Abstract

Objectivos

O ouriço via de sinalização desempenha um papel importante na EMT de células de câncer de pâncreas, mas os mecanismos precisos são ainda imperceptíveis. Porque S100A4 como um marcador chave EMT moleculer foi encontrado para ser regulada mediante Gli1 em células de câncer de pâncreas, enfocamos a relação entre sinais de Shh-GLI1 e genes S100 família.

Métodos

No base de dados cDNA microarray, investigamos mecanismo regulador de Gli1 a alguns membros do S100A genes da família em linhas celulares de cancro do pâncreas em primeiro lugar. Em seguida, a regulação do gene de a Gli1 S100A4 foi estudada por ensaios de biologia molecular e a Effection pró-metástase de S100A4 Gli1-dependente foi investigado in vitro. Finalmente, as expressões de Shh, Gli1, S100A4 e E-caderina em tecidos de câncer pancreático foram estudadas através de ensaios de imuno-histoquímica.

Resultados

Cinco membros da família genes S100, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 e S100A14 foram encontrados para ser reprimidos de forma importante, Gli1 knockdown. previsão potenciador Gli1 combinando com dados in vitro demonstraram que Gli1 regula principalmente membros da família S100A via elementos de actuação cis. Com efeito, os dados indicam S100A4 e genes de vimentina foram significativamente regulada positivamente por Shh /Gli1-expressão crescente e E-caderina foi reduzida significativamente, ao mesmo tempo. A migração de células PC foi aumentado significativamente de um modo dependente da dose da expressão Gli1 (P 0,05) e siS100A4 inverteu significativamente a resposta de células PC induzidas por transdução de L-Shh (P 0,01).

Conclusão

Nossos dados estabelecer uma conexão romance entre Shh-Gli1 de sinalização e regulação S100A4, o que implica que S100A4 pode ser um dos fatores-chave na EMT mediadas por Shh-Gli1 sinalização em câncer pancreático.

Citation : Xu X, Su B, C, Xie, Wei S, Zhou Y, Liu H, et al. (2014) o Sonic Hedgehog-Gli1 via de sinalização Regulamenta o epitelial mesenquimal Transição (EMT) pela mediação de um Gene New Target, S100A4, em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10.1371 /journal.pone.0096441

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de março de 2013; Aceito: 08 de abril de 2014; Publicação: 29 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do National Science Foundation Natural da China (81072005, 81172312 e 81101839). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas representa uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer nos países industrializados [1]. O mau prognóstico dessa doença é devido principalmente ao seu início de metástase sistêmica [1] – [3]. Um grande número de estudos demonstraram que a transição epitelial mesenquimal (EMT) pode ser um mecanismo de chave de células de cancro do pâncreas destacados do local do tumor primário e de espalhamento para órgãos distantes. No entanto, as vias de sinalização de iniciação EMT são ainda imperceptíveis agora em células de câncer de pâncreas. Recentemente, Hedgehog (Hh) via de sinalização tem sido demonstrado ser um importante promotor do crescimento do tumor em diversos tipos de cancro do tracto gastrointestinal [4], [5]. Como para o cancro do pâncreas, foi demonstrado que a activação aberrante da via de sinalização de Hh estava resultou de sonic hedgehog (Shh) a sobre-expressão na maioria dos casos [6] – [8]. Um grande número de estudos demonstraram que os principais mecanismos da via de sinalização de Hh em células cancerosas foram para promover o processo epitelial mesenquimal (EMT) [9] – [11]. Além disso, foi demonstrado que o bloqueio desta via significativamente inibiu a metástase de células tumorais in vivo e em modelos de xenotransplante de [12], [13].

Uma vez que os genes-alvo de Gli1 foram os principais mecanismos da via de sinalização de Hh, buscou-se compreender seus mecanismos pró-metastáticos por identificando as metas de Gli1 em células de câncer de pâncreas. Como um gene alvo pró-metastático chave de Gli1 no cancro pancreático ele deve ter as seguintes características: Em primeiro lugar, existem GLI1 elementos de actuação cis eficaz na sua sequência de gene; Em segundo lugar, a sua transcrição foi regulada positivamente pela Gli1; Em terceiro lugar, foi regulado positivamente na maior parte dos tecidos de cancro do pâncreas e do seu nível de expressão foi positivamente correlacionada com a sinalização de Hh; Em quarto lugar, a sua deve ser um factor funcional pró-chave metastático. Em estudo anterior, realizamos uma pesquisa sistemática sobre os perfis de genes alvo em cima Gli1 em linha de células de câncer de alta-metastático do pâncreas através de cDNA microarray e descobriu que 5 membros desta família de genes foram regulados positivamente por Gli1. Especialmente, o S100A4 como um marcador chave moleculer promover processo de EMT em câncer pancreático foi encontrado para ser regulada mais de 3 vezes neste estudo. Na base destes estudos, focados na relação entre sinais de Shh-GLI1 e familiares gene S100.

