Abstract

Fundo

A via Hippo regula tamanho do órgão inibindo a proliferação celular e promover a apoptose das células após a sua ativação. A proteína Sim Associated 1 (YAP1) é um efector da via nuclear Hipopótamo que promove o crescimento celular como um co-activador de transcrição. No cancro humano, o gene YAP1 foi reportado como amplificado e sobre-expresso em muitos tipos de tumor.

Métodos

coloração imuno-histoquímica da proteína YAP1 foi utilizado para avaliar a expressão de YAP1 em tecidos tumorais pancreáticas . siRNA oligonucleótidos foram utilizados para a expressão de knockdown YAP1 e seus efeitos em células de cancro pancreático foram investigadas utilizando a proliferação celular, apoptose, e ensaios de crescimento independente de ancoragem. A postos sinalizados de Wilcoxon, coeficiente de correlação de Pearson, de Kendall Tau, Rho de Spearman, e um dois-amostra independente

t

(bicaudal) de teste foram usados ​​para determinar a significância estatística dos dados.

resultados

estudos imuno-histoquímica em tecidos tumorais pancreáticas reveladas YAP1 intensidades de coloração foram moderada a forte no núcleo e citoplasma das células tumorais, enquanto o epitélio normal adjacente mostrou negativo para coloração fraca. Em células em cultura, a expressão YAP1 e localização foi modulada por densidade de células. YAP1 expressão de proteína total aumentada nas fracções nucleares em BxPC-3 e PANC-1, enquanto que diminuiu em HPDE6 como densidade celular aumentada. Além disso, o tratamento de linhas celulares de cancro do pâncreas, BxPC-3 e PANC-1, com YAP1-segmentação oligonucleotídeos siRNA reduziu significativamente a sua proliferação

in vitro

. Além disso, o tratamento com oligonucleotídeos YAP1 siRNA diminuiu o crescimento independente de ancoragem em agar suave de células de câncer de pâncreas, sugerindo um papel da YAP1 na tumorigênese do câncer de pâncreas.

Conclusões

YAP1 é overexpressed em câncer pancreático tecidos e, potencialmente, tem um papel importante na clonogenicidade e crescimento das células de câncer de pâncreas

Citation:. Diep CH, Zucker KM, Hostetter G, Watanabe a, Hu C, Munoz RM, et al. (2012) regulação negativa dos Sim Associated Protein Expression 1 reduz a proliferação celular e clonogenicidade de câncer pancreático Cells. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10.1371 /journal.pone.0032783

editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos da América

Recebidas: 1 de junho de 2011; Aceito: 02 de fevereiro de 2012; Publicação: 01 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Diep et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional do Cancer Research, a família Katz, eo Programa Helios Scholars. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Como uma das formas mais letais da doença humana, o câncer de pâncreas tem uma taxa de sobrevivência de um ano e cinco anos, de 26% e 6%, respectivamente [1]. Existe uma necessidade crítica de novas estratégias de tratamento para proporcionar um efeito intencional sobre a sobrevivência de pacientes com câncer pancreático.

A via Hippo regula tamanho do órgão inibindo a proliferação celular e promove a apoptose de células [2], [3] . Componentes de Hipona via foram identificados em rastreios genéticos em mosaico

Drosophila

, que consistem na Hipo (Hpo) quinase, a proteína Salvador (SAV) do adaptador, a proteína quinase STV, o adaptador de proteína de rato, e o Yorkie (Yki) nuclear transcricional co-activador. Após a ativação da via, Hpo e Sav fosforila e ativa Wts em conjunto com Mats. Wts fosforila Yki para inactivar e guarde-o no citoplasma. Nos mamíferos, os componentes da via Hipopótamo são homólogos, que incluem MST1 /2 HPO () altamente conservada, WW45 (SAV), LATS1 /2 (WTS), MOB1 (Pad), e YAP1 (Yki) [4] – [ ,,,0],8].

