Abstract

Fundo

S-propargil-cisteína (SPRC), um H

2S doador, é um análogo estrutural de S-allycysteine ​​(SAC). Ele foi investigada por seu potencial efeito anti-câncer em células de câncer gástrico SGC-7901 e os possíveis mecanismos que podem estar envolvidos.

métodos e resultados

tratamento SPRC diminuiu significativamente a viabilidade celular, suprimiu a a proliferação e migração de células de cancro gástrico SPRC-7901, foi pró-apoptótica, assim como causada paragem do ciclo celular na fase G

1 /S. Num

In vivo

estudo, a injecção intra-peritoneal de 50 mg /kg e 100 mg /kg de SPRC reduziu significativamente os pesos dos tumores e os volumes dos tumores de implantes de cancro gástrico em ratinhos nus, com uma taxa de inibição do crescimento do tumor de 40-75%. SPRC também induziu um efeito pró-apoptótico em tecidos de cancro e elevou as expressões de p53 e Bax em tumores e células. tratamento SPRC também aumentou a expressão da proteína de cistationa-γ-liase (CSE) em células e tumores, e elevou H

2S níveis no meio de cultura celular, no plasma e actividade CSE tumoral de ratos sem pêlo induzida por cancro gástrico por 2, 2,3 e 1,4 vezes, respectivamente. A maioria das funções anti-câncer de SPRC em células e tumores foram significativamente suprimida pelo PAG, um inibidor da actividade CSE.

Conclusões

Em conjunto, os resultados do nosso estudo fornecem insights em uma efeito anti-câncer novela de H

2S, bem como de SPRC em câncer gástrico através de induzir a atividade de um novo alvo, CSE

Citation:. MA K, Liu Y, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H

2S Doador, S-propargil-cisteína, Aumenta CSE no SGC-7901 e Ratos Cancer-Induzidos: Evidência para a Novel Anti-Cancer Efeito da endógena H

2S? PLoS ONE 6 (6): e20525. doi: 10.1371 /journal.pone.0020525

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril de 2011; Aceito: 02 de maio de 2011; Publicado: 27 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 MA et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nós reconhecemos a assistência financeira prestada por uma bolsa da National Distinguished Jovens cientistas Grant 385 (No. 30.888.002) na China, o Projeto Nacional 973 (2007CB512006 e 2010CB912600) e Xangai-Unilever Research Fundo para o Desenvolvimento (08540750400).

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

S-propargil-cisteína (SPRC) é um análogo estrutural da S-allycysteine ​​(SAC ), com a mesma estrutura contendo cisteína. SAC, um dos principais compostos no extracto de alho envelhecido, é derivado da degradação de

S

-alc (en) il sulfóxidos de cisteína (ACS). Este composto tem propriedades anti-tumor [1], [2], anti-bacteriana [3], anti-fúngicos [4], anti-hepatotóxica [5], as propriedades cardioprotectoras [6] e a apoptose [7]. O paclitaxel lipossoma, uma formulação à base de lípidos da droga anticancro, paclitaxel, tornou-se um fármaco de primeira linha para o tratamento de ovário refractário, mama, estômago e cancros do pulmão de células não-pequenas. Por isso, investigou o

in vitro

e

in vivo

efeitos anticancerígenos de SPRC e comparou-os com os da SAC e Paclitaxel lipossoma.

cystathione-γ-liase (CSE) é um membro da família de enzimas de trans-sulfuration e é responsável por catalisar a β-dissulfureto reacção de eliminação dependente de fosfato de piridoxal, resultando em amónio, piruvato e thiocysteine. Thiocysteine ​​pode então reagir com outros tióis para gerar H

2S. A proteína supressora de tumor p53 desempenha um papel importante na resposta celular a danos no ADN e outras aberrações genómicos. A activação de p53 podem conduzir quer à paragem do ciclo celular e a reparação do ADN ou a apoptose. Bax é um componente-chave na apoptose celular por stress mitocondrial, enquanto a Bcl-2 exerce uma função de sobrevivência em resposta a uma vasta gama de estímulos apoptóticos através de inibição da libertação de citocromo c mitocondrial. Aqui, pela primeira vez, descobrimos que os efeitos anticancerígenos da SPRC envolveu um sulfeto de hidrogênio (H

2S) via mediada. SPRC pode sofrer β-eliminação pela CSE para produzir endógena H

2S, que podem sobre-regular a expressão do gene de p53 e Bax, resultando na supressão da proliferação celular e da apoptose. Nosso estudo mostrou, assim, um efeito anti-câncer novela do endógena H

