Abstract

L-carnitina (LC) é acreditado geralmente para transportar grupos acilo de cadeia longa de ácidos graxos na matriz mitocondrial para a geração de ATP

via

o ciclo de ácido cítrico. Com base na teoria de Warburg que a maioria das células cancerosas dependem principalmente da glicólise para produção de ATP, que a hipótese de que, o tratamento LC levaria a perturbação do metabolismo celular e a citotoxicidade em células de cancro. Neste estudo, HepG2 de hepatoma humano, linhas de células SMMC-7721, foram utilizados ratinhos e timócitos de cultura principal, com tumor de HepG2. teor de ATP foi detectada por ensaio de HPLC. ciclo celular, morte celular e viabilidade celular foram ensaiados por citometria de fluxo e MTS, respectivamente. Gene, a expressão de ARNm e o nível de proteína foram detectadas por microarrays de genes, PCR em tempo real e de Western blot, respectivamente. actividades de HDAC e acetilação de histona foram detectadas tanto no tubo de ensaio e em células em cultura. Um estudo de encaixe molecular foi realizado com o protocolo CDOCKER of Discovery Studio 2.0 para prever a interação molecular entre L-carnitina e HDAC. Aqui descobrimos que (1) o tratamento LC crescimento de células cancerosas seletivamente inibida

in vivo

e

in vitro

; (2) Tratamento LC induz seletivamente a expressão da p21

cip1 gene, mRNA e proteína em células cancerosas, mas não p27

KIP1; (4) LC aumenta a acetilação das histonas e induz a acumulação de histonas acetiladas em ambos os timócitos normais e células cancerosas; (5) LC inibe diretamente HDAC I /II atividades

via

ligação aos sítios ativos de HDAC e induz a acetilação das histonas e acúmulo de lisina-acetilação

in vitro

; (6) O tratamento LC induz acúmulo de histonas acetiladas em cromatina associados ao p21

cip1 gene, mas não p27

KIP1 detectado pelo ensaio ChIP. Estes dados sustentam que a LC, além de transportar grupo acilo, funciona como um inibidor de HDAC endógena na célula, o que seria de grande importância fisiológica e patológica

citação:. Huang H, Liu N, Guo H, Liao S, Li X, C Yang, et ai. (2012) L-Carnitina é uma célula de crescimento endógeno HDAC Inibidor Cancer seletivamente Inibidor

In Vivo Comprar e

In Vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49062. doi: 10.1371 /journal.pone.0049062

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 21 Dezembro, 2011; Aceito: 09 de outubro de 2012; Publicação: 05 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de alta Tecnologia Nacional da China (Project 2006AA02Z4B5), National Natural Science Foundation da China (Projetos 81070033, 30770835, 81170608, 81072091); Projetos (9251018201002, 94510018201003604) da província de Guangdong Natural Science Foundation e projetos de Guangzhou Comissão Municipal de Educação (10A 057S, 08A 108) (a JL, HH e CZ). Este estudo é em parte financiado pelo National Institutes of Health subvenção R01HL072166 e R01HL085629 (para XW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carnitina é biossintetizado a partir dos aminoácidos lisina e metionina e a sua forma biologicamente activa é L-carnitina (LC). Acredita-se geralmente que a carnitina transporta grupos acilo de cadeia longa de ácidos gordos para a matriz mitocondrial, onde eles podem ser discriminados através β-oxidação de acetil-CoA para obter energia utilizável

através do ciclo de ácido cítrico [ ,,,0],1] – [3]. Portanto LC é necessário para a geração de energia metabólica em células vivas.

Tem sido bem conhecido que a maioria das células cancerosas predominantemente gerar energia por uma alta taxa de glicólise seguido de fermentação de ácido láctico no citosol, em vez de pela uma comparativamente baixa taxa de glicólise, seguido por oxidação do piruvato em mitocôndrias como a maioria das células normais. Isto é conhecido como efeito de Warburg em células cancerosas [4], [5]. Rápido crescimento células malignas normalmente têm taxas glicolíticas que são até 200 vezes mais elevados do que os dos seus tecidos normais de origem. Apesar de efeito Warburg foi contestada e desenvolvida, esta teoria continua a ser a mais citada evidência de que tumores exibir o metabolismo disfuncional [6].

