Sumário
Cisplatina, um agente quimioterapêutico utilizada, está associada com a ototoxicidade, toxicidade renal e neurotoxicidade, identificando, assim, meios para aumentar o índice terapêutico de cisplatina pode permitir melhores resultados. Um impulso SNP (rs4343077) dentro
EPS8
, descoberto através de um estudo de associação ampla do genoma da citotoxicidade induzida pela cisplatina e apoptose em linhas celulares linfoblastóides (LCLS), concedido para estudar ainda mais este gene. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da
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na susceptibilidade celular a cisplatina em células cancerosas e não-cancerosas. Nós usamos
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interferência de RNA para determinar o efeito de diminuição da
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expressão em LCL e sensibilidade das células do cancro do pulmão A549 à cisplatina.
EPS8
knockdown no LCLS resultou num aumento de 7,9% na sobrevivência induzida pela cisplatina (
P
= 1,98 × 10
-7) e um decréscimo de 8,7% na apoptose (
P
= 0,004) em relação ao controle. Em contrapartida, reduziu
expressão EPS8
em células de câncer de pulmão resultou em uma diminuição de 20,6% na sobrevida induzida pela cisplatina (
P
= 5,08 × 10
-5). Em seguida, investigou um
inibidor EPS8
, mitramicina A, tal como um potencial agente capaz de aumentar o índice terapêutico de cisplatina. Mitramicina A diminuição
expressão EPS8
em LCLS, resultando em diminuição da sensibilidade celular à cisplatina como evidenciado pela menor caspase 3/7 activação após o tratamento com cisplatina (42,7% ± 6,8% relativamente ao controlo
P = 0,0002
). Em 5 linhas de células não-pequenas células do carcinoma do pulmão (NSCLC), mitramicina A, também resultou numa diminuição da expressão
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. Adicionando mitramicina para 4 linhas de células NSCLC e uma linha celular de cancro da bexiga, resultou num aumento da sensibilidade ao cisplatino que foi significativamente mais pronunciado em linhas celulares de tumor do que em linhas LCL (p 0,0001). Um EGFR mutante linha de células NSCLC (H1975) não mostrou nenhuma mudança significativa na sensibilidade ao cisplatino, com a adição de tratamento mitramicina. Portanto, um inibidor de
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, tais como mitramicina A, pode melhorar o tratamento com cisplatina, aumentando a sensibilidade do tumor em relação às células normais
citação:. Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im HK, Dolan ME (2013)
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Inibição Aumenta cisplatina Sensibilidade em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10.1371 /journal.pone.0082220
Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América
Recebido: 13 de junho de 2013; Aceito: 24 de outubro de 2013; Publicação: 19 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Gorsic et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores gratos ao Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de general Medical Sciences UO1GM61393 (MED), Instituto Nacional de Saúde Clinical and Translational Ciência Award TL1 RR25001 (ALS), Instituto Nacional de Câncer Biologia Saúde Formação Grant T32CA009594 (HEW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a cisplatina é um agente de platina usados para o tratamento da cabeça e pescoço, ovário, útero, testículo, e cancros do pulmão; no entanto toxicidades graves e intrínseca /resistência adquirida interferir com a sua eficácia [1]. Compreender mecanismos genéticos e moleculares pelos quais este agente quimioterapêutico provoca efeitos secundários tóxicos, seria de grande benefício para os pacientes. Em particular, a identificação de genes cuja expressão contribui para a toxicidade permitiria o desenvolvimento de quimioterapia para contornar efeitos tóxicos.