2S doador, SPRC, em câncer gástrico através de induzir a atividade de um novo alvo, CSE. Nós demonstramos pela primeira vez que SPRC foi capaz de suprimir a proliferação e migração celular e também o crescimento do tumor no modelo induzido por cancro gástrico de ratinhos nus, indicando que pode ser um potencial agente para o tratamento do cancro gástrico em humanos. Os nossos resultados mostraram que os efeitos anti-cancro de SPRC foram atribuídos à supressão do ciclo celular e a indução de apoptose. Além disso, nossos resultados também mostraram que SPRC poderia regular a expressão de genes de CSE, Bax e p53. Descobrimos que PAG, um inibidor da actividade CSE, poderia suprimir significativamente os efeitos anticancerígenos da SPRC.

Resultados

Dose-dependente, inibidora do crescimento e detecção dos efeitos citostáticos de SPRC sobre SGC- 7901 células

Efeitos do SPRC em células cancerosas gástricas SGC-7901 foram apresentados na Figura 1A, 1 uM e 10 uM SPRC produzida% de inibição da viabilidade das células SGC-7901 18-25. 20 mM a 30 mM SPRC causou a inibição a viabilidade celular de cerca de 50%. Nós também descobrimos que SPRC em baixas concentrações de 1 uM e 10 uM poderia suprimir significativamente a formação de colónias e capacidade de migração de SGC-7901; estes efeitos foram mais significativas em comparação com SAC (Figuras 1B, 1C e 1D). Pag, um inibidor de ECA, bloqueou o efeito inibitório do SPCR no crescimento celular (Figuras 1B e 1C). Estes resultados indicaram que a via de CSE estava envolvida na supressão induzida SPRC do crescimento celular.

. estudo de dose-resposta dos efeitos do SPRC sobre a inibição do crescimento de células SGC-7901. B. Efeitos do SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC e lipossomas paclitaxel na viabilidade das células SGC-7901. C. Efeitos da SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC e lipossomas paclitaxel na formação de colónias em células SGC-7901. D. Efeitos da SPRC, SAC e lipossomas paclitaxel sobre a capacidade de migração de células SGC-7901. capacidade de migração de células diferenciais foi analisada pelo ensaio de cicatrização de fecho. E. Efeitos do SPRC, SAC e lipossomas paclitaxel na velocidade fechamento da ferida. Os valores são expressos como% do controlo. * Representam diferença significativa entre o controle vs. SPRC, SAC e grupos de lipossomas de paclitaxel (p 0,01).

# representam diferença significativa (p 0,01) entre SPRC vs grupo SPRC + PAG (p 0,01).

As alterações morfológicas, apoptose e ciclo celular análise

A apoptose [ ,,,0],21] é a morte celular programada, que é caracterizada por modificações estruturais específicas que incluem encolhimento celular, condensação nuclear e fragmentação do ADN. Hoechst coloração foi usado para observar as alterações morfológicas de células tratadas com paclitaxel lipossomas, SPRC e SAC. Como mostrado na Figura 2A, microscopia electrónica revelou que as alterações morfológicas características da apoptose em células ocorreu SGC-7901 após o tratamento com SPRC ed durante 24 horas. As células exibiram um padrão de coloração densa com fragmentação do ADN e na ausência de membranas nucleares distintos. As células de controlo não exibiram alterações morfológicas semelhantes. A apoptose de indução de efeitos de SPRC foram avaliadas por citometria de fluxo (Figura 2B); 24 horas de tratamento das células SGC-7901 com 10 uM SPRC resultou num aumento significativo de cerca de 26% dos corpos apoptóticos, quando comparado com o grupo de controlo. Em comparação, a percentagem de células apoptóticas em paclitaxel lipossomal e os grupos tratados com SAC eram menos por cerca de 8% e 4%, respectivamente.

. tratamento com SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC e lipossomas paclitaxel (10 uM) em 24 h para a determinação das mudanças apoptóticos analisadas sob um microscópio de fluorescência. B. Análise de células apoptóticas por análise de citometria de fluxo. C. Distribuição do ciclo celular. Marcadores em imagens indicam: 1, de controle. 2, SPRC 10 uM. 3. SAC 10 uM. 4. PAG 10 UM. 5. SPRC + PAG, cada 10 uM. 6. O paclitaxel lipossoma 10 uM.

