adesão célula-célula

Abstract

é fundamental no fornecimento e manutenção estrutura multicelular e transmissão de sinais entre células. Na pele, interrupção para desmossômicas conectividade intercelular regulamentado pode levar a distúrbios de queratinização e doença hiperproliferativa incluindo câncer. Recentemente, nós mostramos camundongos transgênicos com superexpressão desmogleínas 2 (Dsg2) na epiderme desenvolvem hiperplasia. Na sequência de microarray e análise de rede gene, demonstramos que Dsg2 causou uma profunda mudança no transcriptoma de queratinócitos

in vivo

e alterou uma série de genes importantes na displasia epitelial, incluindo: proteínas de ligação de cálcio (S100A8 e S100A9), membros da família de proteínas ciclina, e o inibidor de protease de cisteína cistatina a (CSTA). CSTA é desregulamentado em vários cancros da pele, incluindo carcinomas de células escamosas (SCC) e mutações de perda de função levar a recessivos distúrbios fragilidade da pele. Os resultados de microarray foram confirmadas por qPCR, imunotransferência, e imuno-histoquímica. CSTA foi detectado em alto nível por toda a epiderme recém-nascidos do rato, mas diminuiu drasticamente com o desenvolvimento e foi detectada predominantemente nas camadas diferenciadas. Em queratinócitos humanos, knockdown de Dsg2 por siRNA ou shRNA reduzida expressão CSTA. Além disso, siRNA knockdown da CSTA resultou na localização citoplasmática de Dsg2, citoqueratina 14 perturbado coloração e níveis reduzidos de desmoplakin em resposta ao alongamento mecânico. Tanto o knockdown de qualquer Dsg2 CSTA ou induzida perda de adesão celular num ensaio baseado em dispase e o efeito era sinérgica. Nossos resultados aqui oferecer uma nova via de regulação CSTA envolvendo Dsg2 e uma interferência potencial entre Dsg2 e CSTA que modula a adesão celular. Estes resultados suportam ainda mais as recentes descobertas genéticas humanas que mutações de perda de função no gene resultam CSTA na fragilidade da pele devido à prejudicada adesão célula-célula: ictiose autossômica recessiva esfoliativa ou acral síndrome de descamação da pele

Citation:. Gupta A, Nitoiu D, Brennan-Crispi D, Addya S, Riobo NA, Kelsell DP, et al. (2015) Cell Cycle- e Câncer-Associated Gene Networks Ativado por Dsg2: Evidência de cistatina A desregulamentação e um potencial papel na adesão celular-celular. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10.1371 /journal.pone.0120091

Editor do Academic: Johanna M. Brandner, Hospital Universitário de Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 05 de setembro de 2014; Aceito: 02 de fevereiro de 2015; Publicação: 18 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Gupta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. dados de Microarray foi submetido a Gene Expression (Número de acesso: GSE62814) Omnibus

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health (Mahoney, R01AR056067; Riobo, SR1 GM088256).. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

desmososmas são as principais estruturas de adesão localizadas nas fronteiras célula-célula de células epiteliais onde os componentes da placa citoplasmáticos, incluindo a plakin (desmoplaquina) e famílias de queratina, montem o tatu (placoglobina e Placofilinas) e caderina (desmogleínas e desmocollins) famílias de proteínas [1,2]. Estas estruturas de adesão são essenciais não somente para a manutenção da estrutura e integridade celular, mas também para o desenvolvimento do tecido e morfogénese. As mutações dentro do desmosome são a causa subjacente de muitos distúrbios fragilidade da pele, com ou sem anormalidades cardíacas [3]. Além disso, também DESMOSSOMOS servir como “centros de sinalização” jogar um papel activo na modulação de várias vias importantes, incluindo a /β-catenina Wnt e do fator potenciador fator de células T /linfóide [4]. Cada vez mais evidências suporta a sua participação na modulação destino celular e sobrevivência. desmossômicas proteínas podem activar a sinalização intracelular através da modulação dos níveis de expressão e os padrões, ambos os quais podem alterar dramaticamente a adesão e proliferação de células [5,6]. Na epiderme interfolicular, Dsg2 é normalmente expressa em nível muito baixo e restrito à camada de células basais proliferativa. Recentemente, desenvolvemos um modelo de rato transgénico superexpressão desmogleínas 2 (Dsg2) na pele [5]. Nós determinamos que a expressão ectópica de Dsg2 ativa múltiplas crescimento e sobrevivência caminhos que podem promover o desenvolvimento e progressão do câncer. Embora os ratinhos transgénicos desenvolveram Inv-Dsg2 papilomas e pré-cancerosas foram mais susceptíveis à carcinogénese induzida quimicamente, o mecanismo pelo qual Dsg2 induz essas mudanças ainda não está claro. Recentemente, mostrou que Dsg2 associados com caveolin-1 proporcionando um mecanismo para a regulação da sinalização mitogénica e modular a apresentação da superfície da célula, sendo que ambos podem contribuir para a transformação maligna e progressão de tumores [7]. Neste relatório, buscou-se identificar genes associados com o fenótipo hiperproliferativa, comparando o perfil de ratinhos transgénicos Inv-Dsg2 com cDNA a partir de camundongos selvagens como um controle de expressão, por meio de análise de microarray.