O nosso laboratório tem desenvolvido um modelo pré-clínico farmacogênico utilizando linhas de células linfoblastóides (LCLS) para identificar variantes genéticas associadas com susceptibilidade a quimioterápicos para complementar e reforçar os estudos farmacogenómicas clínicos [2] – [5]. Importante, variantes identificadas na abordagem com base em células têm sido mostrados para ser associada a uma resposta de cancro do ovário [6], o cancro do pulmão [7], cabeça e pescoço cancro [8], e neuropatia periférica induzida por paclitaxel em pacientes com cancro da mama [ ,,,0],9], proporcionando confiança no modelo à base de células para a identificação de variantes clinicamente relevantes.
para a maioria dos estudos de LCL, de inibição do crescimento celular induzida por droga foi medido o fenótipo farmacológico, no entanto, este é um fenótipo amplo que inclui os processos celulares levando a necrose, a morte celular por meio de vias apoptóticas e não apoptóticas, a paragem do ciclo celular, e as células danificadas submetidos a reparação do ADN [10]. A apoptose, um fenótipo mais específico, pode lançar luz sobre os polimorfismos relevantes única (SNPs) associados com a resposta cisplatina em pacientes, uma vez que a cisplatina é conhecido por causar morte celular por meio de uma via apoptótica [11]. Portanto, em um estudo anterior foram tratados com cisplatina HapMap LCLS e mediu a activação de caspase 3/7, bem como a inibição do crescimento de células [12]. A GWAS revelou 2449 SNPs e 1629 SNPs sugestivamente associada a apoptose e citotoxicidade induzida pela cisplatina (
P Art 0,001), respectivamente, com 19 SNPs que se sobrepõem [12]. Um dos comum SNPs, rs4343077, em que o alelo menor tiveram menor cisplatina induziu apoptose (
P
= 0,0007) e maior survivial (
P
= 0,0007) é também uma expressão quantitativa locus da característica (eQTL) associado com os níveis de expressão de genes da linha de base de 28 genes em
P
≤10
-4 [12]. Este SNP está em um intron de crescimento epidérmico do receptor do factor pathway substrato 8 (
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).
Curiosamente,
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foi especificamente ligada à cisplatina e paclitaxel-induzida resposta à droga, onde as células cancerosas cervicais tornou-se mais sensível ao tratamento medicamentoso seguinte
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knockdown [13]. Recentemente,
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também foi encontrado para ser sobre-expresso em gliomas malignos humanos e promoveu seu crescimento celular [14]. Estudos têm relatado aumento da expressão de
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em outros tumores humanos, incluindo ovário, colo-retal, de pulmão, pituitária e câncer oral [15]. Como resultado,
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atenuação foi mostrada para afectar a migração celular e a proliferação celular em células cancerosas [15].
Devido à importância de
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em resposta aos cisplatina nas células tumorais [13] e nossa identificação de um SNP dentro
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(rs4343077) associado tanto citotoxicidade cisplatina e a apoptose [12], avaliamos ainda mais a relevância do
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na sensibilidade de cisplatina. Para este fim, utilizou-se siRNA contra o
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e uma conhecida
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inibidor, mitramicina. Downregulation utilizando ARNsi e /ou inibição de
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por mitramicina resultou numa diminuição maior inibição do crescimento celular em células do cancro do pulmão de não-EGFR mutantes e uma linha de células da bexiga seguindo tratamento com cisplatina. Nosso estudo identifica a importância de
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na citotoxicidade induzida pela cisplatina.
Materiais e Métodos
As linhas celulares
Nove LCLS (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) derivado de indivíduos do Norte e ascendência da Europa Ocidental (HapMap CEU) foram mantidas em RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 15% (Hyclone, Logan, Utah, EUA) e 20 mM L-glutamina. As linhas de células foram diluídas 3 vezes por semana a uma concentração de 350.000 células /ml. A549, NCI-H1437, NCI-H1563 e NCI-H1975 (linhas celulares de carcinoma humano do pulmão de células não-pequenas) foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10%. NCI-H2126 (linha celular de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano) foi mantida em DMEM: F12 contendo 0,005 mg /ml de insulina, 0,01 mg /ml de transferrina, 30 nM de selenito de sódio, 10 nM de hidrocortisona, 10 nM de beta-estradiol, extra 2 mM de L-glutamina e soro fetal de bovino a 5% (meio sugerido pela ATCC). HTB9 (urinária linha celular de carcinoma da bexiga de grau II) foi mantida em meio RPMI 1640 e soro fetal bovino a 10%. Todas as linhas celulares foram armazenados num incubador a 37 ° C com 5% de CO
2. As células cancerosas, médio e componentes foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, Virgínia, EUA), Cellgro (Herndon, Virgínia, EUA) ou Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA).
