Abstract

ingenol-3-angelato (I3A) é uma organização não-tumor promovendo forbol composto éster-like identificados na seiva de

Euphoria peplus.

Semelhante a promoção do tumor ésteres de forbol, I3A é um diacilglicerol (DAG) análogo que se liga com alta afinidade para os domínios C1 de PKC, PKC recruta a membranas celulares e promove a activação da enzima. Inúmeras actividades anti-câncer têm sido atribuídas a I3A e atribuído aos efeitos do I3A sobre PKC. Mostramos aqui que I3A também se liga e activa membros da família dos activadores do RasGRP Ras conducentes à elevação robusta de Ras-GTP e o envolvimento da cascata de Raf-Mek-Erk cinase. Em resposta a I3A, proteínas recombinantes consistindo de GFP fundida separadamente a full-length RasGRP1 e RasGRP3 foram rapidamente recrutados para as membranas celulares, consistentes com a ligação directa do composto com o domínio de C1 RasGRP. No caso de RasGRP3, IA3 tratamento conduziu à fosforilação na regulação positiva T133 e activação da cinase reguladora PKCδ candidato. tratamento I3A de linhas celulares de linfoma select B não-Hodgkin resultou em alterações quantitativas e qualitativas em proteínas Bcl-2 membro da família e indução de apoptose, como já foi demonstrado com o bryostatin DAG analógico 1 e seu pico análogo sintético. Nossos resultados oferecem mais insights sobre as propriedades anticancerígenas de I3A, apoiar a ideia de que RasGRPs representar alvos terapêuticos potenciais de câncer, juntamente com PKC, e expandir a gama conhecida de ligantes para a regulação RasGRP

Citation:. Canção X, Lopez- Um Campistrous, Sun G, Dower NA, Kedei N, Yang J, et al. (2013) RasGRPs são alvos do Anti-Cancer Agente ingenol-3-angelato. PLoS ONE 8 (8): e72331. doi: 10.1371 /journal.pone.0072331

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2013; Aceito: 08 de julho de 2013; Publicação: 21 de agosto de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. A pesquisa foi apoiada por doações para JCS do Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP14630 concessão, http: //www.cihr-irsc .gc.ca), Instituto canadiano Cancer Research Society (CCSRI concessão 018.453, https://www.cancer.ca/Research.aspx), Fundação Alberta Câncer (ACF conceder 26050, https://albertacancer.ca) e Alberta Soluções engenho-de Saúde (200.100.408 https://www.aihealthsolutions.ca). A pesquisa também foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Centro de Pesquisa do Câncer, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Project Z1A BC 005270). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

diacilglicerol (DAG) é um segundo mensageiro potente que é gerado em células em resposta a estimulação de receptores de membrana de fosfolípido metabolismo. análogos de DAG e DAG, tais como PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) formas convencionais e novos de ligação de proteína-quinase C (PKC) por meio de um domínio conservado chamado C1. Este processo contribui para a localização da membrana de PKC e de activação de enzimas. A exposição prolongada aos análogos DAG também pode impactar negativamente a actividade da PKC através da degradação enzimática induzida. Alguns análogos do DAG, tais como PMA, são os promotores de tumor potentes. Outros análogos, tais como DAG prostratin e briostatina 1, são os promotores não de tumor ou pode de facto inibir a promoção de tumores. análogos DAG medicinais, tais como briostatina 1 exercem uma variedade de células anti-cancro e efeitos imunomoduladores. Com base em dados encorajadores pré-clínicos, bryostatin 1 tem sido objecto de ensaios clínicos extensa de câncer (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=bryostatin).

Outra analógico DAG medicinal de interesse clínico é ingenol -3-angelato (I3A). I3A foi identificado como um agente activo na seiva de

Euphorbia peplus

, que tem uma história de utilização em medicina tradicional, incluindo o tratamento de cancros da pele [1]. Pep005, uma formulação aplicada topicamente de I3A, está a ser avaliado em ensaios clínicos vigorosamente (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pep005 pg=2). Pep005 tem sido demonstrado eficaz no tratamento de queratose actínica [2] e está a ser desenvolvido para o tratamento de carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas [1]. Em diferentes modelos experimentais, I3A pode induzir necrose tumoral primária de células [3], a apoptose [4] e senescência [5]. efeitos anti-cancro de células-extrínseca tumoral de I3A incluem perturbações da vasculatura tumoral [6], o recrutamento de neutrófilos tumoricidas [7] e a geração de células T citotóxicas com actividade regressão do tumor [8]. I3A se liga a purificado isoformas PKC clássicas e novas

in vitro

[9]. tratamento I3A de células cultivadas resulta em rápida deslocalização destas enzimas para as membranas celulares [9]. Assim, alguns dos efeitos biológicos provavelmente surgem de activação I3A de PKC em células vivas.