Com base nesta teoria de que o ciclo cítrico é prejudicial na maioria das células cancerosas [7 ], [8], os autores sugerem que a LC poderia conduzir a perturbações do metabolismo celular em células cancerosas mas não em células normais. Neste estudo, foram investigados os efeitos de LC sobre a citotoxicidade tanto em cancro e as células normais. Descobrimos que o crescimento de células de câncer seletivamente inibida LC ambos

in vitro

e

in vivo

. Nós investigamos ainda mais o mecanismo de citotoxicidade mediada por LC e descobriu que concentrações fisiológicas de LC pode inibir directamente as actividades de HDAC.

Materiais e Métodos

Materiais e agentes

LC, R -carnitina, oligomicina (N ° 04876), butirato (Buty) e tricostatina A (TSA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). HDAC

TM ensaio I /II e rastreio sistema foi adquirido a Promega Corporation (Madison, WI). L-glicose e D-glucose foram obtidos a partir de Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemanha). de soro bovino fetal (FBS) foi adquirido de Invitrogen Co. (Carlsbad, CA). Os anticorpos de coelho monoclonais contra Acetil-H3 (Lys9) (C5B11), anticorpos policlonais de coelho contra a PARP, acetilada-Lisina, acetil-H4 (Lis8), e anticorpos monoclonais de ratinho contra a p21

WAF1 /Cip1 (DCS60) foram todos adquiridos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Os anticorpos contra Rb (G401), fosfo-Rb (S780) foram adquiridos a Bioworld Technology, Inc. rato p27 anticorpo monoclonal (F-8), os anticorpos policlonais de coelho contra a GAPDH (FL-335) e peroxidase de rábano (HRP) marcado com secundária Os anticorpos foram de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). reagentes de quimioluminescência aumentada foram adquiridos de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Ratos e dieta

Homem normal de Balb /c e Balb /c ratos nus com idades entre 5 semanas (18-22 g) foram adquirido, respectivamente, de Guangdong animal Center e alojados em aço inoxidável gaiolas de arame em uma sala de animais à temperatura constante com um ciclo de 12 h-luz /-Dark. Os ratos consumiram uma dieta e água ad libitum não purificada comercial. Todos os protocolos experimentais foram de acordo com o Centro Animal de Guangdong para o tratamento ético dos animais e aprovado pela Comissão experimental animal de Guangzhou Medical College (SCXK2008-2002). camundongos Balb /c normais machos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 8 ratinhos /grupo) e foram

i.p

. injectados quer com veículo (solução salina) ou LC de 400 mg /kg durante 15 dias consecutivos. O peso corporal e peso de órgãos foram detectados e resumidas. ratinhos nus macho Balb /c foram

s.c

. inoculado na axila esquerda com células HepG2 (1 × 10

6 células /mouse). Quando o tamanho do tumor atinge 50-75 mm

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 8 ratinhos /grupo) e foram

ip

injectados quer com veículo (solução salina) ou LC (400 mg /kg, uma vez /dia) durante 15 dias, excepto dia 8. peso do corpo e do tumor foram detectados peso e resumidas. Para melhor ilustrar esses resultados, todos os dados primários foram alteradas para o nível relativo (%).

cultura celular

linhas de células humanas hepatoma HepG2 e SMMC-7721, adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA), foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 U /mL de penicilina benzilo e 100 U /mL de estreptomicina, a pH 7,4, numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. isolamento de timócitos e cultura primária foi realizada como se segue: resumidamente, o timo de rato Balb /c foi rolado sobre um pedaço de gaze estéril para remover a gordura em anexo e o tecido conjuntivo e a glândula foi colocada em um prato de 60 milímetros de Petri contendo 5 ml de frio meios (HBSS a pH 7,0 contendo 5% de soro fetal de vitela a 4 ° C) e gentilmente provocou o timo distante com agulhas e pipetados para cima e para baixo várias vezes para quebrar-se cuidadosamente todos os aglomerados de células. As misturas foram passados ​​através de uma malha de aço inoxidável de 75 ^ m a remover grumos de tecido, centrifugou-se as suspensões de células (250 g, 10 min, 4 ° C) e ressuspenderam-se os sedimentos celulares com 5 ml de meio RPMI 1640. Os números de células totais foram contadas com azul de tripano em um contador de células brancas do sangue.