Drugs
cisplatina e mitramicina a foram comprados na Sigma-Aldrich Co. dimetil sulfóxido foi utilizada para diluir a cisplatina a um estoque de 20 mM, enquanto que mitramicina foi diluído para uma concentração de estoque de 0,06 uM utilizando solução salina tamponada com fosfato.
Correlação entre
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Genome-largos dados de expressão gênica foram gerados em nosso laboratório com Affymetrix GeneChip exon Humano matriz 1.0 ST array [16] e todos os dados de matriz exão bruto ter sido depositado em Gene Expression Omnibus (acesso. GSE7761).
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níveis de expressão do gene foram correlacionados com 5 � cisplatina induziu citotoxicidade e apoptose [12] no CEU LCLS (n = 77). análises de regressão linear entre o
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níveis e cada fenótipo foram realizadas utilizando GraphPad Prism 4.
RNA de interferência
experimentos Knockdown foram realizados para demonstrar os efeitos da menor
EPS8 níveis
sobre a citotoxicidade induzida por cisplatina e apoptose. Usando Linha celular Lonza 96 poços Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Basileia, Suíça), LCLS e A549 foram nucleofected 24 horas depois de serem semeadas a 5,5 x 10
5 células /ml e 4,0 x 10
5 células /ml, respectivamente. As células foram centrifugadas a 90 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e ressuspensas a uma concentração de 1 × 10
6 células /20 ul em solução SF /suplemento e 2 uM concentração final de AllStars Negativo ARNsi de controlo marcadas com AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, EUA) ou um grupo de Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) FlexiTube siRNA (Qiagen). Programa DN-100 foi usado para LCL nucleofection e CM-130 para A549. As células foram dadas 10 minutos de descanso antes da adição de meio RPMI, depois plaqueadas para a citotoxicidade ou a apoptose e incubadas durante a noite.
citotoxicidade após o tratamento com siRNA ou mitramicina
Um ensaio de inibição do crescimento celular foi alamarBlue utilizado para medir os efeitos citotóxicos da cisplatina e mitramicina [17]. Para
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experimentos de siRNA, LCLS (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 e GM12239) foram tratados com 5 � cisplatina 5 horas postar nucleofection, enquanto A549 foi tratado com 5 m de cisplatina 24 horas após nucleofection. Seguindo células de tratamento de drogas foram incubadas durante 24 horas. AlamarBlue foi então adicionado e as placas foram incubadas durante mais 24 horas antes de ser lida a comprimentos de onda de 570 e 600 nm, utilizando o Synergy HT (Biotek, Winooski, VT) e percentagem de sobrevivência foi calculada [12]. Para observar a resposta citotóxica com
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knockdown através mitramicina, as células (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, A549, H1437, H1563, H1975, H2126 e HTB9) foram semeadas e tratadas com mitramicina sozinho (0 e 0,01 ^ M), cisplatina sozinha (0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 25 e 50? M) ou a várias concentrações de cisplatina combinadas com 0,01 uM de mitramicina. tratamento mitramicina ocorreu imediatamente após o plaqueamento. As células foram então tratadas com cisplatina 6 horas após a adição mitramicina e 10% do volume total de alamarBlue bem foi adicionado 24 horas após tratamento com cisplatina. Após um período adicional de incubação de 24 horas, foram lidas as placas como indicado acima. Todas as experiências para medições percentagem de sobrevivência foram plaqueadas em triplicado, com um mínimo de duas experiências separadas.