Especificamente, encontramos Dsg2 foi associada com a regulação da cistatina a (CSTA; Csta1-3 rato), também referido como stefin a, ácido inibidor de protease de cisteína, keratolinin ou “inibidor epidérmica SH-protease”, um membro dos inibidores de protease de cisteína do tipo 1 [ ,,,0],8-11]. CSTA é expressa principalmente em células epiteliais e tecidos linfóides onde protege o processamento proteolítico de proteínas citoplasmáticos e citoesqueleto por cathepsins inibidores, as proteases de cisteína, lysozomal papaína-like [12-14]. portanto, não é surpresa que CSTA possui um número de funções biológicas, incluindo um papel bacteriostática para proteger os tecidos de proteases de cisteína que são produzidos por agentes patogénicos invasores [15]. na pele, CSTA foi originalmente identificada no envelope da célula cornificado e é sugerido para desempenhar um papel na função de barreira segmentação proteases do ácaro da poeira [16]. Mais recentemente, descobrimos que as mutações no

CSTA

gene são a causa genética subjacente da doença fragilidade da pele conhecida como ictiose esfoliativa com adesão célula-célula deficiente nas camadas inferiores da epiderme [17]. Além disso, as mutações recessivas CSTA pode ser associada com uma condição de descamação da pele acral [18,19]. Aqui, descrevemos uma série de estudos que investigam Dsg2 e CSTA na adesão dos queratinócitos.

declaração de Ética Materiais e Métodos

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética que opera sob Thomas Jefferson University interno animal Care e Use Committee (IACUC) aprovou protocolos (642B e 642D).

geração de camundongos transgênicos Inv-Dsg2

ratinhos transgénicos previamente estabelecidos que expressam Dsg2 na diferenciação camadas da epiderme, sob o controlo do involucrina (Inv) promotor (Inv-Dsg2) [5]. Resumidamente, o mouse

Dsg2

.

flag cDNA foi subclonado no pH3700-PL2 vector parental epitopo no

Não

I sítio de restrição a jusante do promotor involucrina. Genotipagem e caracterização de ratinhos transgénicos foram previamente descrito em detalhe [5]. controle do tipo selvagem e Inv-Dsg2 ninhada transgênicas de cerca de 6 semanas de idade foram utilizados para estes estudos.

análise Microarray

tecidos da pele do rato, armazenados em RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), foram pulverizados com um mortal e um pilão e homogeneizado num homogeneizador Dounce. O ARN total foi isolado utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e RNeasy (Qiagen) de acordo com os protocolos dos fabricantes. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN utilizando iniciadores aleatórios e hexa-M-MLV de transcriptase inversa (Sistema SuperScriptIII, Invitrogen). O ADNc da primeira cadeia foram sintetizados a partir de 5 ug de ARN total (de tipo selvagem e duas amostras de 2 transgénicos) por transcrição reversa e utilizados para gerar ARNc marcado com biotina por