A morte celular ensaio

Este foi realizada utilizando anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) coloração dupla, seguido por citometria de fluxo, como previamente descrito [9]. Em resumo, as células HepG2 em cultura foram colhidas e lavadas com PBS frio e ressuspenderam-se com o tampão de ligação, seguido de anexina V-FITC durante 15 min de incubação e PI coloração durante mais 15 min a 4 ° C na obscuridade. As células coradas foram analisadas com citometria de fluxo dentro de 30 min.

teor de ATP determinação

Determinação do teor de ATP foi realizada como descrito anteriormente [10]. Resumidamente, mesmo número de células de cultura foi recolhido e o sedimento celular foi imediatamente congelado e armazenado em azoto líquido para análise subsequente do ATP. Os lisados ​​foram centrifugados a 12 000 r.p.m. durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido para análise de ATP, utilizando um ensaio de fase reversa C18 de HPLC (LC-6AD, Shimadzu, Japão), após o que o pH foi ajustado a 7,4. 180 mM de KH

2 PO?

4 (5% de metanol) foi utilizado como fase móvel (pH 6,25) funcionando a 0,8 ml /min. O ensaio foi linear 0,05-200 ug /ml para o ATP com coeficiente de determinação (R ​​

2) 0.999. Validação coeficientes de variação para os ensaios intra e inter-dia foi inferior a 1,5% e 5,1%, respectivamente. conteúdo ATP relativo é calculado de acordo com a área do pico

contra

a ATP ficar curva.

A viabilidade celular ensaio

Os efeitos das drogas sobre a viabilidade celular foram determinados pela MTS ensaio (CellTiter 96® Aqueous One Solution ensaio de proliferação celular, Promega Corporation, Madison, WI, EUA) como previamente relatado [9]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços e tratadas com agentes indicado para 24 ou 48 h. Em seguida, as células tratadas foram incubadas com 20 uL de MTS durante mais 3 h. A absorvância foi medida a 490 nm com leitor de microplacas automático (Sunrise, Tecan). A viabilidade celular foi calculada pela seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = (absorvância média do grupo tratado – absorvância média de espaço em branco) /(absorvância média de absorvância média de grupo- não tratada em branco)] x 100%

histona e proteína acetilação

in vitro Comprar e em células cultivadas

Para

in vitro

acetilação de proteínas, ligado celular a partir de qualquer células cancerosas ou de timócitos de ratinho foram incubadas com várias doses de LC e TSA ou Buty em um tampão de ensaio de HDAC, a 37 ° C durante 1,5 h, depois acetilado-H3, -H4, e proteínas de lisina acetilada-foram detectadas por Western Blot. Para a acetilação de proteínas em células de cultura, quer de células de cancro ou de timócitos de ratinho foi tratado com diferentes concentrações de TSA ou LC e Buty para vários pontos de tempo, as células foram recolhidas e em seguida, a acetilação de proteínas foi detectado por Western Blot.

Western Blot

Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [11], [12]. Resumidamente, uma quantidade igual de proteína total extraído a partir de células cultivadas foi separado por 12% SDS-PAGE e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Os anticorpos primários e peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários apropriados foram usados ​​para detectar as proteínas designadas. Os anticorpos secundários delimitada, a membrana de PVDF foram feitos reagir com os reagentes de detecção ECL e expostos a filmes de raio-X (Kodak, Japão). A exposição filme de raios-x foi digitalizado e digitalizadas usando um scanner de alta resolução. A densidade de bandas desejadas foi quantificada com o Quantidade Um software (BioRad).

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular foi realizada conforme relatado anteriormente [12]. As células HepG2 foram semeadas em placas de 6 cm dia para o outro em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, em seguida, tratada com LC em pontos de tempo indicados. As células foram recolhidas, lavadas por PBS, e coradas com PI, na presença de ARNase. Os dados foram analisados ​​com base na distribuição de populações de células em diferentes fases do ciclo celular.