Ensaio de Apoptose
Cisplatina e a apoptose induzida por mitramicina foram medidos utilizando Caspase-Glo 3/7 de reagente Promega Corporation (Madison, WI) como descrito anteriormente [12]. Para
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experimentos de siRNA, células plaqueadas foram tratados com cisplatina 5 � 5 horas postar nucleofection e caspase 3/7 foi medida 24 horas após o tratamento com cisplatina. Avaliar
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expressão gênica após a exposição mitramicina, as células foram semeadas e imediatamente tratada com mitramicina (0 ou 0,01 mM), em seguida, tratada com 5 � cisplatina 20 horas após a adição mitramicina. Caspase 3/7 atividade foi medida 24 horas após a cisplatina e calculado como relativamente ao controlo (sem adição de drogas). Resultados para medições de apoptose representam experiências banhados em triplicado com um mínimo de duas repetições independentes.
Quantificar knockdown de
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As células foram sedimentadas a 5, 29 e 53 horas após nucleofection com
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siRNA e subiu de controle, bem como 6 e 20 horas após o tratamento mitramicina. O ARN foi extraído utilizando o estojo RNeasy Mini Além disso e QIAcube (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. O ARNm foi então reversamente transcrito em ADNc originando concentrações finais de 25 ou 50 ng /mL usando o Reversa de Alta Capacidade kit de transcrição (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY). O cDNA foi usado para realizar qRT-PCR para confirmar o knockdown da
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[18]. Applied Biosystem TaqMan iniciador foi utilizado para quantificar a expressão de mRNA de
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(Hs00610286_m1).
efeitos mistos modelo
O efeito da
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knockdown em cisplatina inibição da apoptose e crescimento induzida foi modelado usando o seguinte modelo de efeitos mistos:
experimentar e linhas celulares eram efeitos aleatórios que permitem a experiência específica e linha de células intercepta específicos e estado knockdown foi considerado um efeito fixo. Y representa apoptose ou inibição de crescimento. Os valores de P para o efeito knockdown foram calculados utilizando o teste da razão de verossimilhança com os modelos se encaixam com o conjunto REML para falso. Qualidade do ajuste dos modelos foi avaliada examinando distribuições dos resíduos. software estatístico R (R Core Team Desenvolvimento https://www.R-project.org/) e a
lme4
pacote (versão do pacote R ,999375-42 https://CRAN.R-project.org/pacote = lme4) foram usadas para análise.
interacção de mitramicina ± cisplatina
para testar o efeito de interacção de tipo de células (de tumor contra LCL) e tratamento mitramicina na curva de resposta à dose de cisplatina que se encaixam a efeitos mistos. O modelo final foi: onde o logaritmo natural da percentagem de sobrevivência foi o resultado e tumor (status vs estatuto LCL) e tratamento mitramicina (TRT) foram efeitos com termo de interação fixa; exp indicou uma das duas repetições biológicas e foi equipado como efeito aleatório; dose de cisplatina e sua praça foram usadas para modelar a curva dose-resposta permitindo ser diferente para linhas LCL tumor e; ID de linha celular foi adicionado como um efeito aleatório para contabilizar correlação dentro da linha celular. Ao montar o modelo os resultados na concentração zero de ambos os fármacos (linhas onde a sobrevivência resultado = 1 por causa da sobrevivência maneira cento foi computado) foram excluídos. Log transformação foi utilizada para melhorar o ajuste do modelo. O coeficiente do termo de interação tumor:trt pode ser interpretado como a mudança média da curva dose-resposta, quando mithrmycin foi adicionado em linhas tumorais em relação a linhas de LCL.
Resultados
knockdown bem sucedida de
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através de RNA de interferência
Cinco LCLS CEU e a linha de células de câncer de pulmão A549 foram utilizados para estudos envolvendo
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knockdown. As células foram nucleofected ou com um controle mexidos ou siRNA de
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. Comparando com o controlo scrambled,
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knockdown foi demonstrado ser bem sucedida em todas as linhas de células 6 (Fig. 1A). Os percentuais médios de
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em todos os LCLS a 5, 29, e 53 pontos de tempo h foram de 17,2 (± 7,5), 19,0 (± 4,3) e 40,6% (± 7,3), respectivamente. A549 alcançado
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knockdown para 7,4% e 10,5% em relação ao controle mexidos com 29 e 53 horas, respectivamente.