Embora a pesquisa no início análogos DAG e da DAG com foco na sua regulação dos membros da família PKC, é agora claro que as famílias adicionais de proteínas existir com domínios C1 homólogos DAG vinculativos e que essas famílias servir papéis biológicos críticos [10], [11]. Os RasGRPs são reguladores positivos da pequena GTPase Ras. Os chimerins funcionam como reguladores negativos da pequena GTPase Rac, que regula o citoesqueleto de actina. MRCK (distrofia miotónica quinase relacionada com quinase de ligação CDC42) sinais a jusante da pequena GTPase Cdc42, controlar a formação de filopodia e influenciam a invasão tumoral. Munc13 membros da família regulam a fusão da membrana das vesículas sinápticas e da atividade sináptica. Proteína quinase membros da família D desempenham um papel fundamental na proliferação celular e a viabilidade. quinases DAG converter DAG para o ácido fosfatídico, atenuando a sinalização através das famílias de proteínas de DAG-responsivo acima, bem como potencialmente aumentando vias de sinalização de resposta ao ácido fosfatídico. Compreender a seletividade de agentes terapêuticos alvo para os domínios C1 DAG de ligação dessas outras classes de proteínas DAG vinculativos é, portanto, importante para a compreensão do seu potencial terapêutico e seus mecanismos de ação.

expressão de Alto Nível de RasGRP1 e RasGRP3 mostra a distribuição do tecido restrito, com expressão de destaque em linfócitos [12]. Um crescente corpo de evidências suportam a hipótese de que um papel fundamental destas proteínas é a funcionar a jusante dos receptores imunitários em células B e T [12]. estimulação do receptor imune conduz à activação de fosfolipase C e a acumulação de DAG na membrana. DAG influencia RasGRP1 e RasGRP3 através de dois mecanismos coordenados. Em primeiro lugar, os domínios C1 de RasGRP1 e RasGRP3 ligamento DAG e éster de forbol [13], [14], fazendo com que os RasGRPs a ser recrutados para as membranas celulares, onde eles encontram seu substrato, lipidada Ras. A deleção do domínio C1 provoca a perda de éster de forbol responsividade [15]. Além disso, RasGRP1 RasGRP3 e submetidos a uma activação por fosforilação de PKC, por si activado DAG [16] – [19]. a activação de Ras por RasGRPs é importante para a diferenciação de timócitos, a função efectora das células T, e a homeostase do linfócito [12]. RasGRP4, como RasGRP1 e RasGRP3, provavelmente também se liga e ativa DAG Ras [20], [21], embora a regulação por PKC não foi documentada. RasGRP4 mostra a expressão de destaque em mastócitos [21], mas também é encontrada em outras linhagens mielóides e timócitos precoce [22], [23].

Temos argumentado que RasGRPs podem constituir alvos de drogas viáveis ​​que poderiam ser manipulados com DAG análogos para fins clinicamente benéficos [24]. Em particular, demonstrámos que as linhas celulares derivadas seleccione a partir de certas formas de linfoma B-não-Hodgkin (NHL-B), sofrem apoptose quando são estimuladas com RasGRPs análogos DAG como briostatina 1 ou o análogo sintético “Pico”. Inicialmente, foi focada em DAG apoptose induzida por análogo na linha celular de Toledo, que provavelmente surgiram de uma malignidade derivada de centro germinativo. Mostrámos que a apoptose ocorreu dentro de 48 horas e envolvido fosforilação pró-apoptótica do BH3-Bim única proteína através da via RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk [25]. Mais recentemente, descobrimos um segundo mecanismo de apoptose induzida que foi observada no linfoma de Burkitt (LB) linha celulares derivados, BL-2, e linfoma de células em 5 de 6 manto (MCL), linhas celulares derivados [26]. A maioria destas linhas celulares foram BIM-deficiente e o mecanismo de apoptose foi associada em vez com alterações quantitativas em outros membros da família Bcl-2: Expressão da pró-apoptótica de BH3-único membro da família Bik geralmente aumentaram, enquanto que os membros anti-apoptóticos Bcl -XL e Mcl-1 diminuiu. Este segundo mecanismo procedeu muito mais lentamente do que a observada em células Toledo.