Modelagem computacional

A fim de compreender a interação molecular entre L-carnitina e HDAC, um estudo de encaixe molecular foi realizado com o protocolo CDOCKER of Discovery Studio 2.0 (Accelrys Software Inc). A estrutura cristalina de HDAC (PDB ID: 1ZZ0) foi utilizado como a proteína de ancoragem. Primeiro, somente a subunidade de cadeia A foi mantida após outras subunidades de cadeia, conformações alternativas, a ACT ligando original, metais potássio e moléculas de água foram removidos. Em seguida, átomos de hidrogénio e cargas Gasteiger foram adicionados à subunidade. Finalmente, apenas as posições de hidrogênio foram otimizados com Dreiding-like campo de força usando o menu Limpo Geometry. Enquanto isso, o composto L-carnitina selecionado como o inibidor de ancoragem também foi otimizado com Dreiding-like campo de força usando o menu Limpo Geometry. A proteína de HDAC foi rígida, enquanto que a LC era ligando flexível durante o processo de ancoragem. A entrada do site Sphere foi centrada na ACT ligando original com raio de 12 Å. Top hits, conformações aleatórias e Orientações para refinar os parâmetros foram todos definidos para 20. A conformação correspondente ao menor CDOCKER Interação Energia foi selecionada como a conformação de ligação mais provável. Por fim, o complexo de ancoragem foi ainda estimada energia livre de ligação pela Calcular protocolo de energias de ligação. Todos os parâmetros usados ​​no cálculo foram padrão, exceto para explicada.

ensaio de actividade HDAC

in vitro Comprar e em células cultivadas

actividade HDAC

in vitro Comprar e em células cultivadas foi detectado com o HDAC-Glo ™ I /II Ensaio e Sistema de Triagem (Promega, EUA), seguindo o protocolo padrão. Ensaio de HDAC foi realizada em placa branca de 96 poços. Para

In vitro

ensaio de actividade de HDAC, lisado celular (teor de proteína óptima: 1 ug) foi incubada com vários agentes em um tampão de ensaio de HDAC (100 uL) a 37 ° C durante 60 minutos e, em seguida, 100 ul de HDAC

TM I /II foi adicionado reagente, após 30 minutos, foi medida a luminescência. Para o ensaio de HDAC em células em cultura, as células (10000 células /poço) foram tratados com os agentes de LC ou controlo positivo durante 6 h ou 12 h, em seguida a célula meio foi mudado para meio isento de soro mais tampão de HDAC (50 ul + 50 ul). Após 15 min de incubação, a HDAC

TM I /II reagentes (100 ul) foram adicionados às células, luminescência foi medida após 30 min.

quantitativo em tempo real, PCR

Os ARNs totais foram extraídos a partir de células HepG2 com o reagente TRIzol. A transcrição reversa do RNA purificado foi realizada utilizando sobrescrito III transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). A quantificação de todos os transcritos de genes foi feita por quantitativa utilizando o kit de TaKaRa SYBR Premix Ex Taq com Applied Biosystems 7500 Fast System PCR em Tempo Real. Os valores de P21 e P27 foram mostradas em relação ao valor de GAPDH que foi utilizado como um controlo. Os conjuntos de iniciadores para a amplificação estão listados abaixo: p21-F: 5’GTC CAG CGA CCT TCC TCA TCCA3 ‘; p21-R: 5’CCA TAG CCT CTA CTG CCA CCA TC3 ‘; p27-F: 5’ACT GAG GCG GAG ACG AAG GT3 ‘; p27-R: 5’CCT GAC AAG CCA CGC AGT AGAT3 ‘; GAPDH-F: 5’CCA GCA AGA GCA CAA GAG GAA3 ‘; GAPDH-R:. 5’GGT CTA CAT GGC AAC TGT GAGG3 ‘

ensaios ChIP

1 × 10

7 células HepG2 foram preparadas para o ensaio ChIP, realizada como descrito anteriormente [ ,,,0],13] por Kangchen empresa de biotecnologia (Shanghai). Para cada ensaio de chip, a amostra era uma mistura de 3 amostras de células independentes. O anticorpo anti-H3K9 foi utilizado para imunoprecipitar histonas. Todas as amostras de aparas foram feitas por PCR em tempo real, usando o termociclador TaKaRa PCR e Rotor Gene 3000-PCR em tempo real. P21 e p27 iniciadores foram os seguintes: p21-F: 5’GCC GAA GTC AGT TCC TTG TG3 ‘; p21-R: 5’CGG GGT CCC CTG TTG TCT3 ‘; p27-F: 5’CTC TGA GGA CAC GCA TTT GGT3 ‘; p27-R: 5’TGC AGG TCG CTT CCT TAT TC3 ‘. Os dados são apresentados como enriquecimento vezes calculada por cada valor anticorpo chip (IP /Input, o percentual de entrada) em relação ao IgG valor controle de cavacos.

