Abstract

Fundo

Vários membros da família de proteínas dedo de zinco foram recentemente demonstrado que têm um papel na iniciação do câncer e progressão. proteína dedo de zinco 367 (

ZNF367

) é um membro da família de proteínas dedo de zinco e é expressa em tecidos eritróides embrionário ou fetal, mas está ausente em tecido adulto normal.

Metodologia /Principais Conclusões

Nós mostramos que

ZNF367

é sobre-expresso no carcinoma adrenocortical, malignas feocromocitoma /paraganglioma e câncer de tireóide em comparação com o tecido normal e tumores benignos. O uso de ambos knockdown funcional e sobre-expressão ectópica em várias linhas celulares, mostramos que

ZNF367

inibe a proliferação celular, invasão, migração e adesão a proteínas extracelulares

in vitro

e

In vivo

. gene integrado e expressão microRNA análises mostraram uma correlação inversa entre

ZNF367 Comprar e miR-195 expressão. Os ensaios de luciferase demonstrado que o miR-195 regula directamente

ZNF367

expressão e que o miR-195 regula a invasão celular. Além disso, o alfa de integrina 3 (

ITGA3

) expressão foi regulamentada pelo

ZNF367

.

Conclusões /Significado

Nossos resultados tomados em conjunto sugerem que o

ZNF367

regula a progressão do câncer

Citation:. Jain M, Zhang L, Boufraqech M, Liu-Chittenden Y, Bussey K, Demeure MJ, et al. (2014)

ZNF367

Inibe o cancro progressão e é alvo de miR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10.1371 /journal.pone.0101423

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de fevereiro de 2014; Aceito: 06 de junho de 2014; Publicação: 21 de julho de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de investigação intramural do Centro de Pesquisa do Câncer, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Alguns dos co-autores são empregados por uma empresa comercial -SAIC Frederick INC, não há conflito de interesses. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O nosso conhecimento dos eventos biológicos que inibem ou promovem a metástase de cancros endócrinos localmente e locais distantes é limitado [1]. Compreensão dos eventos moleculares envolvidos na progressão do câncer tem implicações importantes para a identificação de alvos para o benefício terapêutico. Genomic, genética, e abordagens epigenética têm sido utilizados para identificar as alterações nos genes /vias, factores de transcrição, ou assinaturas de gene através da comparação normal, tumores primários, e /ou metástase. No entanto, estas análises não têm muitas vezes uma distinção entre promotores, inibidores, ou marcadores de passageiros na iniciação e progressão do câncer, e raramente definir um mecanismo específico para a expressão do gene desregulado.

cancros endócrinos são um grupo diverso de doenças malignas que apresentam o espectro completo de comportamento biológico dos tumores malignos: o crescimento indolentes para rapidamente cânceres progressivos com a sobrevivência pobre. Assim, os cancros endócrinos representam um excelente modelo para o estudo dos factores moleculares que influenciam a iniciação e progressão do câncer. Identificação de alterações genéticas comuns para estes tipos de tumor endócrino diversamente comportando tem mostrado desempenhar um papel importante em muitos tipos de cancros humanos. Por exemplo,

BRAF

mutações são altamente prevalentes na câncer de tireóide e outros tipos de câncer, e estão associados com doença mais agressiva no cancro da tiróide [2], [3].

SDHB

mutações foram inicialmente identificados em paraganglioma familiar, mas mais tarde foram encontrados para ser prevalente em cancros nos rins e tumores estromais gastrointestinais e tumores hipofisários recentemente [2], [4], [5]. Assim, descobrindo as mudanças moleculares associados com a iniciação e /ou progressão do câncer endócrino é susceptível de desempenhar um papel importante num grupo de doenças humanas.

Neste estudo, determinou-se o mecanismo de regulação e função expressão gênica de

ZNF367

em uma variedade de cânceres endócrinos (câncer de tireóide papilar, carcinoma adrenocortical, feocromocitoma /paraganglioma).