Similar ao

Drosophila

modelo, os componentes principais do hipopótamo de mamíferos formam complexos de cinase de proteínas que actuam em uma cascata de fosforilar YAP1 (também conhecido como YAP ou YAP65) e colocá-la no citoplasma [6], [7], [9], [10]. Como o principal alvo a jusante da via de Hipona, YAP1 é um paradoxo. Como um oncogene, a amplificação do locus do gene YAP1 em 11q22 é encontrado em vários tipos de cancro, incluindo o carcinoma hepatocelular, cancro da mama, carcinomas de células escamosas orais, meduloblastoma, e carcinomas de células escamosas do esôfago [11] – [15]. Além disso, a sobre-expressão da proteína YAP1 e a sua localização nuclear foram observados em cólon, fígado, pulmão, ovário, e próstata [6], [12], [16]. Overholtzer e colegas relataram que a sobre-expressão de YAP1 em uma linha de células epiteliais imortalizadas MCF10A resultou na sua transformação oncogénica [11]. Em contraste, YAP1 também foi encontrada para estabilizar e aumentar a morte celular por apoptose dependente de p73 durante a danos no ADN induzida por cisplatina [17]. AKT, um jogador chave em vários percursos de sobrevivência celular, tem sido demonstrado que fosforila YAP1, a fim de suprimir a expressão de gene pró-apoptótico [18]. Num subconjunto de cancros da mama, a expressão da proteína foi YAP1 significativamente diminuída devido à perda de heterozigosidade, e shRNA knockdown de YAP1 aumento da migração, capacidade de invasão e crescimento do tumor [19]. No geral, estes resultados sugerem que a expressão eo papel do YAP1 no câncer pode ser tipo de célula e /ou contexto celular dependente.

Neste estudo, procurou-se elucidar o papel do YAP1 em câncer pancreático. Foi examinada a expressão da proteína YAP1 e localização nos tecidos tumorais pancreáticas retiradas de doentes com cancro do pâncreas e investigados os efeitos fenotípicos da YAP1 down-regulation em linhas de células pancreáticas cultivadas. Nós determinamos que YAP1 é overexpressed em tecidos tumorais pancreáticas, e a regulação da YAP1 diminuiu a proliferação e clonogenicidade de células cancerígenas pancreáticas cultivadas.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

as linhas de células do cancro do pâncreas AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, e PANC-1 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). As linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gemini Bio-products, Woodland, CA), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 mg /mL) (Invitrogen). A linha imortalizada humana ductal pancreático das células epiteliais, HPDE6, foi fornecida pelo Dr. Tsao MS (Universidade de Toronto, Canadá) e cultivadas em meio livre de soro suplementado queratinócitos com extracto de pituitária bovina (30 ug /mL) e factor de crescimento epidérmico (0,2 ng /mL) (Invitrogen) [20], [21]. A linha imortalizada humana ductal pancreático das células epiteliais, hTERT-HPNE, foi obtida a partir de ATCC e cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 20% [22]. Todas as células foram cultivadas rotineiramente num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO

2. identidades linha celular foram verificados como descrito anteriormente [23].

imunohistoquímica e análise (IHC)

A tissue microarray (TMA) foi construído a partir de blocos embebidos em parafina de 66 casos únicos de pâncreas adenocarcinomas ductais, 5 casos de pancreatite crónica, e 6 amostras de pâncreas normal, como descrito anteriormente [24]. Para cada caso de câncer, dois núcleos de tumor e um núcleo normal adjacente foram perfurados para o TMA. Os blocos de TMA foram seccionados a 5 um de espessura, transferidos por flotação de água, e secou-se durante a noite à temperatura ambiente. As lâminas foram desparafinados, reidratados e antígeno recuperados on-line sobre o Autostainer BondMax ™ (Leica Microsystems, Inc Bannockburn, IL). Todas as lâminas foram submetidos ao calor de recuperação de epítopo induzida utilizando uma solução de recuperação de base de EDTA (Leica Microsystems) durante 20 minutos. A peroxidase endógena e biotina foram bloqueados. As secções TMA foram incubadas durante 30 minutos a 1:125 com YAP1 (H-125) o anticorpo a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). As secções foram visualizadas utilizando o kit de ligação ™ Polímero Refinar Detecção (Leica Microsystems) usando o cromogénio diaminobenzidina como substrato e pontuados como previamente descrito [24]. O teste de classificação assinado Wilcoxon foi utilizado para comparar o nível de expressão YAP1 entre o tumor e suas amostras normais adjacentes. O teste de rank-sum de Wilcoxon foi utilizado para comparar a expressão YAP1 entre o tumor e pancreatite, bem como amostras de pâncreas normal a partir de um grupo separado de indivíduos. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para estimar e testar a associação entre a expressão nuclear YAP1 e histopatológicos (grau tumoral, estádio, e doença em linfonodos regionais), e análise de sensibilidade foi realizada utilizando tau de Kendall e rho de Spearman.

