 inibiu a viabilidade celular e a apoptose induzida em células de U87 (FIG. 4A) de um modo semelhante ao observado com as células estaminais GBM semelhante (Fig. 2A e 3A). Nossos dados indicam que BBMD3 pode matar tanto as células tumorais GBM estaminais-como e-não-tronco semelhantes.
(A)
Painel esquerdo
, as células U87 foram tratados com 0, 1, 3, 5, 8, ou 10 uM BBMD3 durante 24 e 48 horas e a viabilidade foi determinada utilizando o ensaio de MTS, tal como descrito nos Métodos.
Painel direito
, células U87 foram tratados com 0, 1, 3, 5, ou 10 uM BBMD3 durante 48 horas e as células apoptóticas foram analisados por anexina V-FITC e PI reactividade coloração por citometria de fluxo. (B)
Painel
mostra a morfologia de um neurosphere humano normal Esquerda.
Painel direito
mostra a viabilidade do derivado do cérebro e do tumor derivado neuroesferas fetais normais, após 24 horas de tratamento com 1, 5 ou 10 uM BBMD3. Cada experimento foi realizado em triplicado, e replicada como uma experiência independente, pelo menos, duas vezes. A parte superior de cada gráfico de barras representa a média dos valores observados dessas repetições, e
barras de erro
denotam ± o desvio padrão da média (SD).
humano normal as neuroesferas são menos sensíveis do que a BBMD3 GBM Derivado neuroesferas
Berbamine e seus derivados, também foram relatadas para exercer um efeito menos citotóxica para as células humanas normais [17] do que para GBM e outros tipos de células tumorais. Para avaliar ainda mais a citotoxicidade diferencial de BBMD3 para neuroesferas normais, testou-se os efeitos de BBMD3 em neuroesferas humanos normais derivados do cérebro fetal normal. A Figura 4B mostra a morfologia das neuroesferas normais, e os efeitos de BBMD3 em neuroesferas normais e as neuroesferas derivados dos quatro pacientes seguintes GBM uma exposição de 24 horas para a droga. Em comparação com as neuroesferas derivadas de tumor, a viabilidade neuroesfera normal é reduzida por exposição a concentrações crescentes de BBMD3, mas estas culturas de neuroesferas normais são menos sensíveis aos efeitos citotóxicos do BBMD3 do que as culturas de neuroesferas derivados dos 4 pacientes GBM.
BBMD3 aumenta a expressão de miR-4284 e miR-27a em PBT003, PBT008, PBT022 e PBT030 neuroesferas
Apesar de miRNAs são conhecidos há apenas alguns anos, eles foram encontrados para desempenhar papéis cruciais no processos que medeiam a tumorigénese, a angiogénese, a invasão celular e apoptose numa variedade de tipos de tumor. Estudámos, portanto, se o tratamento BBMD3 poderia alterar o perfil de expressão dos miRNAs no GBM células-tronco-like. As neuroesferas, derivados de PBT003, PBT008, PBT022 e pacientes PBT030 GBM, foram tratadas com 5 uM BBMD3 durante 16 horas, enquanto que as células de controlo foram tratados apenas com veículo (DMSO). MiARN total foi isolado a partir destas culturas de neuroesferas, e a expressão de cada miARN foi quantificada. Em comparação com os controlos, o tratamento BBMD3 expressão de alguns miARNs regulado para cima, e regulados negativamente a expressão de outros miARNs. A Tabela 1 mostra o perfil de expressão de miARN média, em relação às células-tronco-GBM como controlo não tratados, para cada um dos quatro pacientes a seguir ao tratamento BBMD3 GBM. miR-7 é a mais miARN regulada para baixo, com uma diminuição na expressão de 1,06 vezes. Em contraste, os dois a maioria dos miRNAs up-regulamentados são miR-4284 e miR-27a; aumentando 4,48 e 2,25 vezes, respectivamente. Relatou-se que a sobre-regulação de miR-23a, 27a, e 24-2 induz tanto dependente de caspases e de apoptose independente de em células de rim embrionário humano [31]. Até à data, temos sido incapazes de encontrar qualquer publicação que descreve a função reguladora (s) de miR-4284.
MIR-4284 Inibidor bloqueia os efeitos da BBMD3 sobre a viabilidade de GBM neuroesferas
Para confirmar se o aumento da expressão de miR-27a e miR-4284 induzida por tratamento BBMD3 correlaciona-se com a diminuição do GBM viabilidade neuroesfera, nós examinamos se o miR-27a e as sequências anti-sentido de miR-4284 pode inibir a actividade citotóxica de BBMD3. Nosso primeiro passo foi examinar se estes inibidores sozinho inibiu a viabilidade celular. 60 nM de inibidores humanos anti-sentido de miARN (isto é, oligonucleótidos sintéticos) contra HSA-miARN-4284 e HSA-miARN-27a foram transfectados em células derivadas de PBT008 e PBT030 neuroesferas. anti-sentido inibidor de micro-ARN independentes foi utilizado como controlo negativo, e 48 horas após a transfecção com estes inibidores de miARN, foi determinada a viabilidade das células. Os resultados mostrados na Fig. 5A demonstrou que os inibidores de miR-27A e miR-4284 sozinho não efectivamente diminuir a viabilidade celular em relação à das células não transfectadas (untran). Em seguida, testaram o efeito de inibidores de miR-27A e miR-4284 na actividade citotóxica de BBMD3 usando PBT008 e PBT030 neuroesferas. Após estas neuroesferas GBM foram transfectadas com, e deixou-se expressar durante 24 horas, o miR-27a e inibidores anti-sentido de miR-4284, ou a sequência de inibidor de miARN controlo, as células foram incubadas com 5 ^ M BBMD3 durante mais 24 horas, em cujo foi determinada a viabilidade celular ponto. Cada experiência foi realizada em triplicado.