ZNF367

(também conhecido como

ZFF29

e

CDC14B

) é um membro da família de proteínas dedo de zinco, com um motivo único dedo Cys2His2 zinco, é expresso em embrionária ou eritróide fetal de tecidos, e não existe nos outros tecidos adultos normais [6], [7]. Recentemente, várias proteínas de dedo de zinco foram encontrados para ser desregulado no cancro, para funcionar como supressores de tumor /promotores, e para fazer com que a resistência à quimioterapia [8] – [10]. No entanto, o papel de

ZNF367

no cancro não foi investigado. Aqui, nós relatamos que

ZNF367

é abundante em uma variedade de cânceres endócrinos e que inibe a

in vitro

e

in vivo

crescimento, invasão celular, migração e adesão . Além disso,

ZNF367

sobre-expressão está associado com a perda de miR-195 expressão, que tem como alvo directamente

ZNF367

. Por último,

ITGA3

é diminuído com

ZNF367

superexpressão, estabelecendo um miR-195-

ZNF367 Restaurant –

ITGA3

eixo que funciona para inibir a progressão do câncer.

Métodos

amostras de tecidos e estudos animais

As amostras de tecidos foram adquiridos em um protocolo clínico Institutional Review Board-aprovado após obtenção do consentimento informado por escrito (identificador ClinicalTrials.gov: NCT01005654) . As amostras de tecido foram recolhidas no momento da cirurgia, e que foram imediatamente congeladas rapidamente e guardadas a -80 ° C. Cento e cinco adrenocortical humano (19 córtex adrenal normal, 79 adenomas corticais, 7 carcinomas adrenocorticais), 47 tecido tireoidiano (8 normal, 39 papilar cancro da tiróide), e 68 (19 medula adrenal normais, 28 benignos, 21 maligna paraganglioma) amostras de feocromocitoma /tecidos foram utilizados neste estudo. Todos diagnóstico foi confirmado por um patologista endócrino, e amostras do tumor foram confirmados para conter ≥ 80% de células tumorais /núcleos. O diagnóstico de carcinoma adrenocortical e maligna feocromocitoma /paraganglioma baseou-se na presença de invasão local bruto e /ou metástase distante e uma pontuação de Weiss 3 para o carcinoma adrenocortical. córtex adrenal normal e medula foram colhidas de dadores de órgãos saudáveis, utilizando microdissecção de captura de laser sob um protocolo Institutional Review Board-aprovado. Foram utilizados dois conjuntos de dados disponíveis publicamente de análise de expressão gênica em todo o genoma em amostras de tumor adrenocortical para avaliar

ZNF367

expressão de mRNA (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 e https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).

o Comitê animal Care e Use Instituto Nacional do Câncer aprovou os protocolos de cuidados com os animais e manipulação no presente estude. Qualquer rato experimentando sinais neurológicos significativamente anormais, hemorragias a partir de qualquer orifício, mobilidade reduzida, perda de peso rápida, debilitar diarreia, pêlos arrepiados, postura arqueada, respiração difícil, letargia, decúbito persistente, icterícia, anemia, trauma auto-induzido, torna-se moribundo ou caso contrário, torna-se incapaz de obter comida ou água, ou com um tumor de 2 cm ou mais de diâmetro foi imediatamente sacrificados por CO

2 câmara.

linhas de células, cultura de células, reagentes, siRNA, e miR- 195 transfecção

A linha de células de carcinoma adrenocortical SW13 (ATCC, Rockville, MD) foi crescido e mantidas em meio DMEM suplementado com 1% de selénio insulina transferrina (STI; BD Biosciences, San Jose, CA) e 2,5% Nu -Serum I (BD Biosciences) numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. A linha celular de carcinoma adrenocortical BD140A foi gentilmente cedido pelo Dr. Kimberly Bussey (TGen, Pheonix, Arizona) e foi cultivada em meio RPMI suplementado com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de Penicilina-Estreptomicina, e 1 % de L-glutamato. O cancro humano papilar da tiróide (CPT-1) A linha celular foi mantida em DMEM suplementado com FBS, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml), fungizona (250 ng /ml), TSH (10 UI /L ), e insulina (10 ug /ml). células de rim embrionário humano (células HEK293) foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de Pen-Strep (Gibco, Grand Island, NY), e 1% de L-glutamato (Gibco). Todas as linhas celulares foram autenticado por curto-repetição em tandem de perfis em 14 de Outubro, 2012.