Aqui, mostramos que RasGRPs são alvos de I3A em células em cultura. Além disso, o tratamento I3A de linhas de células B-NHL representativos ativa os dois mecanismos RasGRP acoplado documentados anteriormente levando a apoptose.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

As experiências com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comité de política animal Ciências da Saúde e Bem-Estar da Universidade de Alberta, em conformidade com a Canadian Council on animal Care Guidelines.

Reagentes

ingenol-3-angelato foi comprado a partir de Calbiochem (La Jolla, CA) e foi dissolvido em DMSO a 1 mM. O estoque foi diluído para uma concentração final de 100 nM em meio salvo indicação em contrário e em comparação com DMSO diluída de forma semelhante. inibidores de MEK e reagentes para estudar a apoptose foram descritos anteriormente [25], [26]. PMA era de laboratórios LC (Woburn, MA), Gö6983, cocktail protease conjunto 1 e NP-40 eram da Calbiochem (Billerica, MA).

Cultura celular

Rat2 células foram modificadas para expressar o pBabePuro retrovírus vector ou os derivados de vector contendo ADNc que codificam RasGRP1, RasGRP3 ou RasGRP4 como previamente descrito [15]. Rat2 células foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal inactivado por calor suplementado com penicilina, estreptomicina e glutamina (Gibco, Burlington, ON, Canadá). linhas celulares de linfoma humano foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado como acima. As origens das linhas celulares foram publicados [25], [26]. A linha de células B Ramos, a linha de células de próstata LNCaP e células HEK-293 expressando GFP-RasGRP3 [28] foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS e 2 mM de glutamina (ATCC, Manassas, VA).

ratos

Rasgrp1 – /-

ratos foram previamente descritos [27] e foram mantidos na C57BL /6J. C57BL /6J foram utilizados como controlos de tipo selvagem.

I3A in vitro Estudos de Ligação

afinidades de ligação de I3A para o domínio RasGRP1 C1 e para RasGRP3 foram determinados como descrito anteriormente [13], [ ,,,0],14]. A temperatura de incubação, optimizado para a estabilidade das proteínas sob condições de ligação, foi de 37 ° C durante o domínio RasGRP1 C1 e 18 ° C durante RasGRP3.

análise de proteínas por imunotransferência

Análise de activa e total de Ras, pErk1 /2, membros da ERK1 /2 e Bcl-2 da família, a menos que indicado de outra maneira, foi descrito anteriormente [25], [26]. Para analisar RasGRP3 fosforilação, as células de Ramos foram tratadas com PMA, ou DMSO I3A veículo de controlo como indicado, durante 30 minutos, após o que foram colhidas em tampão de lise (1% de NP-40 em PBS com um cocktail inibidor de protease definida 1). Em alguns casos, as células foram pré-tratadas durante 30 min com o inibidor da pan-PKC Gö6983 (5 uM). A imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [28], utilizando os seguintes anticorpos: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling, # 3334), PKCδ (Santa Cruz, SC-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Cell Signaling, # 9106), ERK1 /2 (Cell Signaling, # 9102), β-actina (Santa Cruz, sc-47778). Após o desenvolvimento dos sinais de ECL (reforçada quimioluminescência), os filmes foram digitalizados e quantificação do sinal foi realizada utilizando ImageJ (National Institutes of Health).