O efeito de SPRC na actividade do ciclo celular de células SGC-7901 foi analisada por coloração com iodeto de propídio realizando seguido por detecção com citometria de fluxo. Consistente com o seu efeito sobre a inibição do crescimento celular, SPRC induzido a paragem do ciclo celular em células SGC-7901 em L de fase

1 /S (Figura 2C). 10 uM SPRC também resultou num aumento da acumulação de 24% das células na L

1 fase e reduzida de 20% de células na fase S do ciclo celular, em comparação com o grupo de controlo. Isto sugere que existe uma obstrução na L

uma transição de fase /S, o que pode provocar a supressão do crescimento celular ou apoptose. O efeito pró-apoptótica de SPRC, bem como o seu efeito de paragem do ciclo celular em G

1 fase /S foi largamente inibida por PAG.

Efeitos do SPRC sobre a expressão da proteína CSE e actividade e H

níveis 2S

As expressões da proteína em células CSE SGC-7901 (Figuras 3A, B e C) e os tumores em ratinhos nus (figura 3 D, e e F) foram significativamente aumentada por tratamento SPRC. SPRC em doses de 50 mg /kg e 100 mg /kg, aumentou significativamente a actividade CSE em cerca de 1,4 vezes (Figura 3G). actividade CSE em tumores de ratinhos nus tratados SPRC foi maior do que em tecidos do grupo tratado com SAC. H

2S níveis em meios de cultura celular (Figura 3H), plasma de ratinhos nus (Figura 3I) foram medidos. O H

ratinhos nus nível 2S no meio de cultura de células de 10 células tratadas com SPRC UM eo H plasma

2S de 50 mg /kg e 100 mg /kg SPRC-tratados foram também significativamente aumentada em comparação com o grupo controle (P 0,05). Quando comparado com o grupo tratado com SAC de ratinhos, o grupo tratado com SPRC tinham significativamente mais elevado H

2S nível (P 0,05). Os níveis elevados de expressão da proteína de CSE, actividade CSE e H

2S no grupo tratado com SPRC foram todos largamente reduzido por tratamento Pag. Os resultados destas experiências sugeriram assim que o efeito anticancerígeno de SPRC foi mediada pela activação do CSE /H

2S via

para a, pista 1, o grupo de controlo.; Pista 2, 10 uM de lipossomas de paclitaxel; Pista 3, SPRC 1 uM; Pista 4, SPRC 10 uM; Pista 5, SAC 10 uM; Pista 6, o grupo de controle; Pista 7, SPRC 10 uM; Pista 8, PAG 10 uM; Pista 9, PAG + SPRC 10 uM. Para D: Faixa 1, controlo; Pista 2, lipossomas de paclitaxel 10 mg /kg; Pista 3, SPRC 50 mg /kg; Pista 4, SPRC 100 mg /kg; Pista 5, SAC 100 mg /kg; Pista 6, controlo; Pista 7, SPRC 100 mg /kg; Pista 8, PAG 100 mg /kg; Pista 9, PAG SPRC + 100 mg /kg. Intensidade relativa é calculada por comparação com a intensidade de GAPDH utilizando densitometria (mostrado nos gráficos do lado direito). * Representam diferença significativa entre o controle vs. SPRC, SAC e lipossomas paclitaxel grupos tratados (p 0,05).

# representa diferença significativa entre SPRC 10 uM vs. grupo SPRC + PAG. Figura G mostra a atividade CSE (mmol /g) no câncer gástrico de todos os grupos. Figura H mostra H

níveis 2S (�) em meio de cultura celular. Figura I apresentam níveis de plasma H

2S em tumores gástricos de ratos sem pêlo de diferentes grupos.

Efeitos do SPRC e SAC nas expressões gênicas de Bax, p53 e Bcl-2

O efeito de crescimento de supressão do SPRC em células SGC-7901 foi avaliada para analisar os efeitos sobre a atividade do ciclo celular e expressões dos genes reguladores de apoptose – Bax, p53 e Bcl-2. Como mostrado na Figura 4A e 4B, descobrimos que o tratamento de 24 horas SPRC aumentou significativamente o nível de ARNm (cerca de 1,5 vezes) e o nível de proteína de p53 e Bax de células SGC-7901.