Os valores incluem 2 experimentos independentes com qRT-PCR executados em duplicado. alterações de linha celular em percentagem de sobrevivência (
P
= 1,98 × 10
-7) e caspase 3/7 atividade (
P
= 0,004) para todos os LCLS e A549 (
P
= 5,08 × 10
-5) a 5? M cisplatina devido ao
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knockdown são apresentados com o erro padrão da média com 6 repetições de 2 experiências independentes (B).
fenotípica muda com o
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siRNA
Depois de confirmar knockdown de
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, foram avaliadas as alterações na sensibilidade à cisplatina como medido por cento sobrevivência e caspase 3/7 activação. A correlação entre o
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expressão e induzida pela cisplatina citotoxicidade indicaram níveis mais baixos de
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expressão significativamente correlacionada com a maior percentagem de sobrevivência em 5 � cisplatina (
P
= 0,047); no entanto apoptose induzida cisplatina não atingiu significância (
P
= 0,499) (Fig. S1). Usando um modelo de efeitos mistos, combinando todas as linhas celulares,
interferência EPS8
RNA mostraram um aumento da sobrevida de LCLS tratados com cisplatina por uma média de 7,9% (
P
= 1,98 × 10
– 7) e diminuiu a apoptose por uma média de 8,7% (
P
= 0,004) (Fig. 1B). Estes resultados revelam que os níveis mais baixos de
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em LCLS diminuir a sensibilidade celular à cisplatina, como evidenciado pelo aumento da sobrevivência celular e redução da atividade apoptótica quando tratados com cisplatina. Assim, diminuiu
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em LCLS confere resistência a toxicidade da cisplatina. Em contraste,
EPS8
downregulation em A549 causado maior sensibilidade ao cisplatino com uma diminuição de 20,6% em percentagem de sobrevivência (
P
= 5,08 × 10
-5) (Fig. 1B).
mitramicina reduz a expressão de
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em linhas de câncer e LCLS
Os níveis de
EPS8
expressão foram medidos 6 e 20 horas após o tratamento com mitramicina (0,01 uM). Os níveis de
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expressão diminuiu em todos os 4 LCLS testados, com uma média de 74,4% (± 3,4) em 6 horas e 29,8% (± 3,7) em 20 horas relativamente ao controlo, após a exposição mitramicina (Fig. 2A ). Mitramicina também diminuiu
EPS8
níveis de expressão em linhas celulares de NSCLC 5 e de células de cancro da bexiga linha a uma média de 95,7% (± 3,4) em 6 horas e 59,9% (± 14,7) a 20 horas de exposição, em comparação com nenhum controle de tratamento da toxicodependência (Fig. 2B). Estas medidas confirmam que o tratamento de mitramicina (0,01 uM) resulta em menor expressão de
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em células do pulmão e da bexiga cancerosas, bem como em LCLS não cancerosas.
os valores percentuais apresentados incluem duas experiências independentes com qRT-PCR realizados em duplicado para cada experimento com o erro padrão da média.
mitramicina diminui a sensibilidade da LCLS à cisplatina
em seguida, determinou o efeito da mitramicina na sensibilidade do LCLS para a caspase 3/7 activação induzida por cisplatina. Os níveis médios de apoptose em todo o 4 LCLS seguinte cisplatina isolada foi de 5,94 (± 0,9) em relação ao controlo, em comparação com cisplatina e mitramicina que diminuiu a média da caspase 3/7 níveis de 3,38 (± 0,5) (Fig. 3). Caspase 3/7 actividade após mitramicina sozinho (0,01 uM) resultou numa média de 3,41 (± 0,4) entre os 4 LCLS. Embora mitramicina e cisplatina induzir apoptose separadamente, houve uma redução média de 42,7% (± 6,8
P
= 0,0002) em caspase 3/7 activação por combinação com cisplatina mitramicina em comparação com cisplatina isoladamente, sugerindo um efeito protector de mitramicina em termos de apoptose. células do pulmão e cancro da bexiga também foram testadas para a apoptose com cisplatina (5 ^ M) na presença e ausência de mitramicina; no entanto caspase 3/7 níveis de ativação para essas células não foram acima da linha de base.