Análise de imunotransferência YAP1

Para alcançar a densidade celular necessária após 48 horas de crescimento, BxPC-3, PANC-1, e as células foram semeadas em HPDE6 da seguinte maneira em T175 cm

2 frascos em completa meios de crescimento: dois milhões de células para 20-30%, quatro milhões de células para 50-70%, e sete milhões de células para 100%. As células foram lavadas com DPBS, tratadas com tripsina, e, em seguida, contados no Cellometer Auto T4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, MA). Quatro milhões de células foram usadas para o fraccionamento sub-celular utilizando o Kit BioVision Nuclear /citosólico Fraccionamento (Mountain View, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Para gerar os lisados ​​de células inteiras de um milhão de células foram lisadas em tampão RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) com o cocktail de protease e fosfatase 1X inibidor (Roche) e incubadas em gelo durante 30 minutos. Os extractos foram centrifugados a 14000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Um total de 20 ug de proteína por faixa foi separado por electroforese em gel de NuPAGE Bis-Tris a 4-12% (Invitrogen). As membranas foram incubadas quer com um Phospho-YAP1 (Ser127) anticorpo (Cell Signaling) em 1:2000 diluição ou um YAP1 total (H-125) anticorpo (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) a diluição durante a noite a 1:2000 4 ° C e, em seguida, expostos a anticorpo anti-IgG de coelho ligado a HRP (Cell Signaling) em 1:3000 diluição à temperatura ambiente durante 1 hora. PARP (Cell Signaling) em 1:2000 diluição serviu como controlo de carga para a fracção nuclear, enquanto α-tubulina (Cell Signaling) em 1:2000 diluição serviu como um controlo para os lisados ​​de células inteiras e fracção citosólica.

tratamento de siARN e Proliferação celular Ensaios

expressão YAP1 silenciamento foi alcançado com dois oligonucleótidos duplex de siRNA alvejando YAP1 duas regiões diferentes de YAP1 transcrição (Qiagen, Valencia, CA) a uma concentração final de 20 nM utilizando a transfecção siLentfect reagente (Bio-Rad) de acordo com o protocolo do fabricante. Os ARNsi foram reversa-transfectadas por incubação dos ARNic em 10 ul de meio RPMI 1640 meio de cultura celular isento de soro (Invitrogen) contendo 50 ul da mistura reagente lipídico siLentfect (Bio-Rad) por poço e dispostas em placas de 96 poços. O reagente de transfecção siRNAs e foram deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, as células foram plaqueadas a mistura reagente siRNA-transfecção a 4800 células /poço e de soro suplementado com uma concentração final de 5% para BxPC-3 e 2% para PANC-1. Para a linha de células HPDE6, 6000 células /poço foram plaqueadas para ARNsi-transfecção mistura reagente na forma de queratinócitos. As placas foram armazenadas num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO

2. Após 24 horas, o meio de transfecção foi removido de cada poço e substituído com meio de crescimento suplementado com soro fresco. A viabilidade celular foi determinada pela adição de 100 ul da CellTiter-Glo Luminescent Assay (Promega, Madison, WI) a cada poço. As placas foram incubadas a 37 ° C durante uma hora, e a luminescência foi gravado com o leitor de microplacas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT).