ZNF367 siRNAs (s46962, s46963) e siRNAs de controlo negativo (AM4613) foram utilizados a uma concentração final de 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, CA). RNAiMAX Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado para transfecção de células de ARNsi. Maduro miARN precursor, pré-miR-195, e a sequência aleatória de controlo pré-miR-negativa (Applied Biosystems) a 5 nM foram transfectados em células SW13 RNAiMAX utilizando Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para

ZNF367

sobreexpressão em células HEK293, as células (8 × 10

5, em cada um de 6 poços) foram transfectadas com um

ZNF367

ADNc ou construir um vector vazio (OriGene, Rockville, MD ) utilizando o reagente de transfeco Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

a imuno-histoquímica

fixadas em formalina e secções de tecido embebidas em parafina foram de-parafinado e, em seguida, re-hidratadas utilizando xileno e etanol. A recuperação de antígenos foi concluída utilizando uma mistura 10% de tampão de citrato pH 6.0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) numa panela de pressão a 120 ° C durante 10 minutos. As secções de tecido foram incubadas com peróxido de hidrogénio a 6% para extinguir a actividade da peroxidase endógena por 30 minutos (Dako, Carpinteria, CA), seguido de incubação com soro, durante uma hora (Dako, Carpinteria, CA). O anticorpo primário policlonal de coelho anti-ZNF367 (Sigma, St. Louis, MO; HPA015785) a 5 ug /ml de diluição foi usada durante a noite a 4 ° C. anticorpo secundário anti-coelho foi usado (anti-coelho Dako Envision, Carpinteria, CA) durante 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram desenvolvidas utilizando 3,3′-diaminobenzidina como o cromogénio DAB (Dako, Carpinteria, CA), e foram contrastadas com hematoxilina. As secções foram desidratadas e montadas com meio de montagem vectamount (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A marcação de ZNF367 foi avaliada por microscopia de luz (Nikon, Tokyo, Japan), e as imagens foram digitalizadas com ampliação de 20x.

preparação de RNA, transcrição reversa e quantitativa em tempo real RNA PCR

foi isolado utilizando o reagente TRIzol, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). O ARN total (200-500 ng) foi sujeitos a transcrição reversa usando um kit de ADNc de alta capacidade da transcrição reversa e o ADNc foi amplificado de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os iniciadores de PCR e sondas para

ZNF367

(Hs00400665_m1),

ITGA3

(Hs01076873_m1), e

GAPDH

(Hs_99999905_m1) foram obtidos de Applied Biosystems.

Western blot

Os lisados ​​foram preparados com 1% de SDS, mais 10 mM de Tris [pH 7,5] tampão, e por Western blot foi realizada em gel de SDS-PAGE a 10%. Os anticorpos policlonais de coelho primários, anti-ZNF367 (HPA015785; Sigma, MO) e anti-ITGA3 (Sigma; SAB1100194) foram utilizados a 5 ug /mL e 2 ng /ml, respectivamente, e anti-GAPDH (SC-32233; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) foi utilizado a 1:1,000 diluição. anticorpo anti-coelho secundário foi utilizado a 1:5,000 diluição (Cell Signaling, Danvers, MA).

proliferação celular

As células foram semeadas a uma concentração de 2000 células numa placa de 96 poços em seis repetições. O kit de ensaio de CyQUANT ™ (Invitrogen) foi utilizado para avaliar o número de células, de acordo com as instruções do fabricante.