ensaio de DNA microarray e análise

células HepG2 foram tratadas diferentes doses de LC durante 24 h, e, em seguida, as células foram recolhidas e extraiu-se com agentes de Trizol. quantidade e qualidade do ARN foram medidos por NanoDrop ND-1000. a integridade de ARN foi avaliada por electroforese em gel desnaturante de agarose padrão. microarray de DNA foi realizada por Kangchen empresa de biotecnologia (Shanghai), em conformidade com as diretrizes Miame. A Human 12 × Gene Expression 135K matriz foi fabricado pela Roche NimbleGen. Resumidamente, cerca de 5 ug de ARN total de cada amostra foi utilizada para a marcação e hibridação de matriz como os seguintes passos: (1) A transcrição reversa com Superscript pela Invitrogen kit de síntese de ADNc-ds; (2) rotulagem ds-cDNA com NimbleGen uma cor kit de marcação de ADN; (3) a hibridação da matriz usando o Sistema de Hibridização NimbleGen e seguida por lavagem com o tampão de lavagem kit NimbleGen; (4) digitalização matriz usando o scanner microarray Axon GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation). As imagens digitalizadas (formato TIFF) foram então importados para software NimbleScan (versão 2.5) para o alinhamento da rede e análise de dados de expressão. aumento da expressão do gene dobra foram calculados em comparação com o controle do veículo.

Métodos estatísticos

A menos que indicado de outra forma, média + SD são apresentados quando aplicável. de Student não pareado

t

-teste ou one way ANOVA é usado quando apropriado, para determinar as probabilidades estatísticas.

P

valor inferior a 0,05 é considerado significativo.

Resultados

tratamento LC inibe selectivamente o crescimento de células de câncer

in vivo

e

in vitro

tem sido bem conhecido que a maioria das células cancerosas dependem da glicólise para produção de ATP. Para confirmar ainda que nos sistemas celulares, várias linhas celulares de cancro foram utilizadas para testar se oligomicina pode inibir a produção de ATP. O resultado em células cancerosas representativas foi mostrado. Verificou-se que, na presença de L-glucose no meio de cultura, oligomicina esgotam rapidamente, enquanto a produção de ATP na presença de D-glucose no meio de cultura não afectou a oligomicina geração de ATP (Fig. 1

um

). Uma vez que a L-glicose não pode ser usado para produzir a produção de ATP [10], este resultado sugere que as células cancerosas se baseiam principalmente na glicólise D-glicose para a produção de ATP, consistente com relatos anteriores [4], [5]. A seguir, investigou se o tratamento LC poderia aumentar a produção de ATP intracelular em células cancerosas. Consistente com nossa previsão, tratamento LC não poderia aumentar ainda mais a produção de ATP, tanto HepG2 hepática e células cancerosas SMMC-7721 (Fig. 1

b

). No entanto, em contraste com o efeito em células cancerosas, oligomicina, quando adicionado em timócitos de ratinho cultivados com D-glucose, a geração de ATP dependente do tempo inibida (Fig. 1

C

) enquanto LC eficientemente aumento do conteúdo de ATP intracelular em diferentes pontos de tempo sob esta condição (Fig. 1

d

). Estes resultados confirmam que a LC é capaz de gerar ATP em timócitos de ratinho normais, mas não em HepG2 hepática e células cancerosas SMMC-7721.

(a) As células cancerosas são resistentes a oligomicina na presença de D-glucose ( 2 g /L), mas não a L-glicose (2 g /L). células cancerosas humanas HepG2 foram cultivadas na presença ou ausência de um D-glicose ou L-glicose no meio de cultura e tratados com várias doses de oligomicina (0,1, 0,25, 0,5. 1,0 ug /ml) durante 6 h e o teor de ATP foi avaliada. Média + DP (n = 3). *