microscopia confocal

A translocação de GFP RasGRP1 nas células LNCaP foi avaliado como descrito [29]. 60.000 células LNCaP foram plaqueadas em Ibidi u-pratos (Ibidi LLC, Verona, WI) e, em seguida, transfectadas após 48 h com o plasmídeo RasGRP1-codificando GFP utilizando o reagente Lipofectamine em combinação com sinais de adição de reagente de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA ) recomendações. Após 24 horas, as células foram tratadas com 1,000 nM de PMA ou de I3A em meio confocal (Dulbecco Modified Eagle Médium, sem vermelho de fenol suplementado com FBS a 1%), e as imagens de lapso de tempo foram recolhidos a cada 30 s utilizando o software Zeiss AIM. Imagiologia foi com um sistema de microscopia confocal Zeiss LSM 510 ou Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Inc.) com um microscópio invertido Axiovert 100 M operando com um laser de argônio de 25 mW ajustado para 488 nm. A 63 × 1.4 NA Zeiss Plan-Apochromat objectiva de imersão em óleo foi usado em conjunto com zooms variadas (1,4 a 2x). Para criar um vector para estes estudos hRasGRP1 foi inserido (NM-005739) para o vector pQB125-Fn1 por clonagem clássico utilizando

Nhe

I enzima de restrição de clivagem. As sequências de ADN das construções foram confirmadas por análise de sequência (ADN, minifocos, CCR, NCI, NIH).

células HEK-293 Membrana Fracionamento

expressando GFP-RasGRP3 [28] foram tratados ou com PMA I3A (1,000 nM ou 100 nM) durante 30 min ou DMSO como controlo de veículo. No final do tratamento, as células foram lavadas em PBS, removido das placas por raspagem e sedimentadas por centrifugação a baixa velocidade (5000 rpm durante 5 min numa microcentrifuga Eppendorf refrigerado). As células foram sonicadas (3 × 6 seg) em PBS suplementado com um cocktail inibidor de protease definida 1 e depois centrifugadas a baixa velocidade como acima para remover as células não rompidas. Alíquotas desta sobrenadante representando “proteína total” foram reservados para análise. O restante do sobrenadante foi em seguida submetida a centrifugação de alta velocidade (100.000 x g durante 1 hora) para se obter um sobrenadante “fracção citoplasmática”. O sedimento de alta velocidade foi lavada, dissolvido em 1% de Triton X-100, e material detergente insolúvel foi removido por centrifugação a alta velocidade, como acima. O sobrenadante final resultante representa a “fracção de membrana”. Frações de proteínas totais, citoplasmáticos e de membrana foram submetidos a eletroforese de poliacrilamida SDS e immunoblotting, com igual proteína carregada em cada pista.

apoptose e proliferação celular Ensaios

Os métodos para estudar a apoptose induzida por drogas e o ensaio de MTT para a acumulação de células viáveis ​​foram publicadas [26].

Resultados

Encadernação dos I3A para RasGRP1 e RasGRP3 in vitro

domínios Tanto o RasGRP1 eo RasGRP3 C1 foram mostrados anteriormente para vincular análogos DAG incluindo ésteres de forbol [13], [14]. Modelando indica que ingenol 3-ésteres de se ligarem aos domínios C1 de uma forma semelhante a ésteres de forbol e DAG [30]. Por conseguinte, foi avaliada a ligação de I3A usando um ensaio de competição usando [

3H] forbol 12,13-dibutirato, na presença de 100 ug /ml de fosfatidilserina (Tabela 1). RasGRP1 (domínio C1) e RasGRP3 (full-length) vinculadas I3A com 2 e 9 vezes maior afinidade, respectivamente, do que limitam o forbol éster PDBu. Em comparação com PKCα, RasGRP1 e RasGRP3 ligado I3A com afinidades aproximadamente semelhantes, indicando que não havia selectividade entre estas duas famílias de metas, pelo menos,

in vitro

.

I3A Ativa RasGRPs em cultivadas fibroblastos e Jurkat T Cells

fibroblastos Rat2 não detectável RasGRPs endógenos expressos. Assim, as células manipuladas para expressar Rat2 RasGRPs individuais, em comparação com células manipuladas para expressar o vector vazio, proporcionam um sistema conveniente para determinar se um análogo de DAG podem activar RasGRPs. Em comparação com células que expressam o vector vazio, as células que expressam Rat2 RasGRP1 mostrou activação de Ras robusto tal como avaliado utilizando um ensaio de suspenso que recuperado Ras-GTP ligado ao domínio de RAF1 (Fig. 1A) de ligação de Ras. I3A foi tão eficaz como PMA neste ensaio. Do mesmo modo, a expressão de RasGRP3 em células Rat2 conferiu uma capacidade para activar Ras em resposta a ambos os análogos do DAG (Fig. 1B). células T Jurkat expressam endogenamente RasGRP1 mas não quantidades apreciáveis ​​de RasGRP3 ou RasGRP4. tratamento I3A reprodutivelmente provocada a activação de Ras reprodutível em células T de Jurkat, semelhante ao observado com PMA (Fig. 1C).