clonogénicas ensaio

células HEK293 (8 × 10

5) foram transfectadas com o vector vazio ou

ZNF367

construir. Após 24 horas, as células foram tripsinizadas, ressuspensas em meios de comunicação, e contadas. As células foram re-semeadas em placas de 6 cavidades a 250, 500, e 1.000 células. Após 10 dias, o meio foi removido dos poços e lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo. As colónias foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos e coradas com 2 ml de violeta de cristal durante 60 minutos sobre uma plataforma oscilante. As placas foram lavadas três vezes com PBS e secas ao ar, e as colónias foram fotografados em FluorChem Imager (San José, CA).

invasão celular e migração ensaio

invasão celular e migração eram avaliada utilizando o BD BioCoat Matrigel Invasão Secção (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante. 1 × 10

5 as células foram semeadas sobre as inserções (8 mícrons de tamanho de poro de membranas de policarbonato) com e sem uma camada fina de Matrigel porão de revestimento de membrana de matriz (BD Biosciences). As pastilhas foram colocadas em poços de fundo, com meio de cultura contendo soro a 10% como um quimioatractor. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C. As células que invadiram a matriz Matrigel ou que migraram através dos poros sem matriz Matrigel à superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ) e contados sob um microscópio de luz em quatro campos separados, com Imagem software J (NIH, Bethesda, MD).

a adesão celular ensaio

células SW13 foram transfectadas com

ZNF367

siRNA e no controlo negativo. Após 120 horas de transfecção, as células foram tripsinizadas, e 1 × 10

5 células foram plaqueadas numa placa de 48 poços contendo cinco moléculas de adesão (f ibronectina, colagénio I, colagénio IV, laminina I, e fibrinogênio) e incubou-se a 37 ° C durante 90 minutos de acordo com as instruções do fabricante (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Os poços foram lavados duas vezes com PBS, e foram adicionados 200 ul da solução de coloração e incubou-se durante 10 minutos. Os poços foram lavados duas vezes com água desionizada. Os poços foram secas ao ar, e adicionou-se 200 ul da solução de extracção, e incubou-se durante 10 minutos. Um total de 150 uL foram transferidos de cada amostra extraída a uma placa de 96 poços, e a absorvância medida a 560 nm num leitor de microplacas SpectraMax M5E (Sunnyvale, CA).

Genome-wide expressão de ARNm de microarray

células SW13 foram transfectadas com

ZNF367

siRNA eo controle negativo em triplicata. A seguir à transfecção, o ARN total foi extraído utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante. cDNA de transcrição reversa, a síntese, a amplificação, fragmentação e rotulagem do terminal de 150 ng de RNA total foram realizadas utilizando o GeneChip WT Sense alvo Labeling e reagentes de controlo (Affymetrix, Santa Clara, CA). Um total de 25 ng /mL de cDNA foi hibridado com o gene humano Affymetrix GeneChip 1,0 ST matriz. análise de caminho foi realizada utilizando os recursos de bioinformática Davi (https://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).

In silico

identificação de microRNA alvo ZNF367

bancos de dados MiR (target Scan (https://www.targetscan.org) e mirDB (https://mirdb.org/miRDB/) foram utilizados para identificar microRNA que podem direcionar

ZNF367

. microRNAs candidatos Prevê-alvo

ZNF367

foram então analisadas para determinar se eles foram diferencialmente expressos em carcioma adrenocortical e câncer de tireóide papilar.

luciferase ensaio

de tipo selvagem

ZNF367

3 ‘UTR foi clonado no construto GoClone (Painéis Genomics, Menlo Park, CA). a construção de mutantes de

ZNF367

3’UTR foi obtida através da introdução da mutação nos primeiros três nucleótidos da região da semente (143-150, GCTGCTA – CGAGCTA). para miR-195 do tipo selvagem