P Art 0,01,

contra

controle. MS: DMSO. (B) CL não aumenta o conteúdo de ATP intracelular em células cancerosas. As células HepG2 hepática e SMMC-7721 humanos foram cultivadas em meio normal de cultura, respectivamente, e tratados com diferentes doses de LC de 6 horas, foi detectado teor de ATP. LC: L-carnitina. (C) Thymotytes são sensíveis a oligomicina na presença de D-glicose (2 g /L). timócitos de ratinho foram tratadas com oligomicina (1 mg /ml) a diferentes pontos de tempo (1, 3, 6, 9 H), foi detectado teor de ATP total. (D) LC eficiente aumenta o conteúdo de ATP celular. timócitos de ratinho foram tratadas com LC (1 mM) durante várias vezes, o teor de ATP celular foi assassed. Veh:. Veículos

Em seguida, compararam os efeitos da LC sobre o tecido normal e crescimento do câncer

in vivo

. Normais camundongos Balb /c ou ratos BALB /c nus inoculados com células cancerosas HepG2 foram

i.p

. injectados com LC (400 mg /kg) durante 15 dias, excepto dia 8, seguido por terminação da experiência. Este programa de dose é uma dose tolerada em ratinhos nus Balb /c. peso dos órgãos e peso do tumor de cada ratinho tratado por LC ou controlo foram comparados. Verificou-se que o tratamento LC inibiu mais de 70% do crescimento do cancro, enquanto ao mesmo tratamento diminuiu menos de 20% do desenvolvimento normal dos órgãos e o peso corporal (Fig. 2

um

).

(a) LC inibe selectivamente o crescimento do tumor de HepG2 em comparação com tecidos normais. BALB ratos pelados /c foram

s.c

. inoculado na axila esquerda de cada rato com células HepG2 (1 × 10

6 células /mouse). Quando o tamanho do tumor atinge 50-75 mm

3, ratinhos nus foram

i.p

. injectados com 400 mg /kg para 15 dias consecutivos. ratinhos BALB /c normais foram tratados como os ratinhos nus. Corpo e peso do órgão foram detectados. B. W: O peso corporal. Média + DP (n = 8). *

P Art 0,01, **

P Art 0,05,

contra

cada controle, respectivamente. % De inibição = peso corporal ou do peso de órgãos no grupo tratado com LC /média do peso corporal ou do órgão de peso no grupo de controlo x 100. (B) CL inibe a proliferação de células HepG2 de uma forma dependente da dose. As células HepG2 foram tratadas com várias doses de LC (1,25, 2,5, 5, 10 mM) durante 24 h ou 48 h, a proliferação celular foi detectada por ensaio de MTS. Média + DP (n = 3). *

P Art 0,01, **

P Art 0,05, em comparação com o controle. (C) LC induz a paragem do ciclo celular na fase Go /G1. As células HepG2 foram tratadas com diferentes doses de LC durante 24 h, do ciclo celular foram detectados por citometria de fluxo. Os resultados representativos foram mostrados. (D, e) ligeiramente LC induz a morte celular. As células HepG2 foram expostos a diferentes doses de LC durante 24 h e a apoptose celular foi detectada por citometria de fluxo. Resumo dos dados foram representados em (d) e as imagens de fluxo representive foram mostrados em (e). ** P 0,05, versus controle. (F) LC não afecta dramaticamente a viabilidade celular de timócitos. timócitos de ratinho foram tratadas com várias doses de LC (2,5, 5, 10 mM) durante 24 horas, a viabilidade celular foi detectada por ensaio de número e contagem de células foi de MTS.

, em seguida, investigou os efeitos dos LC sobre a proliferação celular por ensaio de MTS. Verificou-se que a dose-dependente LC diminuiu a viabilidade celular HepG2 (Fig. 2

b

), associada com a detenção do ciclo celular na fase G0 /G1 (Fig. 2

C

) e baixos níveis de morte celular (Fig. 2,

d

e

e

). Estes resultados implicaram que a LC predominantemente induzida inibição da proliferação celular, mas ligeiramente induzida morte celular em células cancerosas. Finalmente, em timócitos de ratinho normais, LC teve pouco efeito sobre a viabilidade de timócitos e de células dentro de 24 horas de tratamento (Fig. 2

f

). Estes resultados confirmam que LC induzido selectivamente citotoxicidade das células de câncer em

vitro

e

in vivo

.

