Abstract

O câncer de próstata (PCA) é atualmente a doença maligna mais frequentemente diagnosticada nos países ocidentais. É mais prevalente em homens mais velhos com 75% dos casos de incidência acima de 65 anos de idade. Após a prostatectomia radical, aproximadamente 30% dos homens desenvolver recidiva clínica com níveis de antigénio específico da próstata no soro elevado. Portanto, é importante para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes CaP progressão para desenvolver novas abordagens de diagnóstico /terapêutica. Neste estudo, pretende-se comparar o perfil de microRNA (miRNA) dos tecidos tumorais da próstata recorrentes e não-recorrentes para explorar o possível envolvimento de miRNAs na progressão CaP. RNA total de 41 recorrentes e 41 amostras de tecido CaP não recorrentes foram utilizados para investigar a assinatura miRNA em amostras APC. Primeiro de tudo, 20 recorrentes e 20 amostras de CaP não recorrentes foram perfilado o uso de chips de microarray miRNA. Dos miRNAs diferencialmente expressos, foram selecionados miR-1, miR-133b e miR-145 * para validação com qRT-PCR em um conjunto diferente de 21 recorrentes e 21 amostras de CaP não recorrentes. Os dados foram analisados ​​estatisticamente pelo teste t de Student de duas faces, teste de Correlação de Pearson, Receiver operando análise característica. Nossos resultados demonstraram que miR-1 e miR-133b foram significativamente regulada negativamente em recorrente CaP espécimes em comparação com amostras de CaP não recorrentes e têm poder suficiente para distinguir amostras recorrentes dos não-recorrentes por conta própria. Aqui, nós relatamos que a expressão relativa de miR-1 e miR-133b foram significativamente reduzidos em recorrente CaP espécimes em comparação com amostras de CaP não recorrentes, que podem servir como novos biomarcadores para a previsão de progressão CaP.

Citação: Karatas DE, Guzel E, Suer I, Ekici ID, Caskurlu T, Creighton CJ, et al. (2014) miR-1 e miR-133b são diferencialmente expressos em pacientes com recorrência do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (6): e98675. doi: 10.1371 /journal.pone.0098675

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 13 Março, 2014; Aceito: 30 de abril de 2014; Publicação: 26 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Karatas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. dados de matriz tenham sido depositados na Expressão Gênica Omnibus (GEO), sob o número de acesso GSE55323

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Investigação Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK) (número de concessão 108S051), bem como em parte pelo Instituto dos Estados Unidos Nacional de Saúde (CJC e MI, concessão P30 CA125123). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. CJC é um membro do Conselho Editorial PLOS e isso não altera a adesão dos autores a PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é atualmente a doença maligna mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de mortes por câncer entre os homens com idade superior a 50 anos em os países ocidentais [1]. CaP tem uma propensão a ser muito mais prevalente em homens mais velhos, com 75% dos casos de incidência acima de 65 anos [2]. prostatectomia radical, radioterapia radical e terapia hormonal ablação são as técnicas preferencialmente aplicadas para início de carreira clinicamente localizado tumores para curar a doença, as taxas de sobrevivência no entanto, estas técnicas não fornecem necessariamente melhoradas [3] e quase 30% dos homens desenvolvem recorrência clínica com aumento dos níveis séricos de antigénio específico da próstata (PSA) [4]. Por outro lado, para os tumores avançados e metastáticos, a quimioterapia, a qual é a única opção, falhar na sua maioria para dar o resultado clínico positiva [5]. Por isso, é de grande importância para compreender os mecanismos moleculares subjacentes a progressão do câncer de próstata para desenvolver novas abordagens diagnósticas e terapêuticas.