ZNF367

3’UTR ou mutante

ZNF367

3’UTR eo vetor 3’UTR vazio com pré miR-195 ou pré-NC foram co-transfectados em células SW13 (Painéis Genómica). O método de normalização para a eficiência de transfecção em ensaio de repórter de luciferase foi de acordo com a recomendação de comutadores Genomics (Menlo Park, CA) com o vector vazio usado como controle positivo para a transfecção. O vector vazio 3’UTR contém um promotor constitutivo (encontrada em todas as construções de UTR) e o gene da luciferase (RenSP). Esta construção serviu como um controlo positivo para a transfecção. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços e co-transfectadas com 5 nM de miR-195 ou o controlo negativo (Applied Biosystems), 0,12 jig do vector (Painéis Genomics), e 0,75 ul de Lipofectamina (Invitrogen). A luminescência foi lida após 24 horas com o sistema de ensaio de interruptor de luz, usando um leitor de microplacas SpectraMax M5E.

In vivo

xenotransplante ensaio

camundongos fêmeas atímicos (cinco a seis semanas de idade, peso corporal: 20-22 g) foram obtidos do Laboratório Nacional de Frederick de instalações para animais de pesquisa do Câncer (Frederick, MD). Depois de 48 horas de transfecção com

ZNF367

siRNA e o controlo negativo, três milhões de células foram re-suspensas em 100 ul de DMEM e Matrigel (01:01), e eles foram injectados no flanco de ratinhos nus atimicos .

análise estatística

contínua de dados é apresentado como média e desvio ± padrão (SD) ou erro padrão da média (SEM). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar os dados não paramétrico de três ou mais grupos. O teste t de Student ou teste de Mann-Whitney foi usado para comparar as diferenças entre dois grupos para as variáveis ​​paramétricos e não paramétricos, respectivamente. O teste de correlação de Pearson foi utilizado para identificar as correlações entre os dois grupos. A

p

-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística foi concluída usando Graph Pad Prism 5.0 software estatístico.

Resultados

ZNF367

é overexpressed em câncer

ZNF367 O que É sobre-expressa no carcinoma adrenocortical, cancro da tiróide papilar, feocromocitoma maligno e /paraganglioma, em comparação com amostras benignas e tecidos normais para cada tipo de tumor (p 0,05; Figura 1). a expressão da proteína ZNF367 estava presente no núcleo e no citoplasma. Houve forte coloração ZNF367 no núcleo do que no citoplasma em cada amostra de câncer (câncer adrenocortical, câncer de tireóide papilar e maligna feocromocitoma /paraganglioma). Para confirmar a expressão elevada de

ZNF367

no carcinoma adrenocortical em um conjunto de amostra maior, analisamos a expressão profiling dados de conjuntos de dados publicamente disponíveis depositados em omnibus expressão do gene. Em dois conjuntos de dados de expressão de genes do genoma independentes,

ZNF367

foi sobre-expressa no carcinoma adrenocortical em comparação com adenoma adrenal cortical e amostras de tecidos normais (p 0,001; Figura S1). Estes achados sugerem que

ZNF367

é abundante em uma variedade de cânceres, com resultados consistentes em diferentes análises e plataformas genômicas utilizadas.

(A e B) O nível de expressão no córtex adrenal normal, benigno adenomas adrenocorticais e carcinomas adrenocorticais; medula adrenal normal (C e D), amostras de tecido feocromocitoma /paraganglioma benignos e malignos; e (E e F) tireóide normal e amostras de tecido de câncer de tireóide papilar. O eixo Y em cada gráfico representa a porcentagem de expressão de mRNA usando o 2

∧-ΔCt método * 100% ± SEM. * P 0,05, ** p 0,001, *** p 0,001 (teste de Kruskal-Wallis). imagens de imunohistoquímica representativos são a partir de amostras normais, benignas e malignas do tumor com ampliação de 20x.