In vitro

transcrição. Os microarrays foram então processados ​​usando estreptavidina-Alexa 647 conjugado. Após a hibridação, as lâminas foram lavadas digitalizada para adquirir sinais fluorescentes para cada ponto com um scanner confocal ScanArray XL-5000 (Perkin Elmer, Boston, MA). Para quantificar as intensidades de fluorescência de cada mancha da matriz, em imagens de 16 bits, foram analisados ​​pelo software matriz Quant 3,0 (PerkinElmer). Depois de processamento de imagem, os dados foram analisados ​​por GeneSpring 11,5 software (tecnologias de Agilent, Santa Clara, CA). Os valores de fundo com base em intensidades de sinal em torno de cada local foram subtraídos, e os resultados foram normalizados por normalização quantil e usando mediana transformação de linha de base de todas as amostras. dados de Microarray foi submetido a Gene Expression Omnibus (Número de acesso: GSE62814)

parcelas vulcão foram utilizados para identificar genes diferencialmente expressos (maior ou igual a 2 vezes e significância estatística de p 0,05) utilizando o Student

t

-test (não pareado) e há várias correções de teste. A lista gene expresso diferencialmente foi carregado na Ingenuity Pathway Analysis (IPA 9.0) software para análise de rede.

análise quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) de

RT-PCR e Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, e

Csta3

cDNA foi sintetizado a partir de 1 mg de RNA usando o High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Exon-medindo iniciadores de qPCR foram concebidos como segue:

Dsg2

, frente 5′-GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 ‘, reverso 5’-CTT GCT TCC ACC GTC AAG G;

Csta1

: frente 5′-TGC TAA CAA GGT CAG ACC TCA G-3 ‘, reverso 5′-CCA TGG TTT TGT CAG TCT GGT-3’;

Csta2

: frente 5′-TGA ATG TAG GAC GTG GTT GC-3 ‘, reverso 5′-GGG ATC AGG TCA AGT TGG AA-3’,

Csta2l1

: frente 5′- TGT CTT AAG TGG TAT TTC CAG TGA AAA CGA C-3 ‘, reverso 5′- CAT CTC TTT ACA ATG GGG GGG GG-3’;

Csta3

: frente 5′-GCC CAT CAA TGA GTC AAG AAA-3 ‘, reverso 5′-GGC CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3’ e para controle interno

GAPDH

: frente 5′-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA-3 ‘, reverso 5′-TCC ACC CTT CAA GTG GGC CCC-3’. Os ADNc foram amplificados em tampão de PCR contendo uma unidade de ADN-polimerase Taq (Qiagen), 200 uM de dNTP, solução 1 unidade Q, 0,5 uM de iniciadores. A amplificação de cada um dos ADNc foi um passo de desnaturação inicial a 94

° C durante 3 min e 35 ciclos de desnaturação a 94

° C durante 30 seg, emparelhamento a 58

° C durante 1 min e extensão a 72

° C durante 1 min, seguindo-se o último ciclo de extensão a 72

° C durante 7 min.

os níveis de expressão do gene foram ensaiadas por análise de qRT-PCR, usando 1 ml de o ADNc e SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acordo com um protocolo de amplificação padrão sobre um sistema de detecção ABI Prism Sequence 7900 (Applied Biosystems).

GAPDH

expressão foi utilizada para normalizar os dados. As sequências dos iniciadores utilizados para qRT-PCR para

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, e

Csta3 Quais são incluídos acima.

imunohistoquímica e Immunoblotting

A menos que indicado em contrário, todos os produtos químicos eram de qualquer Sigma (St. Louis, MO) ou Fisher (Waltham, MA). Para a histologia, os tecidos da pele foram fixados durante a noite em temperatura ambiente numa solução de formalina a 10%. Os tecidos foram embebidos em parafina, seccionados (4 uM), montadas em lâminas de vidro, e corados com hematoxilina e eosina. Para a imunocoloração, tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina foram aquecidos a 60 ° C durante 1 hora e desparafinados em xileno (3 vezes), EtOH a 100% (2 vezes), EtOH a 95% (2 vezes), 75% de EtOH, 50% EtOH, e H

2O [20]. Os antigénios foram recuperados por microondas em tampão de Tris-EDTA (10 mM Tris Base, uma solução mM de EDTA, 0,05% de Tween 20, pH 9,0). Os tecidos foram depois bloqueados em tampão de bloqueio (soro de cabra normal a 5%, 1% de BSA, 0,1% Ttriton X-100 em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente (RT), em seguida, incubadas com cistatina Um anticorpo (01:50; AB4065, Millipore , Temecula, CA), Dsg2 AB10 (1: 10.000) e Flag M2 (1: 500, Sigma) em tampão de bloqueio, durante a noite a 4