Os microRNAs (miRNAs) são sintetizados endogenamente, reguladores não-codificantes pequenos RNAs composta por cerca de 20 nucleotídeos e consideradas como uma nova classe de reguladores de genes. Eles suprimir a expressão dos seus objectivos através da degradação de ARNm ou inibição de translação como resultado de incompleto de ligação para as regiões 3’untranslated (3’UTR) de ARNm [6]. MiRNAs são supostos para regular a expressão de quase 60% dos genes humanos [7]. Cerca de metade dos miARNs humanos anotados estão localizados em locais frágeis do genoma sugerindo que estas moléculas pequenas pode ter uma função vital na patogénese de várias doenças, incluindo o cancro [8], [9]. Eles foram mostrados para ser capaz de distinguir estados de diferenciação de várias doenças malignas, incluindo os cancros da mama, do pulmão e do cólon. Além disso, há estudos que sugerem miARN perfil de expressão podem distinguir a partir de tecidos da próstata maligna não malignas [10], [11]. Há, no entanto, um número limitado de relatos na literatura estudada miRNAs na progressão do câncer de próstata.

Mirna profiling através de microarrays é uma técnica inestimável para determinar uma assinatura miRNA, que é necessariamente significativo para descobrir a geral e alterações de expressão específicas entre tipos distintos de tecidos [12], [13]. Neste estudo, o objetivo foi comparar o perfil miRNA dos recorrentes e não-recorrentes tecidos tumorais de próstata para lançar luz sobre um possível envolvimento de miRNAs na progressão CaP.

Materiais e Métodos

Os pacientes

RNAs foram isolados a partir de 41 de repetição e 41 cânceres não-recorrentes de prostatectomies radicais, que continham% tecido tumoral pelo menos 70, que foram obtidos de Baylor College of Medicine programa de câncer de próstata. A recidiva foi definida como dois PSA de soro consecutivas superiores a 0,2 ng /ml. Os pacientes foram acompanhados por até recorrência PSA ou, pelo menos, 4 anos (para os casos de não-recorrentes). Este estudo foi aprovado por um conselho de revisão institucional interna do Baylor College of Medicine. Os pacientes foram incluídos no estudo após darem o seu consentimento informado por escrito. As características dos pacientes recorrentes e não-recorrentes estão resumidos na Tabela 1.

Total de RNA Isolation

O RNA total de 41 recorrentes e 41 amostras de tecido não-recorrentes usando Trizol (Invitrogen , San Diego, CA) de reagente de acordo com as instruções do fabricante. As purezas e das concentrações de amostras de ARN foram determinadas espectrofotometricamente utilizando NanoDrop ND-2000C (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE). integridade do RNA foi testada usando eletroforese em gel e verificar no local de Ácido Nucleico quantificação Kit (Sigma).

Mirna Microarray e Análise de Dados

100 ng de ARN total de 20 recorrentes e 20 amostras não recorrentes são marcado com Cy3 usando Agilent miARN kit de marcação seguindo o protocolo do fabricante. Os ARN marcados são desnaturadas por calor e hibridado com Agilent 8 × 15 K miARN microarray V2 composta de 799 sondas de segmentação uma vasta selecção de 723 humano e 76 miARNs virais humanos, com sondas de controlo de Sanger miRBase (liberar 10,1) a 55 ° C durante 20 h. Depois de hibridação e pós-hibridação lavagens, as lâminas foram digitalizadas imediatamente Agilent Microarray Scanner com SureScan Tecnologia alta resolução (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Característica v10.7.3.1 Extraction (Agilent Technologies, CA) de software foi utilizado para extrair todos os recursos dos dados obtidos a partir das imagens digitalizadas e software Bioconductor foi usado para analisar os dados brutos, que foram normalizados pela normalização quantil. Os valores de P (por t-teste bilateral) e dobre as alterações entre os grupos de comparação foram calculados, utilizando dados transformados em log. Fora de 15714 sondas, o número de verdadeiros positivos seria necessário exceder em muito 157 para a taxa de detecção falsa esperado (FDR), a ser considerado de baixo (usando o método por Storey et ai. [14]). As sondas nominalmente significativas não excedeu oportunidade esperada pelos testes múltiplos, o que exigiu a validação adicional de escolha miRNAs. dados de matriz tenham sido depositados na Expressão Gênica Omnibus (GEO, número de acesso GSE55323).