ZNF367

inibe a proliferação celular, invasão, migração e adesão

Devido

ZNF367

é overexpressed no cancro endócrino, foi investigado o seu efeito sobre a proliferação celular, invasão e migração, eventos que são necessários para a progressão do câncer.

ZNF367

foi expressa no carcinoma adrenocortical (SW13, BD140A), o câncer de tireóide papilar (TPC-1) e linhas celulares HEK293. Assim, foi utilizada tanto

ZNF367

knockdown e superexpressão abordagens para determinar o efeito de

ZNF367

em celular proliferação, invasão e migração. SiRNA knockdown alcançado até 80% knockdown de ARNm ZNF367 e expressão da proteína em relação ao controle negativo siRNA (Figura S2).

ZNF367

knockdown em células SW13, aumento da proliferação celular (30-40% )

in vitro Comprar e (3,5 vezes)

in vivo

(p 0,05; Figura 2).

ZNF367

knockdown também aumentou invasão celular e migração (p 0,05; Figura 3A). Dado o efeito dramático da

ZNF367

na invasão celular e migração em células SW13, o efeito de

ZNF367

knockdown na invasão celular e migração também foi avaliada no BD140A, TPC-1 e células HEK293 linhas. O knockdown tinha um efeito semelhante sobre a invasão celular e migração de BD140A, TPC-1, e as linhas celulares HEK293 (p 0,05; Figura 3, B-D). O efeito da

ZNF367

no crescimento celular, invasão e migração também foi confirmada pela superexpressão

ZNF367

em células HEK293.

ZNF367

superexpressão diminuiu invasão celular, migração e formação de colônias em comparação com o controlo de vector vazio (Figura 3E-G).

(A)

ZNF367

aumentos knockdown proliferação celular . O eixo Y representa as unidades fluorescentes relativas (RFU), e o eixo X indica dias pós-transfecção. * P 0,05 relativamente ao controlo negativo. As barras de erro representam SD ±. (B)

ZNF367

knockdown aumenta o crescimento tumoral in vivo. células SW13 foram transfectadas com o controlo negativo (n = 4) e siRNA (n = 4) para a direita e esquerda de cada ratinho. Depois de 48 horas de transfecção, 3 × 10

6 células foram injectadas em ratinhos nus atímicos, e o crescimento do tumor foi medido semanalmente. O eixo dos Y representa o volume do tumor e o eixo X os semanas de medição do tumor após injecção flanco. * P 0,05 e barras de erro representam SD ±

ZNF367

superexpressão diminui invasão celular e migração.. (A) SW13, (B) BD104A, (C) TPC-1, e as linhas celulares HEK293 (D). Após a transfecção, as células foram plaqueadas no interior de uma câmara de Boyden de 48 horas. As células foram coradas e contadas em campos 4. O painel esquerdo mostra uma imagem representativa (12,5X) a partir do knockdown siRNA e grupos de controlo negativo. O painel da direita indica que a medição quantitativa de células invadidas e migraram em knockdown e no controlo negativo. * P 0,05 e as barras de erro indicam ± DP.

ZNF367

superexpressão diminui o número de colónias, invasão celular, e migração em células HEK293. (E) de Western blot de

ZNF367

superexpressão em células HEK293 e SW13 (vazio vetor, XL4). GAPDH foi usada como um controlo de carga. (F) imagem clonogênica Representante para células com expressão ectópica

ZNF367

e seu controle correspondente (vazio vetor, XL4). (G) invasão celular e migração diminuiu com o

ZNF367

superexpressão em células HEK293. A medição quantitativa de células invadidas e migraram por grupo (HEK293-HEK293 vazio vector ou

ZNF367

) é representado no gráfico de barras no painel da direita. (H) A fixação da proteína extracelular de células SW13 com

ZNF367

knockdown. As células foram transfectadas com

ZNF367

siRNA controlo negativo e siRNA, e foram plaqueadas em placas de adesão e incubou-se durante 90 minutos. O eixo Y representa a absorvância a 540 nm de células aderentes para cada proteína. As barras de erro representam ± SEM. * P 0,05, *** p . 0.001