Cada LCL experimentou menor atividade apoptótica induzida pela cisplatina com o mitramicina relativa adicionado a um controle sem tratamento medicamentoso. Mitramicina tratada 10859, 11830, 11840, e 12156 resultou numa 47,1, 40,8, 48,9, e 34,0% de diminuição da cisplatina isoladamente, respectivamente. Os dados representam duas experiências separadas, cada uma realizada em triplicado, com um erro padrão da média.
Mitramicina aumenta a sensibilidade de células tumorais à cisplatina
Além de testar os níveis de apoptose com cisplatina e mitramicina em LCLS e células do cancro, nós também mediram a inibição do crescimento celular. Cinco linhas de células NSCLC com diversos estados de mutação foram escolhidos para o estudo; o efeito de mitramicina sozinho varia para estas linhas de células de cancro que vão desde 59,7 a inibição do crescimento celular 92,9% (Tabela 1). Sensibilidade à cisplatina foi encontrado para aumentar o tratamento com 4 mitramicina em células NSCLC molecularmente distintos (Fig. 4). H1975 com uma mutação EGFR, não experimentaram nenhuma mudança significativa. Uma vez que a cisplatina também é utilizado para o tratamento de cancro da bexiga, que também escolheu para medir os efeitos de cisplatina e mitramicina em uma linha de tumor da bexiga para ver se o efeito emularia resultados NSCLC; observou-se a sobrevivência de 59,6% com o tratamento mitramicina sozinho (Fig. 4).
A forma quadrada representa concentrações de cisplatina isoladamente, enquanto que o triângulo representa a cisplatina com a adição de mitramicina (0,01 uM). Curvas representam duas experiências independentes realizadas em triplicado com o erro padrão da média.
No entanto, ao examinar o efeito de mitramicina na sensibilidade do LCLS a cisplatina, não observamos o mesmo grau de inibição do crescimento celular aumentada. Mitramicina sozinho por 4 LCLS causou uma inibição média de crescimento de células de 63,1% (± 12,8) em 0.01? M (Fig. S2). A curva de resposta à dose para LCLS foi deslocada para baixo, em média, cerca de 17% quando foi adicionado mitramicina. Para as linhas de tumor da curva de resposta à dose deslocadas para baixo cerca de 26% em média. O p-valor do termo de interação era
P Art 0,0001. Este, juntamente com os resultados de apoptose, apoia a noção de que a redução da expressão de
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via mitramicina não é igualmente prejudicial para a sobrevivência LCL como é para linhas de células cancerígenas. Mitramicina provoca uma maior sensibilidade em células NSCLC sem mutação EGFR e possivelmente outros tipos de tecido de câncer, como visto pelos nossos resultados em linha de células de tumor de bexiga, HTB9.
Discussão
Neste estudo, foi avaliada
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como um alvo potencial para a terapia de combinação com cisplatina.
EPS8
foi escolhido com base em resultados pré-clínicos GWAS anteriores usando vários fenótipos celulares: a citotoxicidade induzida por cisplatina e a apoptose induzida por cisplatina, como medido por caspase 3/7 activação. O SNP (intrónica
EPS8
), rs4343077, foi associado com a citotoxicidade e apoptose induzida por cisplatina, bem como a expressão da linha de base de 28 genes alvo. Após a knockdown de
expressão EPS8
em 5 LCLS, observou-se uma diminuição significativa na sensibilidade celular à cisplatina, como medido por inibição do crescimento celular e caspase 3/7 activação (
P
= 1,98 × 10
-7 e
P
= 0,004, respectivamente) através LCLS. evidências da literatura sugeriu
EPS8
knockdown em linhas de células tumorais aumento da sensibilidade celular à cisplatina [13], [15]. Nossos resultados estão de acordo com estes resultados, mostrando que
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downregulation sensibiliza as células de câncer de pulmão A549 para o tratamento com cisplatina. Nós alargado nossos estudos para outras linhas molecularmente definidos pulmão de células e uma linha de células de bexiga bem como LCLS.