° C. Os tecidos foram lavados em PBS (2 vezes) e incubadas com Alexa Fluor 488 anti-coelho IgG e anti-rato IgG 594 (1: 400; Molecular Probes, Oregon) durante 1 h, à RT, no escuro. Os núcleos foram coradas com DAPI (1: 1000, Sigma) durante 1 min à temperatura ambiente no escuro, seguido por lavagem em PBS

Para as transferências Western, os tecidos da pele foram rapidamente congelados em azoto líquido, pulverizadas com mortal e pilão. e homogeneizados em tampão RIPA (Tris-HCl a 50 (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, inibidor da protease (PI) de cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e cocktail de inibidores de fosfatase (Fisher). foi determinada a concentração de proteína (kit BCA Pierce, Pierce Biotech, Rockford, IL) e imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [21], com ~ 20 ug de proteína em cada pista . resolvido por 4-20% de SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Os anticorpos primários usados ​​foram: Flag M2 (1: 2000, Sigma); actina (1: 5000; Calbiochem, San Diego, CA); cistatina Um (1: 1000; Millipore, Temecula, CA); Dsg2 humana (1: 100; Ab monoclonal 10D2); DSP I /II (1: 250; clone 5-11F; [22]); vinculina (1: 1000; . Abcam, Cambridge, Reino Unido) foram detectados sinais com a adição de anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 5000; Jackson Labs, Bar Harbor, ME), visualizadas por quimioluminescência (ECL; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Alternativamente, os sinais de cabra foram detectados utilizando anticorpos específicos anti-rato IR-800 CW tintura (1:. 20000; LI-COR gato 926-32210) ou de cabra anti-coelho IR Tintura 800 CW (1:. 20000; LI-COR gato 926 -32.211) e posteriormente analisada e quantificada pelo sistema de imagens Odyssey IV (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Western blot analisados ​​por quimiluminescência foram quantificados usando software ImageJ desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde (site: https://rsbweb.nig.gov/ij/). A análise estatística foi examinada usando

t

teste de Student com um

valor p

de 0,05 considerado significativo (*

p Art 0,05; **

p

0,01; ***

p

. 0,001), segundo o qual as medições quantificados a partir de três experimentos independentes foram normalizados para controlo de carga actina

cultura de células e siRNA knockdown de

Dsg2

e

CSTA

(carcinoma epidermóide da American Type Culture Collection, Bethesda, MD) A431 células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (P /S). As células A431 foram cultivadas até ~ 60% de confluência em pratos de 6 poços de cultura, privadas de soro durante 4 horas com 0,5% de FBS e 1% de P /S, antes da incubação com 100 nM mexidos ARNsi de controlo (D-001810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) ou reunidas siRNA para

Dsg2

(L-011645-00, Dharmacon) e

CSTA

(L-010020-00, Dharmacon) usando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) e de meio Opti-MEM (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram devolvidas à forma normal após 18 horas e incubou-se durante 72 h. As células foram lisadas em ureia 9 M, em seguida, preparada para análise de Western blot, conforme descrito acima. As células HaCaT foram tratadas com ARNsi por transfecção inversa, conforme as instruções do fabricante e utilizando Lipofectamina RNAiMAX. Para imunof luorescência, as células em cultura foram fixadas em MeOH a -20 ° C durante 10 min e permeabilizadas em 1% de TX-100 durante 5 min. Após locais não específicos foram bloqueados, as células foram incubadas com o anticorpo 10D2 para Dsg2 ou anticorpo CSTA (ver acima).

Em algumas experiências, as células tratadas com scrRNA ou

CSTA

siRNA foram semeadas sobre BioFlex placas de 6 poços contendo uma membrana de borracha flexível revestido com pronectin (Flexplates, Flexcell Internacional, Hillsborough, NC, EUA). As células foram cultivadas até ~ 80% de confluência, e as monocamadas foram sublinhados mecanicamente com um sistema de tensão Flexcell FX-4000 (Flexcell Internacional, Hillsborough, NC, EUA) como previamente descrito em detalhe [17] (Blaydon et al., 2011). As células foram esticados para 0-4 h, e, em seguida, fixadas e coradas para Dsg2 (1: 500; coelho AB10; [23]) e a queratina 14 (1: 100; clone LL001; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). As células também foram lisadas em tampão Laemmli de Western blot.