. As culturas de células Rat2 modificadas quer com vector vazio ou RasGRP1 ADNc expressando vetor foram tratados com I3A ou PMA durante 10 minutos e em comparação com culturas de controlo utilizando o ensaio suspenso Ras-GTP. Os resultados são representativos de três experiências independentes. B. De um único Rat2 células que expressam ADNc RasGRP3 experiência foram analisados ​​de forma semelhante. C. As células T Jurkat foram analisados ​​para DAG activação de Ras induzida por analógicos em três experiências independentes. D. Um número igual de C57BL /6J (WT, tipo selvagem) e

Rasgrp1 viajantes – /- (KO, knockout) timócitos foram tratadas com DMSO (controlo negativo), I3A ou PMA, como indicado por 10 minutos e proteínas lisados ​​foram comparados utilizando o ensaio de sinalização fosfo-Erk. Os resultados são representativos das experiências em duplicado. A determinação quantitativa dos rácios de RasGTP /Ras ou P-ERK1 /2 /ERK1 /2 são apresentados a seguir os painéis individuais.

que anteriormente mostraram que era essencial para RasGRP1 DAG activação induzida por análogo de Ras em timócitos de ratinho;

Rasgrp1 viajantes – /- timócitos foram completamente defeituoso, enquanto de tipo selvagem (C57BL /6J) timócitos exibiram ativação Ras forte [27]. Porque nós tivemos um número limitado de células, foi utilizado o ensaio mais sensível fosfo-Erk como um substituto para a ativação do Ras. Como esperado, os timócitos mutantes demonstraram muito diminuída de sinalização de ERK quer após tratamento com PMA ou I3A (Fig. 1D). Colectivamente, estes resultados mostram que I3A, como PMA, pode activar e RasGRP1 RasGRP3. Um alto nível de Ras-GTP basal em células não tratadas frustrado experimentos semelhantes com vista a avaliar RasGRP4 em células Rat2. No entanto, usando um ensaio de morfologia celular foram coletadas evidências indiretas de que I3A e PMA cada um pode ativar RasGRP4 em células Rat2. RasGRP4 células que expressam Rat2 incubadas durante 48 horas em PMA ou I3A assumiu uma morfologia transformado, tal como previamente descrito para as células que expressam RasGRP1 Rat2 [15]. Este efeito não foi observado com células vetor vazios ou células que expressam Rat2 RasGRP4 não tratadas (dados não mostrados)

análogos do DAG activar RasGRPs por fosforilação mediada por PKC, bem como por recrutamento directo às membranas celulares [16]. – [19]. Usando a linha de células B Ramos, determinou-se a dependência da dose de I3A e PMA para induzir a fosforilação de RasGRP3 endógena no T133. Em paralelo, foi examinada tanto a activação de PKCδ, o que pode ser avaliado a partir do seu estado de fosforilação em S299 [31], assim como a resposta a jusante de Erk fosforilação. Para quinases como PKC que estão sujeitos a alostérica e regulação de posição, medidas de atividade da quinase isolado não constituem uma medida fiável do nível de

in vivo

atividade. Para PKCδ, fosforilação em S299 aparece para relatar a sua activação dependente do ligando [31]. Infelizmente, os anticorpos não são comercialmente disponíveis para locais de fosforilação que reflectem a activação de outras isoformas de PKC, distintas entre os muitos anticorpos de relatórios sobre a fosforilação de PKC na ansa de activação, transformar motivo, e o motivo hidrofóbico. Estes últimos sítios estão envolvidos na maturação da PKC tornando-a capaz de ser activada por ligação do ligando. Nós, portanto, apenas examinou a ativação de PKCδ em resposta a I3A e PMA. Outras isoformas de PKC reportados para células Ramos incluem PKCα, β, ε, e θ [32].