. Pista 1, lipossomas de paclitaxel de 10 pM; Pista 2, controlo; Pista 3, SPRC 10 uM; Pista 4, SPRC 1 uM; Pista 5, SAC 10 uM; Pista 6, SAC 1 uM. Intensidade relativa é calculada por comparação com a intensidade de β-actina utilizando densitometria (mostrado nos gráficos do lado direito). B. Quantificação de Bax, p53 e BCL-2 de expressão do mRNA. * Representam significado significativa entre o controle vs SPRC, SAC e lipossomas paclitaxel em p 0,05

supressão do crescimento [22] e indução de apoptose celular em tumores por SPRC

O desenvolvimento. do cancro gástrico avaliada por volume do tumor foi significativamente reduzida por tratamento SPRC de 50 mg /kg e 100 mg /kg de peso corporal a cada dois dias, três vezes por semana com um RI de 40-75% (Figura 5A e 5B). O peso do tumor também foi significativamente reduzida nos grupos tratados com SPRC (Figuras 5c) enquanto o tratamento PAG diminuiu significativamente a função de supressão de crescimento de SPRC. Os tumores representativos em diferentes grupos apresentaram alteração de tamanho do tumor evidente (figuras 5D e 5E).

A. Mudança no volume médio do tumor (mm

3). B. A taxa de inibição (IV) sobre o crescimento do tumor em dias diferentes. C. Mudança no peso do tumor. D. Mudança no tamanho do tumor. E.

In vivo

tumor de imagem de ratinhos nus após o tratamento por 24 dias. * Representam diferença significativa (p 0,05) entre o controle vs. SPRC, SAC e lipossomas paclitaxel grupos tratados.

#represents diferença significativa (p 0,05) entre SPRC 100 mg /kg vs. SPRC + PAG e PAG grupos tratados. F. H.E. coloração com amplificação de 4 × 10 e maiores imagens amplificado (100 × 10) no canto direito. coloração G. Tunnel (100 × 10) de corpos apoptóticos de tumores gástricos. marcadores números em imagens indicam: 1, grupo controle; 2, o paclitaxel lipossoma 10 mg grupo /kg; 3, SPRC 50 mg /kg de grupo; 4, SPRC 100 mg /kg grupo; 5, SAC 100 mg /kg grupo.

Nós também examinou se a inibição do crescimento do tumor por SPRC se refletiu na apoptose das células tumorais. H E revelou coloração (Figura 5F) de células de tumor mais apoptótica em lipossomas de paclitaxel e os grupos tratados com SPRC. TUNEL coloração revelou que os tumores de ratos tratados com SPRC tinha uma contagem significativamente mais elevado de corpos apoptóticos comparados com os tumores de controlo (Figura 5G). O aumento da incidência de apoptose em tumores estava em conformidade com o efeito de inibição do crescimento do tumor por SPRC, sugerindo que SPRC exercida inibição do crescimento do tumor, em parte, por o aumento de apoptose em tumores.

Efeitos de SPRC e do saco no expressões de proteínas e mRNA [23] de Bax, p53 e Bcl-2

O efeito de supressão das SPRC sobre o câncer gástrico foi ainda avaliado por Bax, p53 e Bcl-2. Este efeito de SPRC também foi confirmada em ratinhos nus induzida por cancro gástrico, como mostrado nas Figuras 6A e 6B. A proteína e os níveis de ARNm de Bax e p53 em tumores tratados com SPRC foram significativamente aumentados, enquanto aqueles de Bcl-2 foram reduzidos, em comparação com tumores de controlo. A localização e quantidade destas três proteínas em tecidos de tumor, também foram identificados por imunocoloração. Como se mostra nas Figuras 6C e 6D, não óbvio imunocoloração das proteínas pró-apoptóticas, Bax e p53, foi observado no grupo de controlo, enquanto foi observado um sinal forte de imunorreactividade em grupos tratados com lipossomas SPRC- e paclitaxel. Uma coloração muito fracamente positivos para a proteína anti-apoptótica, Bcl-2, foi detectada em SPRC-, paclitaxel liposome- e grupos tratados com SAC na Figura 6E. Estes resultados demonstraram que SPRC é capaz de regular a expressão de genes de Bax, p53 e Bcl-2 em direcção a apoptose celular.