Knockdown de Dsg2 por shRNA

células A431 transfectadas de forma estável com o vector retro-puro pSUPER transportando nucleotídeos específicas destinadas shRNA para GFP (shGFP) ou Dsg2 (shDsg2) foram estabelecidas como anteriormente descrito em detalhe [24]. Resumidamente, dois oligos ( ‘5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT TCA AGA GAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC TTT TT-3’ e ‘5-AGC TTA AAA AGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT CTC TTG AAT TCT TGG ACA GAT CCT GGG CTC-3 ‘) foram sintetizados, recozido, e ligado em pSUPER retro-Puro (Oligo-Motor, Seattle, WA). produção e infecção por retrovírus foi realizada em células Phoenix. células A431 transfectadas foram mantidas em DMEM suplementado com FBS a 10% e puromicina (2 pg /ml).

dissociação de células baseado em Dispase ensaio

Para avaliar os efeitos de cistatina A e Dsg2 na célula adesão, células A431 Mock e shDsg2 foram plaqueadas em poços seis placas de cultura a uma densidade de 2 X 10

5 células /poço e em seguida tratou-se com 50 nM de ARNsi de controlo codificado ou siRNA para

CSTA

como descrito acima. Após 72 h, as células foram lavadas com solução salina equilibrada de Hank e incubadas com dispase (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) durante 5 min. As folhas de células levantadas foram submetidos a dispase baseado no ensaio de dissociação, pipetando cinco vezes usando uma pipeta de 1 ml. Os fragmentos celulares foram fixadas em solução de formalina a 3% e coradas com violeta de cristal. As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes. Notamos aqui, que esses experimentos foram realizados sem a adição de cálcio extra.

Resultados

análise Microarray comparação de tipo selvagem e Inv-Dsg2 rato transgénico pele

Mostramos recentemente que a sobre-expressão de Dsg2 sob o controlo do promotor de involucrina na pele de ratinhos transgénicos (Inv-Dsg2) resultou em hiperplasia da epiderme e sensibilidade para a indução de tumor [5] reforçada. Além disso, os ratinhos transgénicos Inv-Dsg2 também desenvolveram papilomas e foram mais susceptíveis à induzida quimicamente em duas fases carcinogénese da pele. Estas descobertas levaram-nos a realizar uma comparação dos perfis de expressão genética entre os ratinhos transgénicos e de controlo Inv-Dsg2. Para evitar flutuações de fundo e variações, os nossos ratinhos transgénicos Dsg2 foram cruzados para trás pelo menos 5 gerações C57BL6 fundo. Optamos por usar pele de espessura total, a fim de observar qualquer alteração na expressão gênica na derme que podem ter sido introduzidas pelos epiderme excedente. Deste modo, volta a pele a partir da mesma ninhada em 6 semanas após o nascimento foi usado

H . Secções de tecidos coradas de E-amostras de pele transgénicos exibiram hiperplasia extensa em comparação com a da pele de tipo selvagem (S1A Fig.). A expressão do transgene foi confirmada por análise de Western blot em que o anticorpo da bandeira detectada a proteína de 160 kDa na Dsg2.Flag transgénicas, mas não na pele de ratinho de tipo selvagem (Fig S1B.). Além disso, a microscopia de imunofluorescência verificada a expressão da proteína marcada com Flag Dsg2 na epiderme superficial do transgénicos, mas não de tipo selvagem murganhos (S1C Fig.). Estes resultados demonstram, como descrito anteriormente [5], de que a expressão ectópica de Dsg2 induz a hiperplasia epidérmica, sem alterar a expressão endógena de Dsg2. Em ambos rato e humanos epiderme interfoliculares, Dsg2 é expresso a nível significativamente baixa na camada de células basais, e que o nível de expressão diminui ainda mais com o desenvolvimento [5,25]. Em tecidos adultos, apenas um sinal minutos é detectado quando o nível de exposição é reforçada. Foram feitas tentativas de co-imunocoloração para Dsg2 e CSTA usando anticorpos anti-Dsg2. No entanto, devido à natureza desses anticorpos, baixa expressão de Dsg2 endógena, eo fundo a ser demasiado elevados (dados não mostrados), optou-se por utilizar anticorpos anti-FLAG para detectar a Dsg2 transgene marcada com Flag. Dsg2-Flag é expressa na epiderme superficial sob o controlo do promotor de involucrina dos ratos transgénicos como previamente descrito em detalhe [5].