Neste sistema de células, observou-se que I3A e PMA mostrou potências aproximadamente iguais para ativação de PKC δ e para Erk ( A Fig. 2A). RasGRP3 fosforilação no T133 foi detectável a uma concentração ligeiramente mais baixa de qualquer ligando, o que sugere o envolvimento de outras isoformas de PKC, além de PKCδ. Para confirmar o envolvimento da PKC em RasGRP3 fosforilação, foi examinada a capacidade do inibidor de PKC geral Gö6983 para bloquear esses eventos de fosforilação (Fig. 2B). Por si só, o pré-tratamento com Gö6983 teve pouco efeito. Em contraste, as respostas ao tratamento com I3A ou PMA foram drasticamente diminuído. Em particular, a fosforilação de RasGRP3 no T133 foi quase totalmente abolida, consistente com a inibição da fosforilação PKCδ, como foi a resposta a jusante de Erk fosforilação. Do mesmo modo, em células T de Jurkat, o inibidor de PKC pan-bis indolemaleimide que aboliu a resposta a jusante de I3A de Erk fosforilação (Fig. 2C). Além disso, constatou-se que este inibidor de PKC diminuiu grandemente a formação de Ras-GTP em resposta a I3A, directamente demonstrando que o efeito de I3A em Erk fosforilação foi a montante de Ras e consistente com o requisito conhecido para a activação mediada por PKC da RasGRP1 além para o requisito para a ligação do ligando ao domínio RasGRP1 C1 [15], [18], [19].

. células de Ramos foram tratadas durante 30 minutos com as concentrações indicadas de I3A ou PMA seguindo-se análise de lisados ​​das células por imunotransferência. DMSO indica o controlo de veículo. As barras indicam a quantificação (média ± SEM) dos resultados de três experiências independentes. A immunoblot representativa é ilustrada. Deve notar-se que, embora o anticorpo RasGRP3 não é dirigido contra um local de fosforilação RasGRP3, ele produz consistentemente um ligeiro aumento no sinal em condições de RasGRP3 fosforilação. B. células de Ramos foram tratadas com 3 nM de PMA I3A ou, em alguns casos, após pré-tratamento com Gö6983 (5 uM durante 40 min), e analisadas como acima. As barras indicam a quantificação (média ± SEM) dos resultados de duas experiências independentes. A immunoblot representativa é ilustrada. Uma experiência adicional realizada sob condições semelhantes deram resultados semelhantes. C. As células T Jurkat foram estimuladas numa única experiência com I3A durante 10 min com ou sem 10 min de pré-incubação com o inibidor da pan-bisindolymaleimide PKC I (4,6 ^ M), seguido por análise de Ras-GTP, o total de Ras, pErk1 /2 e os níveis totais de ERK1 /2.

I3A Ativa RasGRPs em Select B-NHL linhas celulares

Nós já mostraram que análogos DAG como bryostatin 1 eo pico análogo sintético poderia ativar RasGRPs em linhas celulares de B-NHL que foram caracterizados como sensível à indução da apoptose por estes mesmos compostos [25], [26]. Tendo confirmado anteriormente que I3A agiu como um análogo da DAG em RasGRP1 /3, queríamos para explorar mais detalhadamente a capacidade deste composto para provocar a activação de Ras em linhas celulares analógicos representante DAG sensíveis B-NHL. O tratamento breve de BL2 (linfoma de Burkitt), Jeko-1, Z138 (ambos linfoma de células do manto) e Toledo (linfoma centro germinativo) resultou na ativação robusto de Ras (Fig. 3).

Em um único experimento, as células foram tratadas com 100 nM de I3A ou DMSO de controlo durante 10 minutos, seguido por análise de Ras-GTP pelo ensaio de puxar para baixo. A proporção de Ras-GTP /Ras foi quantificado.