Porque invasão celular e migração requer a adesão celular à matriz extracelular, que avaliou o efeito de

ZNF367

knockdown na adesão celular para proteínas da matriz extracelular. Encontramos aumento da adesão celular, com

ZNF367

knockdown, a laminina I (-dois-três vezes alto) e fibrinogênio (3-6 vezes alta) (p 0,05; Figura 3H). Estas proteínas são conhecidas por funcionar para aumentar a adesão celular para a membrana basal ou da matriz extracelular através de receptores de integrina, que permitem a adesão de células cancerosas e a migração.

ZNF367

regula a expressão ITGA3

Nós estávamos interessados ​​em identificar o gene (s) e via (s) regulamentada pelo

ZNF367

, dado o efeito de

ZNF367

na invasão celular, migração e aderência, e porque é um factor de transcrição previsto para regular a expressão do gene. Usando a análise de expressão de mRNA do genoma nas células transfectadas com

ZNF367 Comprar e siRNAs de controlo negativo, foram identificados dois genes candidatos (

ITGA3,

serpin inibidor da peptidase, clade B (ovalbumina), membro 9 [ ,,,0],

SERPINB9

]), possivelmente regulada pela

ZNF367

baseado na aplicação de vários critérios de filtro (FDR 0,25, dobre-change 1,5, comum a todos knockdown siRNA, e correlação forte na expressão em tumores humanos amostras) (Figura S3).

ITGA3

foi escolhido como um candidato promissor para um estudo mais aprofundado, pois desempenha um papel significativo na adesão celular e invasão e foi validado para ser regulada até 2,5 vezes com

ZNF367

knockdown (p 0,05; Figura 4A) [11]. Além disso, a expressão de ARNm ITGA3 foi inversamente correlacionada com a expressão de mRNA em amostras humanas ZNF367 adrenocorticais tumorais (r = – 0,37; p = 0,015; Figura 4B). a expressão da proteína ITGA3 também foi aumentado com siRNA knockdown de

ZNF367

(Figura 4C). Por outro lado, a sobre-expressão de

ZNF367

reduzida

ITGA3

expressão em comparação com o vector vazio (Figura 4D-E). Estes dados sugerem que

ZNF367

regula celular adesão, invasão e migração através do seu efeito, pelo menos em parte, em

ITGA3

expressão.

(A)

ZNF367

regula positivamente knockdown

expressão ITGA3

em células SW13. As barras de erro representam ± SEM. (B) A correlação entre o

ITGA3

e

ZNF367

expressão de mRNA em amostras de tumor adrenocortical. eixos X e Y representam registrar valores de 2-transformadas. (C) quantificação de Western blot da expressão da proteína ITGA3 com

ZNF367

knockdown. (D-E) ITGA3 expressão com ZNF367 superexpressão. As barras de erro representam ± SEM.

miR-195 visa diretamente

ZNF367

e regula a invasão celular

Para entender o mecanismo pelo qual

ZNF367

expressão é desregulada no cancro, postulamos que microRNAs podem ser responsáveis ​​pela

ZNF367

superexpressão. Para identificar microRNAs candidatos que podem alvo

ZNF367

, nós questionaram a digitalização Target e bancos de dados miRDB para microRNAs previsto para atingir

ZNF367

. Um total de 3 dos 14 microRNAs, previsto para atingir

ZNF367,

foram encontrados para ser diferencialmente expressos em carcinoma adrenocortical (Tabela S1). No entanto, apenas miR-195 foi significativamente inversamente correlacionada com

ZNF367

expressão. (R = -0,44; Figura 5A)

(A) A correlação entre o miR-195 e

ZNF367

expressão em um tumor adrenocortical. O coeficiente de correlação de Pearson r é indicado pelo seu valor de p. (B) a sobre-expressão ectópica de pré-miR-195 resulta em downregulation de

ZNF367

.