amostras de RNA total isolado a partir da pele de duas transgénico e duas do tipo selvagem camundongos foram utilizadas para gerar sondas de ARNc marcado com biotina e depois hibridado com micromatrizes de oligonucleótidos que representam 21.619 genes de ratinho (Fig. 1a). Uma comparação dos sinais médios de genes revelou aproximadamente 492 genes alterados por mais do que duas vezes em resposta a expressão Dsg2 (Tabela 1 e Tabela S1). A trama vulcão revelou que 275 transcritos foram regulada e 217 reprimidos com significância estatística (p 0,05, mostrado em vermelho, Fig 1B.). Estes 492 genes modulados em resposta a Dsg2 foram ainda analisados ​​pelo Programa de Análise Ingenuity (Qiagen), que descreve os 5 principais redes de genes de acordo com o seu grau de relevância para as moléculas elegíveis rede no nosso conjunto de dados (S2 Tabela). Esta análise revelou forte associação com o ciclo celular (S2A Fig.) E vias de regulação Cancer (S2B Fig.). Um número significativo de genes envolvidos em diferentes fases de regulação do ciclo celular foram regulados positivamente (vermelho) em resposta a Dsg2 (e mais resumidos na Tabela S3). Da mesma forma, muitos genes envolvidos na tumorigênese também foram upregulated em resposta a Dsg2 incluindo, a quinase mitótico proteína checkpoint (

BUB1

) (S1 Table) eo 4-homeobox distal-menos (

DLX4

) ea proteína de suscetibilidade ao câncer (

BRCA1

) (S2B Fig.). Curiosamente no entanto, dois membros da família forkhead de fatores de transcrição,

FOXC1

(-9,0 vezes) e

FOXC2

(-11,7 vezes), foram reprimidos nos ratinhos transgénicos Inv-Dsg2. FOXC2, em particular, induz a transição epitelial-mesenquimal e desempenha um papel no fechamento palpebral [26,27]. Knockdown de expressão FOXC2 em células de cancro da mama anula o seu potencial metastático [28], implicando o seu papel no desenvolvimento do cancro. O papel de FOXC2 na homeostase da pele e ao desenvolvimento do cancro não é conhecido.

(A) RNA total foi isolado a partir da pele de 2-2 de tipo selvagem e ratinhos transgénicos Inv-Dsg2, reversamente transcrito, biotina marcado e aplicado a uma micromatriz de ADNc de rato. O dendograma (mapa de calor) mostra que 492 genes eram ou sobre-regulada (vermelho /laranja) ou para baixo-regulado ratos (azul /verde) em transgênica (T1 e T2) e de controlo (W1 e W2). plot (B) Volcano mostra a log2 (dobre mudança) no eixo x versus a-log10 (valor p) no eixo y. Os pontos tendo uma dobra-mudança inferior a 2 (log2 = 1) são mostrados a cinzento. As linhas verdes verticais demarcar onde a mudança vezes é igual a 2 (linha direita) ou igual a 2 (linha esquerda). A linha verde horizontal demarca onde o valor p é de 0,05, com pontos acima da linha com p 0,05 e pontos abaixo da linha ter p 0,05. Descrito em vermelho são os genes que exibem uma alteração maior do que 2 vezes com um p 0,05 na epiderme transgénicos, em comparação com o controlo. As setas indicam genes de interesse. (C) análise em tempo real de RT-PCR quantitativo revela uma média de 34,33 ± 1,32 vezes de aumento na expressão de ARN Dsg2 em Inv-Dsg2 transgénicos (Tg) em comparação com a de tipo selvagem (WT). Além disso, a expressão do RNA para transgênica em relação ao controle foram:

Csta1

, 113,24 ± 2,23;

Csta2

, 1.227,04 ± 1,26;

Csta2l1

, 1,11 ± 0,47;

Csta3

, 26,97 ± 0,44 (Bar = média ± sd; (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001;. Student

t

test)

a Tabela 2 lista os dez melhores genes que foram modulados em resposta a Dsg2. Esta lista composta por proteínas que codificam implicados na tumorigênese incluindo desidrogenase L-treonina (

TDH

, 39,2 vezes ) e proteína de secreção rica em cisteína (

CRISP3

, 8,8 vezes) a descoberta mais surpreendente foi a maior expressão da CSTA (

Csta1

, 18,4 vezes;.