I3A tratamento provoca intracelular Re-distribuição de RasGRP1 e RasGRP3

análogos DAG se ligar a uma fenda hidrofílica no domínio C1, completando uma superfície hidróf oba e aumentando assim a inserção na membrana do análogo DAG – complexo domínio C1 [33]. DAG e da DAG análogos contribuir, assim, para a ativação RasGRP em parte, fazendo com que estas proteínas para re-localizar a membranas celulares, onde eles podem fisicamente interagir com Ras lipidada [34]. Estudámos, portanto, a capacidade de I3A para induzir a redistribuição de proteínas utilizando ambos

In situ

e abordagens de fracionamento subcelular.

Para

estudos in situ

, GFP-RasGRP1 foi expressa em LNCaP células. Após o tratamento com PMA ou I3A, alterações no padrão intracelular de proteínas marcadas foram visualizadas por microscopia confocal. As células LNCaP foram escolhidas por sua morfologia bem espalhar facilita a criação de imagens. Eles são fáceis de transfecção e temos tido uma vasta experiência com os efeitos de vários ésteres de forbol em PKC translocação neste sistema [29]. Antes do tratamento, a GFP-RasGRP1 foi distribuído por todo o citoplasma (Fig. 4). Após a PMA (1000 nM) adição, GFP-RasGRP1 translocado para a membrana de plasma dentro de 2 minutos. I3A igualmente induziu uma resposta rápida, mas o padrão foi marcadamente diferente, com o clustering pronunciado em locais internos.

Células expressando GFP-RasGRP1 foram tratados com 1000 nM PMA ou I3A. O padrão de translocação foi examinado em células vivas, como uma função do tempo. Os resultados de experiências em duplicado estão apresentados com I3A. As imagens apresentadas são representativos de quatro experiências independentes. A barra de escala representa 10 um.

Como uma abordagem complementar, que expressa GFP-RasGRP3 em células HEK-293, tratados com I3A ou PMA, sujeita as células para fracionamento subcelular, e examinou as mudanças no distribuição de GFP-RasGRP3 entre fracções citoplasmáticas e de membrana (Fig. 5). GFP-RasGRP3 foi detectada tanto com um anticorpo dirigido contra a própria RasGRP3, bem como com um anticorpo contra o marcador GFP. Para efeitos de comparação, foram também examinados mudanças na distribuição de PKCδ endógena.

HEK-293 células expressando GFP-RasGRP3 foram tratados durante 30 minutos com PMA ou I3A nas concentrações indicadas. sonicados de células foram submetidos a fraccionamento subcelular e os níveis de PKCδ RasGRP3 e foram analisados ​​por imunotransferência. Para RasGRP3, a expressão foi detectada tanto com um anticorpo anti-RasGRP3 e com um anticorpo contra o marcador GFP. As barras indicam a quantificação (média ± SEM) dos resultados de três experiências independentes. Uma imunotransferência representativa está ilustrada.

O tratamento com I3A induziu um claro aumento do nível de GFP-RasGRP3 recuperada na fracção de membrana, detectados com anticorpo, assemelhando-se a resposta observada com PMA. A perda de GFP-RasGRP3 a partir da fracção citoplasmática foi menos óbvia, mas estes resultados devem ser temperada pela observação de que a proteína detectada na amostra de proteína total foi ligeiramente elevada em amostras tratadas analógicos DAG, por razões desconhecidas. Na mesma experiência, tanto I3A e PMA induzida redistribuição de PKCδ à fracção de membrana.

I3A tratamento afeta proteínas Bcl-2 em Select B-NHL linhas celulares

Em nossos estudos anteriores nós comparamos a linha de células sensíveis à analógica DAG Toledo a RL, um tipo de centro germinativo linha DAG analógico resistente B-NHL de células [25]. Nós relataram que a apoptose induzida por análogos de DAG em células B-NHL Toledo foi dependente da proteína pro-apoptótica de BH3 somente Bim [25]. Em células Toledo B-NHL, o tratamento com briostatina 1 ou Pico resultou em RasGRP-Erk sinalização e fosforilação do BIM em um site pró-apoptótica que é comum a ambas as formas de splicing BimL BimEL e. Também mostramos que a fosforilação anti-apoptótico em locais únicos para BimEL levou a proteólise eficiente de um modo dependente-proteossoma no análogo-resistente à linha de células RL DAG. No entanto, este mecanismo anti-apoptótica foi menos evidente em Toledo. Nossos resultados atuais com I3A mostram exatamente o mesmo padrão: BimL assumiu uma mobilidade eletroforética reduzida, indicativa de fosforilação, após o tratamento I3A em ambos os RL e Toledo (Fig 6A.). I3A também induziu fosforilação de BimEL em ambos RL e Toledo. No entanto, BimEL infra-regulação em Toledo era relativamente ineficiente após o tratamento I3A (Fig. 6A), assim como nós descoberto anteriormente para bryostatin 1 e pico [25].