A apoptose e ciclo celular análise

A transfecção YAP1 de siRNAs para as linhas de células pancreáticas foi como descrito nos estudos de proliferação de células acima. Noventa e seis horas após a transfecção inicial, caspase-3 e -7 actividades foram determinadas por adição de 100 ul da Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) a cada poço. As placas foram incubadas a 37 ° C durante uma hora, e a luminescência foi gravado com o leitor de microplacas Synergy HT (BioTek). A actividade da caspase em células tratadas com siRNA foi normalizada para a do as únicas células controlo.

análise do ciclo celular de YAP1 siARN tratada linhas de células pancreáticas foram como previamente descrito [23].

Anchorage- ensaios independentes

em placas de 6 poços, 250000 células (BxPC-3 e PANC-1) foram transfectadas com 20 nM de reverso da YAP1 siRNAs (Qiagen) durante 48 horas (a 72 horas para a extracção de proteína e imunotransferência análise). As células foram lavadas com DPBS, tripsinizadas e contadas por exclusão com azul de tripano. Seis mil células BxPC-3 viáveis ​​e 3.000 células viáveis ​​PANC-1 foram misturados com 1 ml de meio de crescimento e 0,3% de agar e, em seguida mergulhados em 0,5% de agar em pratos de camas de grelha de 35 mm. As células foram deixadas a crescer durante 21 dias e toda a área do prato foi contado. As colónias maiores do que 50 células foram contadas como positivas para a transformação. Os ensaios foram realizados em triplicado.

restantes células de transfecção foram mantidos para o ARN e a extracção de proteínas. Para extracção de RNA, o Kit RNeasy Mini (Qiagen) foi utilizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Um micrograma de ARN total foi usada numa reacção de 20 ul de síntese de ADNc (Quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). As reacções foram realizadas em 1 ul da mistura de reacção de ADNc, 10 ul de SYBR Verde /Taq Polimerase master mix (Roche, Indianapolis, IN), 4 ul de iniciadores (YAP1, 5′-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 ‘e 5’-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 ‘; GAPDH, 5’ -di-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3 ‘e 5′-GGTCCACCACCCTGTTGC-3’, a uma concentração final de 400 nM), e água 5 ul para um volume final de 20 ul. A única cor em tempo real do sistema de detecção por PCR da Bio-Rad MyIQ (Hercules, CA) foi usado para realizar a RT-PCR. amplificação em dois passos (95 ° C durante 30 seg e 58 ° C durante 30 seg) foi repetido durante 40 ciclos. A seguir à reacção de PCR, uma análise da curva de fusão foi realizada (60 ° C durante 5 seg) durante 35 ciclos. Os dados foram analisados ​​usando o comparativo C

método de T [25]. Análise de toda lisado celular expressão nível de proteína de YAP1 foi como anteriormente descrito, com a excepção de que o siRNA-tratamento foi de 72 horas.

Resultados

YAP1 é sobre-expressa em adenocarcinomas do ducto pancreático (PDA )

Para avaliar o nível de expressão de proteína YAP1 em tecidos PDA, realizamos imunocoloração utilizando um tissue microarray (TMA). Entre os casos 66 PDA contidas no TMA, 64 foram avaliáveis ​​para a coloração do tumor, dos quais 33 apresentaram o mesmo epitélio normal. O anticorpo YAP1 apresentou coloração nuclear e citoplasmática tanto, o que é consistente com a função conhecida de proteína celular YAP1 – YAP1 está localizada no citoplasma quando é inactivado e é translocado para o núcleo quando activado. Foi avaliada a intensidade de coloração tanto para YAP1 nuclear e citoplasmática e resumida das pontuações na Tabela 1. Cerca de 77% (49/64) dos casos de PDA tinha positivo (marcou 1+ ou superior) coloração YAP1 nuclear em células de tumor, 63% ( 31/49) de que tinha 3+) coloração moderada (2+) ou forte (. Em contraste, apenas 48% (16/33) dos casos tinham coloração positiva no epitélio normal adjacente, com apenas 18% (6/33) tinham coloração moderada ou forte. Por outro lado, as intensidades de coloração no citoplasma são comparáveis ​​entre o tumor e tecidos normais adjacentes, em que 56% (36/64) dos casos tinham 2+ ou superior coloração no tumor e 43% (14/33) tiveram 2+ ou superior coloração em epitélio normal adjacente. Análise dos casos de tumor combinando com tecidos normais adjacentes usando Wilcoxon Signed Rank Test também mostraram significativamente maior expressão nas células tumorais em relação a células ductais normais adjacentes, com um valor de p de 0,0002. Mas, mais importante ainda, a diferença de nível de proteína YAP1 entre o tumor e o epitélio normal adjacente é muito mais significativa no núcleo (p-valor = 0,0007) do que no citoplasma (p-valor = 0,027), indicando que YAP1 não só é sobre-expresso em PDA, mas também é altamente activada.