A. a expressão da proteína, Pista 1 controle; Pista 2 lipossoma paclitaxel 10 mg /kg; Pista 3 SPRC 50 mg /kg; Pista 4, SPRC 100 mg /kg; Pista 5, SAC 100 mg /kg. Intensidade relativa foi calculada por comparação com a intensidade de β-actina utilizando densitometria. B. ARNm de expressão. * Representam significado estatístico entre o controle vs SPRC, SAC e liposome- paclitaxel grupos tratados (p 0,05). coloração C. imuno-histoquímica de proteína pró-apoptótica, Bax. D. coloração imuno-histoquímica de proteína pro-apoptótica, p53. a coloração imuno-histoquímica de E. proteína pro-apoptótica, Bcl-2. marcadores numéricas no fotos na Figura 6 C, D e E indicam: 1, grupo controle; 2, o paclitaxel lipossoma 10 mg /kg; 3, SPRC 50 mg /kg; 4, SPRC 100 mg /kg; 5, SAC 100 mg /kg.

H

2S demonstrado pró-apoptose e anti-efeito de proliferação em células SGC-7901 e modelo de câncer gástrico de ratos nu

descobriu que SPRC aumento da atividade CSE e que se traduz num elevado H

2S níveis, que por sua vez modula a expressão dos genes de Bax, p53 e Bcl-2. Bax é induzida directamente apoptose orientado a mitocôndria através do aumento da expressão Mt e diminuição da Bcl-2 expressão. A proteína supressora de tumor p53 desempenha um papel importante na resposta celular a danos no ADN e outras aberrações genómicos. A activação de p53 conduz ou a inibição da proliferação celular e danos no DNA ou apoptose através da proteína Bax na Figura 7. Estes resultados sugerem um novo mecanismo para os efeitos anticancerígenos de SPRC através CSE /H

2S-induzida a inibição do crescimento celular e apoptose através o p53 /via Bax.

os aumentar os níveis de H2S viraram modula Bax, p53 e da proteína Bcl-2 e expressão de mRNA. Bax induziu apoptose através Mt e expressão Bcl-2. p53 leva a qualquer inibição da proliferação celular e danos ao DNA ou apoptose através da proteína Bax.

Discussão

Neste estudo, nós demonstramos um efeito anticancerígeno novela do SPRC sobre o câncer gástrico e também forneceu dados para sugerir seu mecanismo possível. Vários novos pontos são gerados a partir de nosso estudo. Em primeiro lugar, foi demonstrado que SPRC foi capaz de reduzir a capacidade de crescimento das células de forma significativa e também suprimir a migração de células SGC-7901. Em segundo lugar, verificou-se que SPRC foi capaz de aumentar a alterações morfológicas relacionada com apoptose induzida e um grande aumento na percentagem de células apoptóticas em simultâneo com uma paragem do ciclo celular óbvio em G

fase 1 /S. Tomados em conjunto, estes dois resultados suportam a evidência para um efeito inibitório do SPRC em células SGC-7901. Em terceiro lugar, podemos ainda demonstrado que a administração intra-peritoneal de SPRC em doses de 50 e 100 mg /kg de peso corporal a cada dois dias, três vezes por semana foi eficaz na inibição do crescimento de tumores em ratinhos nus gástricas. Em quarto lugar, verificou-se que pode aumentar a actividade SPRC CSE e também a sua expressão de proteína resultando em elevados H

2S níveis em meios de cultura de células e no plasma de ratinhos nus. Em quinto lugar, descobrimos que PAG, um inibidor da ECA, poderia, em grande parte suprimir as funções acima de SPRC. Em sexto lugar, verificou-se que o tratamento SPRC causada óbvio elevação de ARNm e da proteína de Bax e p53.

tem sido relatado que H

2S [24], [25], [26] pode ser gerado em células de cancro gástrico pela enzima 5-fosfato de piridoxal-dependente de CSE, nas quais a L-cisteína é o substrato. CSE [27] pode catalisar piridoxal-fosfato dependente β-dissulfureto e uma reacção de eliminação, resultando na formação de amónio, piruvato e thiocysteine. Thiocysteine ​​seguida, reage com outros tióis para formar H

2S. PAG tem sido utilizado em vários estudos para testar o efeito biológico da inibição endógena H

2S produção [28] SPRC, um análogo do SAC tem a estrutura contendo cisteína que podem ser submetidos a β-eliminação e servir como um substrato de CSE. O grupo propargil-chave na SPRC pode combinar-se com os locais de CSE atividade para aumentar a atividade CSE. No nosso estudo, o aumento na expressão da proteína óbvio CSE em células gástricas cancerosas e tumores de ratinhos nus foi observado no grupo tratado com SPRC; isso poderia ser explicado como um “efeito compensatório” para produzir H