tratamento LC induz a expressão de p21

cip1 gene, mRNA e proteína em células cancerosas

a seguir, determinou o mecanismo molecular de como LC poderia inibir seletivamente o crescimento do tumor. Para fazer isso, o perfil de expressão do gene foi investigada em células HepG2 após três doses de tratamento LC (2,5, 5, e 10 mM) durante 24 h. Todos os genes supra-regulados e regulados negativamente (vezes de aumento, pelo menos, dois ou diminuição em todas as três doses) após o tratamento LC foram resumidos (dados não mostrados). Entre os genes regulados positivamente, p21

cip1 gene, mas não p27

gene KIP1, dois genes importantes associados com a regulação do ciclo celular, verificou-se ser altamente e dependente da dose, expresso (Fig. 3

a

). Os efeitos do tratamento LC sobre p21

cip1 e p27

KIP1 níveis de mRNA foram próxima determinada por PCR em tempo real. As células HepG2 foram cultivadas com ou sem LC (2,5, 5, 10 mM) durante quer 12 h ou 24 h, o RNA foi preparado a partir das células. Após o tratamento com LC, o p21

cip1 nível de mRNA dose-dependente aumentou tanto em 12 h e 24 pontos h tempo, e p21

cip1 nível de mRNA é relativamente mais elevada após o tratamento 12 h de 24 horas de tratamento, enquanto p27

mRNA KIP1 não mostrou muita mudança nestes dois pontos de tempo (Fig. 3

b

). Para determinar os níveis de proteína de p21

cip1 e p27

KIP1, ensaio de Western blot foi realizada nas células HepG2 tratadas. Os resultados mostraram que, após tratamento com várias doses de LC durante 48 h, p21

KIP1 níveis de proteína aumentou de uma forma dependente da dose em linhas celulares de cancro da HepG2 (Fig. 3

C

,

esquerdo

). ESTUDO ADICIONAL dinâmico em células HepG2 mostraram que após o tratamento com LC (5 mM) durante 12, 24, 36, e 48 h, p21

cip1 tempo-dependente aumentou (Fig. 3

C

,

meio

). Em células SMMC7721 tratamento LC também aumentou a expressão da proteína p21 de um modo dependente da dose semelhante ao das células HepG2 (Fig. 3

C

,

direita). Inesperadamente, a proteína P27 aumentou em ambos os modos da dose e dependente do tempo após o tratamento LC (Fig. 3

C

), apesar de p27

KIP1 nível de ARNm é estável, o que sugere que a LC pode inibir a degradação de p27 proteína. Para investigar adicionalmente o efeito de LC sobre os efeitos a jusante de p21

cip1 e p27

KIP1, foram detectados níveis de não fosforilada e fosforilada Rb Rb (Rb-Phos). Verificou-se que o tratamento de LC diminuiu ligeiramente proteína Rb mas diminuiu dramaticamente proteína Fos-Rb (Fig. 3

d

). Estes resultados demonstraram que LC induzida seletivamente p21

cip1 expressão.

(a) LC induz p21

cip1 expressão do gene, mas não p27 e GAPDH. As células HepG2 foram tratadas com LC (2.5, 5.0, 10 mM) durante 24 h; As células foram coletadas para análise genética perfil de expressão. No gene chip, há 2 sondas para p21

cip1 e 1 sonda para p27

KIP1. Todos os dobra aumentos de p21

cip1 e p27

KIP1 expressão do gene

contra

controle foram mostrados. (B) dose-dependente LC induz p21

cip1 expressão de mRNA, mas não p27

KIP1 em células HepG2. As células HepG2 foram incubadas com diferentes concentrações de LC (2,5, 5, 10 mM) durante quer 12 h ou 24 h; as células foram coletadas para o ensaio de ARNm de p21

cip1 e p27

KIP1 por PCR em tempo real. Dobre aumento do tratado LC

contra

controle foi mostrado. Média + DP (n = 3). *

P Art 0,01, **

P Art 0,05, em comparação com o controle. (C) LC dependente da dose e dependente do tempo induz p21

cip1 acumulação de proteínas em células de cancro HepG2. HepG2 e SMMC7721 células foram tratadas com várias doses de LC durante 48 h ou HepG2 células foram expostas a 5 mM de LC de 12, 24, 36, 48 h; proteínas p21 e p27 foram detectadas por Western Blot. dependente da dose (d) LC diminui Rb fosforilação. As células HepG2 foram tratadas com LC, durante 48 h; Rb e Rb fosforilado foram dectected por Western blot. imagens ocidentais típicos foram mostrados (esquerda) e intensidade da banda foi quantificada (direita).