a figura 1 mostra exemplos de coloração diferencial YAP1 no PDA, tecidos normais adjacentes, e pâncreas normal. Em alguns tecidos normais do pâncreas e pancreatite observou-se moderado a forte coloração YAP1 nas células acinares e pequenas condutas (Figura 1C). No entanto, a expressão total de YAP1 no tumor é significativamente mais elevada do que nos casos pâncreas normal e pancreatite (p-valor = 0,011).

A) negativo para a coloração citoplasmática fraca no epitélio ductal normais (setas brancas) . B) coloração moderada (principalmente citoplasmático) em condutas normais adjacentes ao tumor (setas brancas). C) moderada a forte coloração em um centroacinar normal e células ductais pequenas (setas brancas); D) coloração fraca em um adenocarcinoma ductal (setas pretas); E) coloração forte em um adenocarcinoma ductal bem diferenciado (setas pretas); e F) coloração forte (principalmente nuclear) em um adenocarcinoma ductal pouco diferenciado (setas pretas).

Em seguida, correlacionaram o nível de expressão YAP1 nuclear ativado com parâmetros histopatológicos em pacientes com câncer de pâncreas. Como mostrado na Tabela 2, não existe uma associação entre a expressão nuclear YAP1 e o grau do tumor ou doença residual nos gânglios linfáticos regionais, mas existe uma correlação marginalmente significativa (r = 0,33 e p-valor = 0,068 na análise de Pearson coeficiente de correlação) entre nível YAP1 nuclear e estágio do tumor.

Nós também examinar o nível de expressão de YAP1 em um painel de oito câncer pancreático humano e duas linhas imortalizadas normais humanos pancreáticas epiteliais celulares utilizando transferência de Western (Figura 2A). Seis linhas celulares do cancro do pâncreas (BxPC-3, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, PANC-1 e) exibiram os níveis de proteína de alta YAP1 a moderada. Duas linhas de células do cancro do pâncreas (AsPC-1 e Capan-1) tinham níveis baixos a indetectáveis ​​de proteínas YAP1, respectivamente. As duas linhas de células imortalizadas pancreáticas (HPDE6 e hTERT-HPNE) tinha baixa a moderada expressão da proteína YAP1. Este perfil de expressão de YAP1 em linhas de células pancreáticas é consistente com o que foi observado nas amostras de tecido de tumor pancreático (Tabela 1).

A) análise de transferência de Western da expressão da proteína YAP1 em um painel de oito cancro do pâncreas e dois As linhas celulares imortalizadas (transformadas) não pancreáticas. B-E) coloração imuno-histoquímica para YAP1 em xenoenxertos de cancro do pâncreas: B) AsPC-1; C) BxPC-3; D) MIA PaCa-2; e E) PANC-1.

Outras investigações de expressão YAP1 em tumores de xenoenxerto formado pelas linhas de células de cancro pancreático também mostrou resultados semelhantes. A Figura 2 representa a coloração diferencial e localização de YAP1 em tumores de xenoenxerto de quatro linhas celulares de cancro pancreático utilizando imuno-histoquímica. O tumor AsPC-1 teve muito baixo de coloração e YAP1 foi limitada para o citoplasma (Figura 2B), que está de acordo com os resultados de transferência de Western (Figura 2A). BxPC-3 e MIA PaCa-2, que tinha moderado a expressão da proteína alta de YAP1 por Western blotting (Figura 2A), mostrou moderada a forte imunocoloração no citoplasma e coloração moderada (por vezes forte) nos núcleos (2C e 2D, respectivamente ). PANC-1 tinha a expressão da proteína YAP1 semelhante com intensa coloração do citoplasma com baixa a moderada coloração do núcleo (Figura 2E).