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knockdown no LCLS seguintes mitramicina tratamento resultou numa diminuição da actividade apoptótica quando mitramicina foi combinado com cisplatina em comparação com a cisplatina isoladamente. Embora as medições de citotoxicidade celular indicou um pequeno aumento na sensibilidade de LCLS a cisplatina, após a exposição mitramicina, a sensibilidade de linhas de células cancerosas foi significativamente maior com adição mitramicina comparação com LCLS. A exceção foi a linha de células H1975 NSCLC com uma mutação EGFR. Isto implica knockdown de
EPS8
, quer através de siRNA ou a utilização de um inibidor tal como mitramicina pode ser uma estratégia para aumentar a sensibilidade do tumor para a cisplatina.
EPS8 é uma oncoproteína contribuir para a transformação maligna de células tumorais [12], [19]. Ele é um substrato do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e participa na EGFR sinalização através Rac, e tráfico através Rab5 [20]. Sua relação tri-complexo com
SOS1
e
ABI1
foi encontrado para ser um componente essencial para a migração lisofosfat�ico estimulado por ácido celular e ativação Rac, que foi encontrado para jogar um papel importante na metástase do cancro do ovário [21]. Níveis de
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também foram implementadas como uma ferramenta de prognóstico para pacientes em estágios iniciais de câncer cervical [13]. Os pacientes que têm maior expressão de
EPS8
tendem a experimentar invasão parametrial, metástases linfonodais e uma diminuição na taxa de sobrevivência.
Inicialmente, Yang et al. (2010), investigou mitramicina, um antibiótico a partir das
Streptomyces
espécie, como um potencial inibidor da
EPS8
. Eles determinaram que mitramicina reduz os níveis de mRNA e proteína de
EPS8
em uma linha celular de adenocarcinoma colorrectal humano epitelial e uma linha de células epiteliais de carcinoma de pulmão humano. Além disso,
EPS8
downregulation, através de um tratamento mitramicina, provoca uma diminuição significativa no crescimento de células cancerígenas e capacidade de migração [22].
Mitramicina tem sido uma droga anticâncer clínico aprovado desde 1970 [23] e utilizados nos Estados Unidos para o tratamento clínico da doença de Paget, carcinoma testicular, e hipercalcemia de pacientes que sofrem de lesões ósseas associadas com malignidades [24] – [28]. No entanto, seu uso em tratamento de terapia tem diminuído ao longo dos anos devido aos seus efeitos adversos e índice terapêutico estreito [29]. Os doentes tratados com mitramicina, para essas doenças, têm sido vistos a experiência gastrointestinal, hepática, toxicidade da medula renal e ósseo, resultando em náuseas, vômitos e sangramento [30]. Apesar dos seus efeitos secundários graves, tem havido um interesse renovado na mitramicina agora que a compreensão das suas interacções ao nível molecular está a evoluir [29].
Mitramicina foi encontrado para interagir com regiões de ADN rico em GC situados em o sulco menor do ADN [29], [31] – [33], que é actualmente pensado para prevenir a especificidade da proteína factor de transcrição 1 (SP1) de se ligar a uma variedade de promotores de proto-oncogenes. No entanto, o SP1 sítios de ligação que não estão relacionados a um subconjunto de proto-oncogenes parecem permanecer inalteradas, como promotor de p21
cip1 /WAF1 [29]. Portanto, mitramicina pode não ser específico para a inibição SP1 e poderia potencialmente atingir um oncogene montante de interação SP1. Tem sido descoberto anteriormente que mitramicina também diminui a expressão de
c-myc
,
c-myb
,
c-src
,
c-met
, e FOXM1 [22], [34]; No entanto, aumenta os níveis de mitramicina FOXO3a [34], um factor de transcrição que regula a resposta a danos no ADN. Pode haver uma possibilidade de que estes genes estão interligados em uma via de jusante do alvo de mitramicina.