2S para lidar com a apoptose das células cancerosas. fibroblastos de pulmão humano tratado pela H

2S doador, NaHS, apresentado um aumento de danos no ADN, interrupção do ciclo celular e estabilização de p53, juntamente com a indução de proteínas a jusante, tais como p21, Bax e citocromo c [29]. Tem sido relatado que o tratamento de células acinares pancreáticas por H

2S tem sido demonstrado que induzem a apoptose, resultando da activação de caspase 3, diminuição do nível de proteína de Bcl-2 e activação da expressão do Bax. H

2S também pode induzir a apoptose das células beta secretoras de insulina, aumentando ER stress através da activação da MAPK p38 [30]. Relatou-se que a p53 induz a apoptose, quer por aumento da actividade de transcrição de genes pró-apoptóticos tais como Bax ou suprimir a actividade do gene anti-apoptótica de Bcl-2 família [31], [32]. Bax também é conhecido por induzir a apoptose impulsionado-mitocôndria. Aqui encontramos também que a ativação do CSE e aumento H

níveis 2S por tratamento SPRC foram acoplados com p53 elevada e expressões Bax em células gástricas e tumores. Estes resultados sugerem um novo mecanismo para os efeitos anticancerígenos da SPRC via CSE /H

2S-induzida inibição do crescimento celular e apoptose pelo p53 /Bax via.

Em conclusão, nosso

in vitro

e

in vivo

resultados experimentais demonstraram que o doador sulfeto de hidrogênio, SPRC, teve efeitos inibitórios e pró-apoptóticos óbvias sobre o câncer gástrico. SPRC poderia aumentar a atividade CSE, resultando em um aumento do nível de H

2S, que por sua vez modula a expressão dos genes de Bax, p53 e Bcl-2.

Métodos

Todos os protocolos experimentais animais cumpridas Regras manejo animal de autoridades locais e “Cuidado e Uso dos Animais de laboratório” do Centro de animal Experimental da Universidade Fudan, de Xangai, China.

Detalhes da aprovação do estudo pelo comitê de ética

animal Certificado de Qualificação No .: SCXK hu (Shanghai) 2009-0019

aprovação Estudo No .: Fudan University Experimental Departamento de Pesquisa animal, aprovação No. SYXK hu (Shanghai) 2009-0082

Nomeado Review Board: Presidente: Prof. Yi-Zhun ZHU Dean, Faculdade de Farmácia Universidade Fudan. Vice-Presidente: Prof. Weiyue Lu, Prof. Wei Wu, Prof. Xun Sun, Prof. Wenjiang Zhou

Membros: Prof. Zhang yun yi, Prof. Li Cong, prof. Jiang Chen, Prof. Yin Geng li, Prof. Hong mei ji, Prof. Li Xu Yang

Secretário:. Tao lin lin

Chemicals

SPRC foi sintetizado por reacção L-cisteína com brometo de propargilo. O produto foi purificado por re-cristalização a partir de etanol-água. O produto final foi verificado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H. SAC foi comprado de Tóquio Kasei (Tóquio, Japão). Paclitaxel lipossoma foi um presente de Luye Pharma Group Ltd., de Cingapura. Propargilglicina (PAG) foi comprado de Yinzheng Chemical CO., LTD (Xangai, China). MTT (brometo de dimetil tiazolil tetrazólio) foi adquirido a partir de Amresco Inc. EUA. coloração Hoechst, ciclo celular e kits de análise de apoptose foram adquiridos a Beyotime, China. Meio RPMI 1640 foram adquiridos a GIBCO ™ Invitrogen, EUA. Os anticorpos policlonais de coelho para Bax, Bcl2 P53 e foram adquiridos a partir de Cell Signaling, EUA e o anticorpo policlonal de cabra de CSE de Santa Cruz, EUA. SuperScript II RT kit e SYBR Verde PCR Master Mix foram adquiridos a partir de Takara, Japão. kit de coloração túnel foi comprado de Calbiochem, Alemanha.

linha celular e cultura

carcinoma gástrico humano (-7901 SGC), as células foram obtidas a partir Cell Bank de Xangai Instituto de Ciências Biológicas, China e cultura em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, em frascos de cultura a 37 ° C em 5% humidificada de CO

2 incubadora. As células foram alimentadas até confluência e expandido através de tripsinização e sub-cultivadas em números mais baixos em novos frascos de cultura.