A expressão e localização de YAP1 é regulada pela densidade celular

tem sido relatado que o aumento da densidade celular pode resultar na activação de Hipo via e, subsequentemente, o sequestrante de YAP1 no citoplasma [6]. Nossa hipótese é que em células de câncer de pâncreas essa regulamentação de YAP1 localização por densidade de células é diminuída. Para explorar esta hipótese, avaliou-se o nível de expressão e localização de YAP1 em diferentes densidades de células por fraccionamento subcelular de proteínas e immunoblotting.

Como se mostra na Figura 3, a densidades celulares mais baixas (20-70%), o YAP1 proteína estava presente no citoplasma e do núcleo nas duas linhas de células de cancro do pâncreas, BxPC-3, e PANC-1, enquanto que na linha imortalizada normais ductal pancreático das células epiteliais, HPDE6, YAP1 não era detectável na fracção citosólica. Quando as células tornaram-se 100% confluentes, o nível relativo YAP1 proteína nuclear (proporção de YAP1 nuclear vs YAP1 total) aumentou em BxPC-3 e PANC-1, mas não em HPDE6 (Figura S1). Embora os aumentos de nível de proteína citosólica YAP1 como as células tornam-se confluentes em todas as três linhas de células, o aumento da HPDE6 é o mais significativo. Isto indica que permanecem relativamente mais YAP1 activada (fosforilada) nas linhas celulares de cancro do que na linha celular imortalizada HPDE6 normais quando as células se tornam confluentes. O nível de fosfo-YAP1 (p-YAP1) proteína, a qual só é detectada em todo o lisado celular e a fracção citosólica nas linhas celulares, também confirma as diferenças na localização celular YAP1 entre as linhas celulares de cancro e HPDE6. p-YAP1 não foi detectada na fracção citosólica das células confluentes HPDE6 baixo e houve um aumento dramático quando as células se tornaram confluentes 100%. Nas células cancerosas, por outro lado, P-YAP1 está presente a densidades celulares baixas e aumenta à medida que as células se tornam mais confluentes. Estes resultados indicam que a expressão YAP1 e localização não é tão fortemente regulada pela densidade celular em células cancerosas como nas células normais, o que sugere que pode ser função YAP1 desreguladas em células de cancro pancreático.

o aumento da densidade celular, o pâncreas linhas celulares de cancro, BxPC-3 e PANC-1, a resposta à desativação de YAP1 como co-fator de transcrição por sequestração citosólica é menos substancial do que HPDE6. As células foram extraídas de aumentar a densidades celulares após 48 horas de sementeira inicial. PARP serve como controlo de carga para a fracção nuclear. α-tubulina serve como controlo de carga para os lisados ​​de células inteiras e fracção citosólica.

siRNA knockdown de YAP1 reduz a proliferação celular, induz a apoptose, e diminui o crescimento independente de ancoragem em linhas celulares de cancro pancreático

Para analisar melhor o papel de YAP1 na tumorigênese, examinamos o efeito de YAP1 silenciamento por oligonucleótidos siRNA sobre a proliferação de pâncreas celular, apoptose e crescimento independente de ancoragem. células BxPC-3 e PANC-1 foram reversa-transfectadas com dois oligonucleótidos de ARNsi dirigidos a diferentes regiões da sequência de ARNm YAP1. Os siRNA de controlo negativo AllStars (Neg siARN) e AllStars Morte ARNsi de controlo (QIAGEN) foram utilizados como controlos para comparar os efeitos de transfecção siRNA sobre a proliferação de células e eficiência de transfecção.