Por exemplo,
EPS8
também tem sido demonstrado que regulam positivamente FOXM1 [35], um factor importante para o desenvolvimento e progressão de certos tipos de cancro [36], que se sabe se se ligam directamente com Sp1 [37], [38]. Sp1 e FOXM1 foram mostrados para transactivar promotores de
c-myc
sinergicamente [38]. Além disso,
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atenuação foi encontrada para diminuir os níveis de
Src
,
Shc
e
FAK
(também conhecido como
pTK2
), uma tirosina cinase intracelular que participam na adesão celular e motilidade [39]. FOXO3a pode também ser regulada pela presença ou ausência de
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através de várias vias, quer através da via PI3K /Akt /mTOR sinalização [40] ou através da via de Ras-Raf-MEK-ERK [41]. Shiota et al. (2010) investigaram a resistência a cisplatina e determinou que as células resistentes a cisplatina se tornaram sensibilizadas para tratamento através da indução de FOXO3a por mitramicina [34]. Um decréscimo na sinalização AKT FOXO3a activa e induz a apoptose [36]; portanto, é possível que uma redução no
níveis EPS8
diminui AKT, provocando fosforilação de FOXO3a e as células cancerígenas a apoptose em vez de proliferação contínua.
Tomar um olhar coletivo na literatura e nossa resulta que parece interessante que a linha de células de câncer de pulmão que não experimentar aumento da morte celular com mitramicina (H1975) tem uma mutação EGFR. Pulmão linha de células tumorais H1975 tem uma mutação pontual na ansa de activação, causando uma mudança de leucina para arginina (L858R) no exão 21, bem como um ponto de mutação secundária, T790M, alterar a actividade de EGFR normais [42]. inibidores de EGFR de tirosina são tipicamente usados para sensibilizar os EGFR mutantes tipos de tumor a agentes de platina, no entanto tumores EGFR de tipo selvagem raramente resposta a estes inibidores [43]. Potencialmente, a adição de um regime mitramicina pode ser benéfica para pacientes com EGFR de tipo selvagem para sensibilizadas para tratamento de platina através da inibição de alvos
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jusante e que desempenham um papel importante na proliferação de células de tumor, a adesão e a motilidade . Uma dose mitramicina grande o suficiente para inibir determinados oncogenes, ainda baixo o suficiente para não causar efeitos adversos adicionais, permitiria que o agente quimioterapêutico para causar mais eficazmente a morte celular das células tumorais.
Em conclusão, nossos resultados validam
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envolvimento na resposta das células para o tratamento com cisplatina. Embora nós testamos mitramicina, não podem ser inibidores mais específicos de
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que resultam em um maior diferencial entre células cancerosas e células normais. a capacidade da mitramicina para diminuir os níveis de
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causadas menos atividade apoptótica em LCLS do que com o tratamento com cisplatina sozinha. Reduzida expressão de
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através de tratamento com mitramicina é menos nocivo para as células normais (como medido em LCLS) em comparação com as células cancerosas. Coletivamente, os nossos dados fornece mais uma confirmação do papel e da importância do
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na toxicidade induzida pela cisplatina e como um alvo promissor para melhorar a terapia com cisplatina.
Informações de Apoio
Figura S1.
Correlação entre
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níveis de expressão e log transformado sobrevivência CEU LCL por cento (
P
= 0,047, r
2 = 0,05, superior) e caspase 3/7 atividade (
P
= 0,499, r
2 = 0,006, inferior)
doi: 10.1371 /journal.pone.0082220.s001
(TIFF)
Figura S2.
LCLS são mostrados em várias concentrações de cisplatina com a presença e a ausência de mitramicina. A forma quadrada representa concentrações de cisplatina isoladamente, enquanto que o triângulo representa a cisplatina com a adição de mitramicina (0,01 uM). Curvas representam dois experimentos independentes feitos em triplicado com o erro padrão da média
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0082220.s002
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Agradecimentos
Os autores gratos aos Farmacogenómica de Anticancer Agents celular Linha Núcleo da Universidade de Chicago para obter ajuda na ordenação e que recebem estas linhas celulares.