Ensaio MTT

MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, brometo) ensaio de 5-difeniltetrazólio foi realizada usando o método de Arumugam et ai. [8] com ligeiras modificações. Resumidamente, as células em suspensão contendo aproximadamente 8000 a 10.000 células foram adicionadas a cada poço de uma placa de cultura de 96 poços e incubadas durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. SPRC, SAC e paclitaxel lipossoma foram dissolvidos em meio de cultura e adicionou-se as células em placas de 96 poços. 10 concentrações finais de SPRC (1 uM, 10 uM, 100 uM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM e 30 mM), SAC (1 uM e 10 uM) e Paclitaxel lipossomas (10 uM) foram adicionados às células a estudar os seus efeitos sobre a viabilidade celular. O efeito do tratamento combinado de 10 uM e 10 uM SPRC PAG foi também estudada. Depois de 24 horas, com 100 uL de 1 mg /ml de solução de MTT foi adicionado a cada poço e re-incubação, seguido por 4 horas. 100 uL de DMSO, em seguida, foi adicionado após a remoção da solução de MTT e as placas foram agitadas durante 10 minutos. A densidade óptica das placas de cultura de 96 poços foi medida usando um leitor de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). As densidades ópticas dos poços tratados foram convertidos para uma percentagem de células vivas ( “taxa de sobrevivência celular”) contra o controle usando a seguinte fórmula:

Colony-formando ensaio

Colony formando experiência foi realizada de acordo com o método de Wang et ai. (1998, 2003) [9], [10]. A suspensão de célula única foi produzido e cultivadas em placas de 12 poços a uma densidade de 150 células por poço. Após 24 horas de plantio, foram adicionados 2 concentrações de SPRC (10 uM, 1 uM) e SAC (10 Hum, 1 UM). Uma experiência com o tratamento combinado de 10 uM e 10 uM SPRC PAG foi também estudada. As células foram incubadas durante 6 dias. As células foram então fixadas em etanol a 70% e coradas com 1% de azul de Giemsa. As colónias que consistiam em 50 células foram marcados e comparado com o grupo de controlo normal. Cada experiência foi repetida três vezes.

Hoechst ensaio de coloração

A apoptose [11], [12] foi determinada utilizando um kit de coloração Hoechst (Beyotime). células SGC-7901 foram tratadas com SPRC (10 uM), SAC (10 uM), paclitaxel lipossoma (10 uM) e combinado SPRC e PAG (cada 10 uM) durante 24 horas. As células foram lavadas duas vezes em PBS e em seguida fixadas durante 10 minutos a 4 ° C e em seguida coradas pelo corante karyophilic, Hoechst 33258, durante 5 minutos. Após uma lavagem final em PBS, as células foram montadas em moiwol, um agente anti-desbotamento, e visualizados sob luz ultravioleta com um microscópio de fluorescência. Porque este manchas da tintura de ambas as células em apoptose e não-apoptóticos, células em apoptose foram identificados como aqueles que apresentam condensação da cromatina e fragmentação nuclear.

citometria de fluxo e distribuição de fases do ciclo celular e detecção de apoptose

Todos As células foram plaqueadas em primeiro lugar a uma densidade de 2,5 x 10 placas

5 células /poço em seis poços. Após incubação com SPRC, SAC, o paclitaxel lipossomal e combinado SPRC e PAG tratamento por 24 horas, as células foram separadas e recolhidas em tubos de citometria de fluxo e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 minutos para se obter uma pelete de células.

A apoptose ensaio

as células foram coradas utilizando o kit de detecção de apoptose celular (Beyotime) de acordo com as instruções do fabricante. O sedimento celular foi lavado duas vezes com PBS. 1 × tampão de ligação foi adicionada a 1 × 10

6 células /ml, e PI foi então adicionada no escuro. Após incubação durante 30 minutos no escuro, as culas foram imediatamente analisadas utilizando citometria de fluxo Ciano (BD FACSCalibur) e software ModFit.