Ao longo de um curso de tempo de 96 horas, as células tratadas com YAP1 siRNA teve redução significativa nas taxas de crescimento em comparação com as únicas células e controle negativo siRNA (Neg siRNA). Na Figura 4, o siARN Neg teve um efeito mínimo sobre a proliferação de BxPC-3 e PANC-1 em comparação com células não tratadas de controlo apenas. No entanto, ambas as sequências de siRNA YAP1 suprimiu significativamente a proliferação em ambas BxPC-3 e PANC-1. Noventa e seis horas após o tratamento com siRNA, siARN sequência YAP1_1 inibiu o crescimento de células BxPC-3 e PANC-1 em 69% e 53%, respectivamente (p 0,01) e a sequência de siRNA YAP1_2 inibiu o crescimento em 34% e 33% , respectivamente (p 0,05). sequências YAP1 siRNA não reduziu de forma significativa a proliferação na HPDE6 (Figura S2A).

O crescimento celular curvas de A) BxPC-3 e B) PANC-1 transfectadas com ARNsi de oligonucleótidos YAP1. A duas amostras independentes

t

teste (bicaudal) foi utilizado para calcular o significado estatístico no ponto de tempo de 96 horas em comparação com ARNsi Neg. * Indica P 0,05, e ** indica P 0,01. C) A caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) foi utilizado para determinar o nível de apoptose em células de cancro do pâncreas transfectadas com ARNsi de oligonucleótidos YAP1 após 72 horas. ** Denota uma de duas amostras independentes

t

teste (bicaudal) Valor de p . 0,01 quando comparado com o controle de siRNA negativo (Neg siRNA)

Para avaliar o efeito de inibição sobre a apoptose YAP1, medimos a activação de caspase-3 e caspase-7 em células de cancro do pâncreas tratadas com ARNsi. Tal como mostrado na Figura 4C, 72 horas após a transf ecção, ambas as sequências YAP1 siRNA induzida caspase 3/7 actividade em mais do que 2 vezes (p 0,05) quando comparado com o ARNsi de controlo negativo em BxPC-3, enquanto que uma sequência (YAP1_1) actividade de caspase induzida significativamente (p 0,05) em PANC-1. No entanto, nem a sequência YAP1 siARN induzida significativamente a actividade da caspase 3/7 nas células HPDE6 (Figura S2B). Esta descoberta sugere que knockdown de expressão YAP1 induz apoptose dependente da caspase nas células de câncer pancreático.

Em seguida, foram examinados os efeitos da inibição YAP1 sobre a distribuição do ciclo celular (Tabela S1). Ambas as sequências YAP1 siRNA causou um aumento considerável na população de células G0 /G1 em ambos BxPC-3 e PANC-1, em comparação com o ARNsi de controlo negativo. Em HPDE6, as duas sequências de siRNA não induziu efeitos consistentes sobre a distribuição do ciclo celular, quando comparado com o controle Neg siRNA (Tabela S1).

Uma vez que observamos um efeito significativo sobre a proliferação celular, queríamos considerar se YAP1 knockdown por siRNA iria suprimir o crescimento independente de ancoragem de células de cancro do pâncreas. células BxPC-3 e PANC-1 foram tratados com as sequências de siRNA durante 48 horas e colhidas por tripsinização. O mesmo número de células viáveis ​​para cada tratamento foi então semeada em agar mole. Após 21 dias, as colónias foram contadas de cada grupo e em seguida normalizada para o controlo somente células e representada como uma percentagem de colónias. Ambos YAP1_1 e YAP1_2 siRNAs suprimida clonogenicidade em agar mole em BxPC-3 (95%, p 0,01) e em PANC-1 (60%, p 0,05) (Figura 5A). Em contraste com a actividade inibidora semelhante no ensaio de proliferação celular (Figura 4A e 4B), a redução na formação de colónias foi muito maior em células BxPC-3 (-95%) do que em células PANC-1 (-60%). Esta diferença é consistente com o nível de ARNm YAP1 e redução da proteína pelos oligonucleótidos de ARNsi nas linhas de células (Figura 5B e 5C). Como mostrado na Figura 5C, a expressão da proteína reduzida por YAP1 siRNAs é mais dramático nas células BxPC-3 do que em células PANC-1