cDNA Synthesis and Quantitative PCR em Tempo Real

Para validar a expressão diferencial de miR-1, miR- 133b e miR-145 *, amostras de RNA a partir de um conjunto diferente de 21 recorrentes e 21 pacientes não-recorrentes foram estudados. Para as experiências de miARN qRT-PCR, de quantidades iguais de ARN total (30 ng) de cada amostra foi utilizada para a síntese de ADN da primeira cadeia (ADNc) utilizando miARN iniciadores específicos adquiridos da Applied Biosystems e “kit de transcrição reversa TaqMan MicroRNA” de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). TaqMan HSA-miR-1 (Ensaio ID: 002222), -133b (Ensaio ID: 002247) e -145 * (Ensaio ID: 002149). Kits de amplificação foram obtidos de Applied Biosystems (Foster City, CA):

análise de expressão de miARN por RT-PCR quantitativa foi levada a cabo usando um Roche LightCycler480-II em tempo real termociclador (Roche, Suíça). TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado e sondas específicas microRNA foram adquiridos a Applied Biosystems (Dinamarca). dados de expressão de miRNA foram normalizados para RNU43. Cada experiência foi realizada em duplicado. A análise quantificação relativa foi realizada pelo método delta-delta-Ct, como descrito anteriormente [15].

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student dos dois lados. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. teste de correlação de Pearson foi usado para mostrar a correlação de miR-1 e miR-133b expressão em espécimes APC. operating characteristic (ROC) do receptor foram plotados usando SPSS 15.0 para ver o poder da PSA e miRNAs validados para diferenciar as amostras de CaP recorrentes a partir de amostras não-recorrentes. Para análise ROC, análise de regressão logística foi realizada e as probabilidades previstas foram calculadas para cada um miARN ou miR-1 e miR-133b em conjunto. Então, a área sob a curva é calculada com intervalo de confiança de 95%. A área sob a curva é aceite significativamente diferente de 0,5 quando p-valor é maior do que 0,5 sentido de que a regressão logística classifica o grupo significativamente melhor do que por acaso.

Resultados

Um total de 41 recorrente e 41 tumores não-recorrentes de prostatectomies radicais, que foram obtidos a partir de Baylor College of Medicine programa Cancer de próstata, foram incluídos neste estudo para realizar miRNA profiling (Tabela 1). A média de idade no momento da cirurgia dos pacientes APC com recorrência foram 62,8 ± 6, enquanto aqueles sem recorrência tinham uma idade média de 61,7 ± 7,2 (não significativa, p = 0,54, Mann Whitney). Mais de 80% dos pacientes em ambos os grupos eram caucasianos não-hispânicos. Média meses de operação a 1

st recorrência ou última avaliação normal para recorrentes e pacientes CaP não recorrentes foram 22,63 ± 3,89 e 76,59 ± 2,87, respectivamente. Os níveis de PSA varia de 4,2 a 100 e 3,1-40,3 em pacientes com recorrência e não-retorno, respectivamente. Como esperado, o nível médio do PSA pré-operatório de pacientes recorrentes foi quase o dobro dos pacientes não-recorrentes (22 vs. 11,3 ng /ml). Em pacientes recorrentes apenas 3 amostras foram Gleason 6 (3 de 41), enquanto para os pacientes não recorrentes 14 de 41 amostras foram Gleason 5 ou 6. Da mesma forma, 15 de 40 prostatectomies radicais de pacientes recorrentes para os quais havia dados disponíveis mostrou invasão das vesículas seminais, mas apenas 4 dos 41 cânceres não recorrentes tinha esse recurso. Assim, enquanto as características demográficas dos dois grupos são muito semelhantes, os cancros recorrentes são muito mais altamente agressivo com base em características clínicas e patológicas.

Para comparar os perfis de miRNA de repetição e espécimes CaP não recorrentes, foi realizada análise de microarray utilizando 20 amostras de cada grupo. análise de microarray de 20 recorrentes e 20 amostras não recorrentes revelou que 93 sondas foram diferencialmente expressos com um valor de p inferior a 0,01. Das 93 sondas nominalmente significativas relatadas, há 84 mapeamento para miRNAs humanos, que são fornecidos na Tabela S1.

Uma representação mapa de calor dos miRNAs diferencialmente expressos é demonstrado na Figura 1A. Entre os miRNAs significativamente desregulados, Mir-1, miR-133b, e miR-145 * (Figura 1B) foram selecionados para confirmação qRT-PCR em um conjunto diferente de recorrentes e não-recorrentes amostras APC.

representação (A) calor-map de miRNAs significativamente desregulados em CaP recorrente espécimes vs. espécimes CaP não recorrentes. (B) representação Heat-mapa de miR-1, miR-133b e miR-145 * em CaP recorrente espécimes vs. espécimes CaP não recorrentes.