tratamento de LC aumentou acetilação das histonas em células cultivadas

Com base na teoria de Warburg, a hipótese de que suplemento de LC em células cancerosas iria perturbar acetilação de proteínas. Relatórios anteriores demonstraram que a acetilação das histonas por inibidores de HDAC induzidas seletivamente p21

cip1 expressão, mas não p27

KIP1 [14], [15]. Nossos resultados demonstraram que a LC induzida seletivamente p21

cip1 expressão, mas não p27

KIP1 (Fig. 2). Por conseguinte, foram investigados os efeitos de LC sobre acetilação de histonas e a acumulação de proteínas acetilada-lisina em células cultivadas. HepG2, SMMC-7721 células cancerosas e timócitos de ratinho foram tratados com LC. Como mostrado na Fig. 4,

a

e

b

, LC aumentou acetilação da histona H3 e H4 em uma dose e forma dependente do tempo em células cancerosas HepG2. LC também poderia induzir a acumulação de proteínas acetilado-lisina, tanto SMMC-7721 células cancerosas HepG2 e (Fig. 4

c

). Na cultura de timócitos primários, dependente da dose, LC aumentou a acetilação de histona semelhante a em células de cancro (Fig. 4

d

). Estes resultados sugerem que o tratamento de LC aumentou acetilação de proteínas (histonas) em células em cultura.

(a) LC dependente da dose, induz a acumulação de histonas acetiladas. As células HepG2 foram expostos a LC (1,25, 2,5, 5,0 mM) durante 48 h, histonas acetiladas H3 e H4 foram detectadas por Western Blot. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (B) CL forma dependente do tempo induzem a acumulação de histonas acetiladas. As células HepG2 foram tratadas com LC (5 mM) para diferentes pontos de tempo (12 h, 24 h, 36 h, 48 h) e histonas acetiladas foram detectadas. (C) Tratamento LC aumenta a acumulação de proteínas acetilado-lisina em HepG2 humana e células cancerosas SMMC-7721. HepG2 e células humanos SMMC-7721 foram tratadas com LC (10 mM) durante 12 h, e, em seguida, as células foram recolhidas por transferência de Western para detectar proteínas acetilado com anticorpo lisina acetilada. (D) LC dose depentently aumenta a acumulação de histonas acetiladas em timócitos de ratinho. timócitos de ratinho foram tratados com CL durante 24 h, a acetilação de histona foi detectado por Western Blot. Buty (1 mM) foi utilizado como um controlo positivo.

LC inibe diretamente as atividades de HDAC

in vitro Comprar e em células cultivadas

Desde LC induz acetilação das histonas, Em seguida, investigou se LC poderia afetar diretamente as atividades de HDAC. Um modelo de encaixe computacional foi estabelecida pela primeira vez. A estrutura cristalina de uma proteína de HDAC semelhante a partir da bactéria hiperterm�ila

Aquifex aeolicus

com o inibidor de HDAC TSA tenha sido relatada [16]. A estrutura mostra a posição do átomo de zinco essencial que está envolvido na catálise de classe I /II de HDAC. A estrutura química da LC e o modelo de ancoragem do complexo (L-carnitina e de HDAC) foram mostrados na Fig. 5,

a

e

b

, e sua interação CDOCKER Energia e Encadernação Energia foram -29,01 e -85,79 kcal /mol, respectivamente. FIG. 5

b

mostra que um átomo de oxigénio do anião carboxilo e o átomo de oxigénio do hidroxilo interacções de coordenação de formulário com zinco de iões, com distâncias de 2,696 e 2,640 Å Å, respectivamente. Este modelo de interacção é diferente em comparação com o ACT ligando original com os seus dois átomos de oxigénio de anião carboxilo coordenado ao zinco iónica. O ânion carboxilo formada uma ligação de hidrogênio fraca com Gly310, com distância de 2.966 A, e da hidroxila formada uma ligação de hidrogênio com Tyr312, com distância de 1,839 Å. Além disso, o (CH

3)

3N

+ grupo localizado em uma porta de entrada hidrofóbico e interagiu com a superfície hidrofóbica composta das cadeias laterais de Leu21, Ile100, Phe152, Phe208 e Leu275. Além disso, o grupo formado interacções catiões π com os anéis de benzeno de Phe152 e Phe208. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.