Csta2

, 5,7 vezes; e

Csta3

, 12,4 vezes) e vários membros da família S100 da proteína ligante de cálcio (

S100A8

, 7,9 vezes;

S100A9

, 4,1 vezes; e

S100A4

, 2,3 vezes) (Figura 1B;.. Tabela 3) As proteínas S100A8 e S100A9 formar um complexo conhecido como calprotectina, que exibe actividades antimicrobianas e é mostrado para proteger as células epiteliais contra patogénios invasores [29]. Além disso, a expressão do gene de quatro membros da família de ciclina de proteínas também foram aumentadas, incluindo ciclina A2 (

Ccna2

, 5,8 vezes), B2 ciclina (

Ccnb2

, 5,4 vezes), ciclina B1 (

CCNB1

, 4,6 vezes), e ciclina E1 (

Ccne1

, 2,6 vezes), enquanto expressão de um membro, ciclina A1 (

Ccna1

, -2.0 dobre ) foi encontrado para ser diminuída (Tabela 3). A família de proteínas ciclina regula quinases dependentes de ciclina e controla a progressão das células através do ciclo celular [30]. Este resultado é consistente com nossos resultados anteriores mostrando que Dsg2 aumenta a proliferação celular. CSTA tem sido demonstrado que possuem actividade anti-apoptótica [31], é regulada positivamente em várias neoplasias epiteliais derivadas incluindo CEC [32], e é transformado em desordens de pele epidérmicos defeituoso herdado de adesão célula-célula [17-19]. Além disso, CSTA inibe cathepsins [33,34], que também são desregulados em câncer de pele [35-37]. Por essas razões, nós nos concentramos no restante deste estudo sobre CSTA. A relevância funcional das proteínas S100 e ciclina será examinado em detalhes em um estudo futuro.

A confirmação da Dsg2-modulação da expressão CSTA

foram confirmadas Os resultados microarray examinando a expressão de ARNm de rato CSTA (1, 2, 3 e 2L1) por RT-PCR (Fig S3.) e em tempo real de qPCR (Fig. 1C). Primeiro, o ARN total foi isolado a partir da pele de duas de tipo selvagem representativa individual e ratinhos transgénicos Inv-Dsg2, ADNc foi gerado e usado como molde para PCR confirma a regulação positiva de

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

, e

Csta3

em transgênica, em comparação com ratinhos de controlo (S3 Fig.). Nenhuma mudança na expressão do RNA foi observada com

Csta2l1

e

GAPDH

. Csta2l1 é altamente expresso no fígado fetal, medula óssea e baço e foi utilizado aqui como um controlo negativo para a pele [38]. Os dados de RT-PCR foi ainda validado por qPCR em tempo real utilizando biópsias de pele a partir de 3-3 de tipo selvagem e ratinhos transgénicos (Fig. 1C). Mais uma vez, a sobre-regulação de

Dsg2

(34,33 ± 1,32) foi observada na pele de ratinhos transgénicos, em comparação com a pele dos animais de controlo. Por tempo real qPCR, observou-se um aumento no

Csta1

(113,24 ± 2,23),

Csta2

(1227,04 ± 1,39), e

Csta3

(26,97 ± 0,44) , mas não

Csta2l1

(1,11 ± 0,47). Com a excepção de

Csta2l1

, todas as alterações de transgénicos, em comparação com amostras de controlo foram estatisticamente significativas. Curiosamente, a diferença obtida por alteração dobra em tempo real qPCR era significativamente diferente do obtido a partir de análise de microarray. Isto não é incomum e tem sido observada em outros sistemas [39]. Em resumo, a análise qPCR confirmaram os dados de microarray, demonstrando que a expressão ectópica de Dsg2 na epiderme causou um aumento na expressão de ARN do rato

CSTA

família de proteínas e que esta expressão aumentada é regulada pela sobreexpressão de Dsg2 na pele.