Os resultados qRT-PCR demonstrou que a expressão nível de miR-1 foi significativamente reduzido nas amostras de CaP recorrente do que a de amostras de tecido não-CaP recorrentes (Figura 2A, p = 0,036). Regulação negativa de miR-133b em CaP recorrente (Figura 2B, p = 0,012) foi também confirmada. Pelo contrário, embora não haja uma ligeira diminuição do nível de expressão de miR-145 * em amostras recorrentes, em comparação com os não-recorrentes, a diferença não era estatisticamente significativa (Figura 2C, p 0,05). Para avaliar a correlação de miR-1 e miR-133b expressão em ambas as amostras de CaP não recorrentes de repetição e, utilizou-se a análise de correlação de Pearson, que demonstrou que o miR-1 expressão estava fortemente correlacionada com a expressão de miR-133b em amostras de tecido PCA (Figura 3, o coeficiente de correlação (r) = 0,780).

os níveis de expressão relativa (a) miR-1, (B) o miR-133b, e (C) o miR-145 * em 20 recorrente CaP em comparação com os espécimes 20 não recorrentes espécimes APC. RNU43 foi utilizado para normalização da expressão miRNA analisa.

Para testar o poder da PSA, miR-1 e miR-133b para distinguir recorrente CaP espécimes a partir de amostras não recorrentes, operacional receptor curvas (ROC) foram representadas graficamente, que mostrou que a PSA, miR-1 e miR-133b tinha área sob a curva (AUC) de 0,950, 0,661 e 0,692, respectivamente, o que demonstra a sua suficiência de ter a capacidade de distinguir amostras recorrentes de os não-recorrentes por conta própria. Além disso, quando o miR-1 e miR-133b foram avaliados, juntos, representaram melhor poder (AUC; 0,719). Do que o caso em que miRNAs foram analisados ​​individualmente (Figura 4)

Curves para miRNAs individuais e seu poder cooperativa para discriminar dois grupos de pacientes constituídos por 20 recorrentes e 20 espécimes CaP não recorrentes.

Discussão

PCA é uma doença altamente heterogêneo, para os quais indicadores prognósticos atuais em sua maioria não conseguem determinar o resultado e quase 30% dos pacientes CaP experimentar uma recaída após uma prostatectomia radical ou adjuvante bem sucedida terapia [16], [17]. Actualmente, a fase do tumor primário, o nível de PSA no soro, e biópsia Gleason são utilizados durante a avaliação clínica para prever a fase patológico do tumor e a eficiência do tratamento, no entanto, nenhum ou mesmo uma combinação destes indicadores são suficientes para prever de forma fiável resultados para pacientes [3], [4]. Um critério de consenso sobre a definição de recorrência bioquímica com base nos níveis de PSA, não foi bem estabelecido, o que impede o estabelecimento de um modelo prognóstico padrão em homens tratados com prostatectomia radical [18]. Além disso, a detecção de PSA no soro de pacientes com CaP após a prostatectomia radical pode ser devido à presença de tecido da próstata benigna residual, que desvia praticantes para chegar a um diagnóstico positivo falso [19]. Além disso, os pacientes com níveis de PSA do soro semelhante, marcar Gleason e fase patológica tem sido mostrado para ter resultados clínicos distintos, devido à heterogeneidade dos subtipos a nível molecular [20], [21].