As linhas celulares indicadas foram não tratada ou tratada para 3 dia (BL2, UPN1, Z138) ou durante 24 horas (RL) e Toledo. Os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos para as proteínas indicadas. Os painéis A e B foram obtidos a partir de géis em duplicado. Erk foi utilizado como um controlo de carga.

Mais recentemente, mostraram que o tratamento do pico induzida apoptose em linha celular de linfoma de Burkitt o BL2 e em 5 de 6 linhas de células de linfoma das células do manto, a maioria das quais eram Bim- deficiente [26]. Nestes casos, a apoptose foi associada com aumento da expressão de Bik e a diminuição da expressão de MCL1 e Bcl-XL. Nos presentes estudos, encontramos que Bik foi induzida por tratamento I3A em BL2 e Z138, uma linha de células do linfoma das células do manto representativa (Fig. 6B). Especialmente em BL2, a maior parte do Bik expressa tinha aumentado mobilidade electroforética. Este fenómeno, o que pode reflectir o splicing alternativo de ARNm ou modificação pós-translacional, foi previamente observado nas células tratadas-Pico [26]. Em contraste, a linha celular UPN1 MCL DAG análogo-resistente não exibiu expressão Bik-induzida I3A. Ambos BL2 e Z138 mostrou IA3 induzida por diminuição da expressão de MCL1 e Bcl-XL, mas estes efeitos não foram tão evidente em UPN1 células (Fig. 6B). Em todos os aspectos, os resultados obtidos aqui com I3A paralelo aos obtidos com bryostatin 1 e seu pico analógico em nossos estudos anteriores [25], [26].

I3A induz a apoptose em Select B-NHL linhas de células

para determinar se I3A pode induzir apoptose em linhas celulares de B-NHL previamente demonstrado ser sensível a briostatina 1 e /ou o seu pico análogo, foram utilizados três protocolos de marcação celular diferentes e citometria de fluxo, como descrito anteriormente [25], [26]. Além das linhas de células mencionadas acima, foram incluídos na análise as linhas celulares MCL DAG-sensível analógicas previamente caracterizados Mino, rec1, e SP53 e a resistência de Burkitt linha celular de linfoma Daudi. A incapacidade das células para acumular TMRE (éster etílico de tetrametilrodamina) foi utilizado para detectar a perda do potencial de membrana mitocondrial externa (Fig. 7A). Em alguns casos, foram usados ​​os inibidores U1026 ou PD184352 Mek para avaliar o papel da via de sinalização de Ras canónica na apoptose. A caspase fluorescente pseudo-substrato foi utilizado para detectar a actividade da caspase global (Fig. 7B). ADN final de marcação utilizando-dUTP e transferase terminal (TÚNEL) foi empregada para monitorizar a fragmentação de ADN nuclear (Fig. 7C). resultados representativos são apresentados na Figura 7 e os resultados estão resumidos na Tabela 2. Em geral, I3A induzida extensa apoptose em linhas celulares sensíveis DAG-analógicos (Toledo, BL2, Jeko-1), mas muito menos em linhas de células resistentes (RL , UPN1 e Daudi). Perda de coloração induzida por TMRE I3A em células de Toledo foi largamente anulada por inibidores de MEK (fig. 7A), mas este efeito foi menos dramático em algumas das linhas celulares de MCL (dados não mostrados).

. células RL e Toledo foram tratados durante 24 horas, incubadas com TMRE, e analisados ​​para a absorção da mancha por citometria de fluxo. Em alguns casos, as culturas foram incubadas quer com U0126 ou PD184352 para avaliar os efeitos da inibição do Mek. B. UPN1 e células Jeko-1 foram incubadas com DMSO ou 100 nM de I3A durante 4 dias e depois analisadas com CaspACE ™ para detectar a activação da caspase.