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular foi realizada pelo método de Herman-Antosiewicz et al [13]. Resumidamente, as células foram incubadas em meios de cultura por si só e meios de cultura contendo SPRC, SAC e paclitaxel lipossoma (10 uM) a 37 ° C durante 24 h. As células foram lavadas por PBS frio, fixadas em etanol a 70%, e armazenadas a 4 ° C para análise do ciclo celular subsequente. As células fixadas foram lavadas uma vez com PBS, em seguida, re-suspenso em 1 ml de reagente de coloração de PI (50 mg ml de iodeto /propídio e 1 mg /ml ARNase em 1 ml de tampão de citrato de sódio, pH 7,4). As amostras foram incubadas no escuro durante 30 minutos antes da análise do ciclo celular. A distribuição das células no ciclo celular foi medido pelo citómetro de fluxo de sistema de Ciano (BD FACSCalibur) análise e quantificação da distribuição do ciclo celular foi realizada utilizando vários ciclos de software (software ModFit). A percentagem de células em G1, S e G2 fases foram calculados.

cicatrização de feridas ensaio

As células foram semeadas em placas de cultura de 6 poços e deixou-se crescer a 90% de confluência. feridas de tamanhos semelhantes foram introduzidas para monocamada de células utilizando pontas de pipeta estéreis. As células em monocamada feridos foram lavadas 3 vezes por PBS para remover os detritos celulares; SPRC e SAC foram então adicionados em duas concentrações (1 Hum, 10 uM) e lipossomas paclitaxel (10 uM). A velocidade de encerramento da ferida foi monitorizada e fotografadas após 12 e 24 horas. A velocidade comparativa de fecho de feridas de células tratadas em relação ao controlo foi calculada utilizando a seguinte fórmula: (a largura da ferida de células tratadas às 0 horas – a largura da ferida em 24 horas) /(a ​​largura da ferida de células de controlo às 0 horas – o largura da ferida em 24 horas) x 100.

Quantitative real-time PCR

O ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando um kit Superscript II RT (Takara, Japão) preparado com oligo (dT). Expressões de Bcl-2, Bax e mRNA P53 foram examinados por PCR em tempo real com o Passo Um sistema de PCR (Applied Biosystems). 2 ul de produto de ADNc transcrito de forma inversa foi adicionado numa mistura reaccional de 20 ul contendo 10 ul de pré-mistura SYBR EX Taq (2 ×), 0,4 ul de Referência ROX corante (50 ×), 0,4 uM de iniciador directo e 0,4 uM de iniciador recompensa. As condições dos ciclos foram como se segue: pré-incubação a 95 ° C durante 30 s, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 5 segundos, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 31 s. Na conclusão dos ciclos, que funde análise da curva foi realizada para estabelecer a especificidade do produto de PCR. O valor quantitativo relativo foi expresso pelo

método ΔΔC T. O controle foi utilizada como a amostra de referência e p-actina foi utilizado como o controle endógeno. Cada experiência foi realizada em duplicado e repetidas três vezes. As sequências dos iniciadores e o tamanho esperado do produto eram como se segue: Humana β-actina: a frente, 5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘e inverso, 5′-TGGAAGGTGGACAGCGA-3′ (201 pb); Bax humano: para a frente, 5’-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 ‘e inverso, 5′-GTCCACGGCGGCAATCA-3′ (95 pb); BCL2 humano: para a frente, 5’-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 ‘e inverso, 5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′ (128 pb); p53 humana:. a frente, 5’-ACCACCATCCACTACAACTA-3 ‘e inverso, 5′-AAACACGCACCTCAAAGC-3’ (136 pb)

análise Western blot

As células foram plaqueadas para placas e tratada com SPRC (1 uM, 10 uM), SAC (1 uM, 10 uM) e Paclitaxel lipossoma (10 uM) durante 24 horas. Após 24 horas de tratamento, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio. As células de cada amostra foram solubilizados em tampão RIPA (50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 150 mM, NP40 a 1%, SDS a 0,1%, desoxicolato de sódio 10 mM, 1 mM de f enilmetil-sulfonylfluoride) e mantido em gelo durante 30 minutos. Células lisados ​​foram centrifugados a 10.000 g, a 4 ° C durante 10 min e os sobrenadantes foram armazenados a -70 ° C até ao ensaio. A concentração de proteína foi medida pelo método de Bradford. 25

ul

proteína para cada grupo misturados com 5

ul de tampão de carga

foram separados por gel de SDS-poliacrilamida a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno [14]. As membranas foram bloqueadas durante 2 horas em 5% de leite desnatado em pó em solução salina de tampão Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST) à temperatura ambiente. As manchas resultantes foram em seguida sondadas com anticorpo policlonal CHT (γ-liase de cistationina) /CSE Ab (1:500, Santa Cruz, EUA), anticorpo policlonal de Bcl-2 Ab (1: 1000, Cell Signaling, EUA) policlonal, Ab Bax (1