Devido à fato de que novos biomarcadores de prognóstico são urgentemente necessários para o desenvolvimento mais eficaz, otimizado e estratégias de terapia individualizada, vários biomarcadores de prognóstico putativos foram sugeridas nos últimos anos, que alcançaram o sucesso limitado na estratificação dos pacientes [22]. Por exemplo, vários genes, que são especificamente detectadas na próstata, tais como humano KLK2, PCA3, antigénio da membrana específico da próstata e o antigénio de células estaminais da próstata foram sugeridos como marcadores úteis de prognóstico para a predição de características patológicas em pacientes com CaP [23]. expressões alteradas de Bcl-2 e Bax também foram associados com o desenvolvimento posterior de recorrência bioquímica [18]. No entanto, entre os genes propostos como biomarcador de prognóstico dependendo da expressão gênica em larga escala profiling estudos, apenas alguns genes pode ser validado em vários estudos [24]. Além disso, vários modelos de previsão de risco clínico foram desenvolvidos para prever o risco de recorrência bioquímica ou falha clínica, embora esses modelos também não confiável e precisa estimar o resultado clínico, devido à heterogeneidade da doença [25]. Considerando as limitações das ferramentas e modelos prognósticos atuais, é importante incorporar novos biomarcadores para modelos existentes para superar essas limitações durante os processos de tomada de decisão clínica.

Portanto, é um objetivo vital na pesquisa atual do câncer de próstata para descobrir biomarcadores moleculares de prognóstico eficazes que ajudam a identificar com precisão os pacientes com doença agressiva e metastática, a fim de orientar as decisões terapêuticas e determinar os pacientes que precisa de acompanhamento mais próximo e cuidados intensivos. Além disso, a identificação de biomarcadores com potencial para prever a recorrência após prostatectomia radical poderia ter significado clínico fundamental para decidir se a terapia adjuvante é necessária. Tais biomarcadores seria especialmente valioso para pacientes com desfechos distintos, embora eles têm características clínicas semelhantes.

A primeira implicação dos miRNAs na biologia do câncer tem sido descrita através da detecção de miR-15 e miR-16 downregulation na crónica de células B leucemias linfocíticas [26]. Desde então, vários miARNs foram associadas a patogénese do tumor através de jogar papel na iniciação, progressão, metástase de câncer e [27], [28]. Além de investigar a expressão diferencial de miRNAs em câncer, é importante explorar perfis de miRNA de amostras para descobrir uma associação de expressão miRNA com o resultado clínico.

miR-1 e miR-133b, codificado de miR -1 /133a e miR-206 /133b aglomerados, foram indicados como miRNAs específicas do músculo [29] e foram relatados para ser frequentemente reprimidos em vários tipos de tumor [30]. Além disso, a sua sobre-expressão ectópica foi demonstrada para inibir o crescimento celular, a migração celular e induzir a apoptose em diversos tipos de cancros [30]. miR-1 foi recentemente sugerido como um marcador de prognóstico em CaP para prever a recorrência [31]. Sua regulação baixa pode estar envolvido na CaP recorrência níveis elevados completas de seus alvos. Por exemplo, a sobre-expressão de CXCR4 e SDF-1alfa, como alvos validados de miR-1 [32], foram associados com a recorrência local e metástases à distância em ACP [33] e mau prognóstico em estágio II adenocarcinoma ductal pancreático [34], respectivamente. A sobre-regulação de NOTCH3, um oncogénica miR-1 alvo, foi também demonstrada a associar com CaP recorrência [35]. Como para o papel de miR-133b em recidiva, que tem sido associado com a metástase e sobrevivência global em cancro colorrectal [36] e proposto como um biomarcador para prognóstico CaP recorrência num estudo muito recente [37]. Níveis elevados de alvos de miR-133b validados como CXCR4 [38], FGFR1 [39], FSCN1 [40] tem sido associada com o prognóstico de vários cancros.

Conclusões

As técnicas atuais fazer não necessariamente oferecem as taxas de sobrevivência melhoradas para pacientes APC e quase 30% dos homens desenvolvem recorrência clínica com os níveis de antígeno específico da próstata elevada de soro. Portanto, é de suma importância para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes a progressão CaP para desenvolver novos e ferramentas terapêuticas /diagnósticos eficazes. Aqui, nós relatamos que o miR-1 e miR-133b foram significativamente regulada negativamente em recorrente CaP espécimes em comparação com amostras de CaP não recorrentes, que podem servir como novos biomarcadores para a previsão de progressão CaP.

Informações de Apoio

Tabela S1.

A lista de miRNAs diferencialmente expressos em vs. amostras de câncer de próstata não recorrentes recorrentes

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0098675.s001

(XLS)

Reconhecimentos

Agradecemos Yiqun Zhang para a assistência técnica na análise de microarray.