ZNF367

expressão de ARNm em células SW13 transfectadas com pré-miR-195 e o controlo de pré-negativo a 5 nM para a 24 horas (apresentada como uma dobra-mudança em relação ao controlo pré-negativo). As barras de erro representam ± SEM. O painel da direita mostra o Western blot da proteína a partir de células SW13 ZNF367 transfectadas com pré-miR-195 e o controlo negativo. (C) Pré-miR-195 sobre-expressão aumenta na invasão de células SW13 em comparação com o controlo negativo. O painel da direita mostra o número médio de células invadidas no eixo Y. (D)

ITGA3

expressão de ARNm é aumentada após transfecção de miR-195 e o controlo negativo nas células SW13. As barras de erro representam ± SEM. (E) O local de ligação de miR-195

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3’UTR, juntamente com o mutante de construção na região de semente previsto. No painel da direita, o ensaio de luciferase demonstra diminuição da luminescência em células SW13 co-transfectadas com miR-195 e do controlo negativo a 5 nM, com o vector, do tipo selvagem vazio

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3’UTR, ou MUT –

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vector 3’UTR (mutado em os primeiros três nucleótidos da sequência de semente). A luminescência foi lido após 24 horas de transfecção. O eixo Y representa a proporção de

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3’UTR para o vector vazio. * Valor de p 0,05 comparado com o controlo negativo. As barras de erro representam ± SEM.

Para investigar se miR-195 regula

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expressão, as células foram transfectadas com pré-miR-195 e controle pré-negativa (pré-NC) , que mostraram redução

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expressão de mRNA e proteína (Figura 5B). Além disso, a sobre-expressão de miR-195 apresentaram um aumento

ITGA3

expressão de ARNm (duas vezes) e invasão celular em comparação com o controlo negativo (p 0,05; Figura 5, C-D). Para confirmar que

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é um alvo direto de miR-195, foram realizados ensaios de luciferase para determinar se miR-195 liga-se à 3’UTR do

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mRNA. Observou-se a actividade de luciferase significativa reduzido com miR-195 sobre-expressão no tipo selvagem 3’UTR em comparação com controlo negativo e mutado

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3’UTR células transfectadas (P 0,01; Figura 5E). Assim, estas observações sugerem que miR-195 regula negativamente a expressão de

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diretamente pela segmentação sua 3’UTR, resultando em diminuição da invasão celular, o efeito mais dramático da

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que observamos em nossos estudos funcionais.

Discussão

para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para caracterizar a função de

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em cancros. Descobrimos que

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foi sobre-expresso em uma variedade de cânceres do sistema endócrino (carcinoma adrenocortical, o câncer de tireóide papilar, malignas feocromocitoma /paraganglioma) em comparação com amostras de tecidos benignos e ou normais. Funcional

in vitro

e

In vivo

knockdown e superexpressão estudos demonstraram que o

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regula celular proliferação, invasão, migração e aderência. Utilizou-se análise de expressão gênica em todo o genoma para identificar genes candidatos que são reguladas pela

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, e identificamos

ITAG3

como um gene que provavelmente medeia o efeito de

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sobre a adesão celular, invasão, migração e. Além disso, a análise in silico de análise de expressão de genes humanos amostra de tumor do genoma mostrou uma relação inversa entre ZNF367

e

expressão

ITAG3

. Por último, foi demonstrado que desregulado

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expressão foi associada com a perda de miR-195 de expressão em amostras de tumores e de que esta tem como alvo directamente microARN

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e regula a invasão celular, proporcionando um entendimento do mecanismo para a expressão

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desregulado. Com base nestes resultados, propomos que há um miR-195-

ZNF367-ITAG3

eixo que regula a progressão do câncer endócrino.

Este é o primeiro estudo para caracterizar a expressão e função de

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no câncer.

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nocaute em ratos não mostrou alterações significativas [12].