em seguida, os lisados ​​de pele de ratinhos recém-nascido e adulto de controlo (n = 3 cada) foram imunotransferidas para CSTA revelando alto nível na pele recém-nascidos, mas diminuiu dramaticamente em pele adulta (Fig. 2A), corroborando com observações anteriores [40]. Curiosamente, foi observada coloração tanto citoplasmática e nuclear para CSTA na pele recém-nascido do mouse por imunofluorescência (Fig. 2B). Não se observou qualquer diferença significativa no nível CSTA entre o tipo selvagem e ratinhos recém-nascido transgénico Inv-Dsg2 (não mostrado). nível No entanto, uma vez que foi CSTA baixo na pele de ratos adultos, a expressão ectópica da Dsg2 dramaticamente melhorada CSTA (Fig. 2C). O anticorpo da bandeira detectada a proteína marcada com Flag Dsg2 na transgénicas, mas não os ratinhos de tipo selvagem (Fig. 2C). Resultados semelhantes foram observados utilizando o anticorpo específico Dsg2 10D2 demonstrando que a expressão ectópica de Dsg2 na epiderme superficial não alterou o nível Dsg2 endógena (dados não mostrados). Devido à natureza dos anticorpos, que foram incapazes de realizar co-marcação para Dsg2 e CSTA. No entanto, as condições foram optimizadas para imunocoloração para a Dsg2 Bandeira-marcado (anticorpos anti-FLAG) e CSTA (Fig. 2D). Na pele Dsg2 Tg, CSTA foi expressa em células, independentemente da expressão do transgene, o que sugere um efeito não-autónomo. Coloração para CSTA também foi detectada nos corneócitos de ratinhos de tipo selvagem e aumentou nos ratinhos transgénicos (Fig. 2D). Embora CSTA não foi detectado por Western blot usando lisados ​​totais de pele, não podemos descartar que no envelope cornificado, CSTA pode ser altamente reticulada e, portanto, resistentes à lise em tampão de lise SDS /DTT.

(A ) análise de Western blot de lisados ​​da pele de 3 recém-nascidos e 3 adultos camundongos C57BL6 mostra alta expressão de CSTA no recém-nascido, mas virtualmente indetectável na pele de um adulto. Actina foi utilizado como um controlo para o carregamento igual. coloração (B) de imunof luorescência confirma os resultados de transferência de Western que mostram elevado nível de CSTA em pele de rato recém-nascido de tipo selvagem. imagem ampliada na inserção mostra citoplasmático, bem como coloração nuclear para CSTA. (C) análise de Western para Dsg2 e CSTA em adultos de tipo selvagem e de pele de rato transgénico Inv-Dsg2. Os resultados mostraram expressão do Dsg2 Bandeira-marcados e CSTA na transgénicas, mas não os ratinhos de tipo selvagem. Actina mostrou o carregamento igual. (D) A imunofluorescência foi realizada na pele de um adulto de tipo selvagem e ratinhos transgénicos que revelam um aumento dos níveis CSTA na pele transgénica. Os núcleos foram contra-coradas com DAPI (azul).

Ao contrário de humanos com apenas um

CSTA

gene, existem vários

CSTA

genes em ratinhos [41 ]. Embora a análise microarray detectados três

Csta1,

Csta2

e

Csta3

, não se sabe qual isoforma é expressa na pele do rato. Além disso, não se sabe qual rato CSTA é reconhecida pelos anticorpos disponíveis comercialmente uma vez que os epitopos para estes não foram mapeados. No entanto, especula-se que os anticorpos podem reconhecer todos Cstas devido à elevada homologia de sequência entre o ser humano e do rato e entre as diferentes isoformas do mouse.

Dsg2 modula a expressão CSTA

Para determinar se Dsg2 modula CSTA humana em queratinócitos, células A431 foram tratadas com siRNA específico para Dsg2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) ou RNA mexidos (scrRNA). Três dias após a transfecção, com scrRNA e siCSTA, análise de transferência de Western mostrou que o knockdown da CSTA não afectou a expressão de Dsg2 (S4 Fig.). Em contraste, uma redução drástica da Dsg2 por siDsg2 mas não scrRNA, resultou em pequeno, mas reprodutível redução da CSTA (Fig. 3A, B).