Neste estudo, foram analisados ​​os Gli1 aguardando sites dentro de sequências de ADN de genes S100 família com ferramentas de bioinformática e bases de dados. Além disso, buscou-se identificar novas conexões de Shh-Gli1 via de sinalização com S100 genes da família e para demonstrar a função pró-metastático do gene S100A4 mediada por sinais Shh-GLI1 em câncer pancreático.

Materiais e Métodos

culturas de células

as linhas celulares PC humanos, BxPC3, AsPC-1 e Panc-1, foram todas as linhas celulares comercial e obtivemos estas linhas celulares do Instituto de Citologia Academia chinesa de células Science.These linhas foram amplamente utilizados na pesquisa do câncer pancreático [14] – [18]. Três linhas de células foram cultivadas em todos RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 em ar.

Vectors infecção construção e células

Lentivirus vectores de transferência para o homem Gli1 shRNA ou cDNA Shh foram construídas por Genechem Co., Ltd, Shanghai, China. Este sistema inclui o pLVTHM vector lentiviral, o plasmídeo envelope pMD2G, e o plasmídeo de empacotamento PRSV-REV e pMDlg-pRRE. A Shh-lentivírus (L-Shh) continha uma sequência de codificação de 3,3 kb para o Shh e lentivírus-Gli1i (L-Gli1i) continha Gli1 pequeno ARN gancho de cabelo (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ‘) à sequência de direccionamento do shRNA quanto previamente descrito [19]. O lentivírus-controlo (G-C) que não incluem as sequências de interferência Gli1 ou sequências de cDNA Shh serviu como controlo. Finalmente construções de lentivírus foram verificados através de sequenciação de ADN para garantir a precisão. lentivírus recombinante foi produzido por transfecção transitória de células 293T de acordo com um protocolo padrão. Quando as células BxPC3, AsPC-1 e Panc-1 eram de cerca de 50% confluentes em meio RPMI-1640 contendo FCS a 2%, que foram infectadas com as construções de lentivírus a MOI 5. As células foram colhidas após 72 horas para outras experiências. Para identificar funcional L-Shh e L-Gli1i constrói, nós rotineiramente analisados ​​expressão Shh e Gli1 por qRT-PCR e western-blotting.

S100A4 Transient Knockdown

Foi utilizada uma sequência de RNAi (siS100A4 ) e uma sequência de controlo negtive (siS100A4 MIS), que mostrou knockdown eficiente da S100A4 nas células HT29 câncer de cólon humano em um relatório anterior [20]. S100A4 knockdown foi monitorizada por determinação dos seus níveis de ARNm e de proteína após 48 h após a transfecção siRNA, respectivamente. E, em seguida, as células foram usadas para ensaios de Transwell. As células foram lipofected com os siRNAs usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

extracções de ARN e ensaios de tempo real de RT-PCR

amostras de RNA total foram extraídos com o reagente de Trizol (Invitrogen ) de acordo com o protocolo do fabricante e 100 ng de ARN total foi transcrito de modo reverso num volume de 20 uL e 2 ul de ADNc utilizado para a PCR de acordo com as instruções do fabricante. (Takara Biotecnologia, Dalian, China). As sequências dos iniciadores foram vistos na tabela 1. CT (limiar de ciclo) valores foram padronizados com valores CT de GAPDH.

extracções de proteínas e ensaios de western-blotting

amostras de proteínas totais foram extraídas com tampão RIPA de acordo com o método padrão e as amostras foram normalizadas para o teor de proteína por um kit disponível comercialmente (Bio-Rad Company). Quantidades iguais de proteína foram utilizadas para ensaios de western-blotting de acordo com o protocolo padrão para Shh, Gli1, S100A4, E-caderina, VIM (vimentina) e detecção de GAPDH.

Transwell ensaios

celular invasão ensaio de 24 amostras de kits (Chemicon, Bedford, MA) foram utilizados para estudar a invasão /migração de linhas de células PC. Após a incubação de 24 horas, as contagens de migração de células PC, foram obtidos por fotografar a membrana através do microscópio. Contagens foram realizadas em 5 áreas mais altas de células com uma ampliação de alta potência (× 200). O valor médio dos campos contados foi considerada como a contagem de migração de células PC.

O formaldeído reticulação ensaios de imunoprecipitação da cromatina (XChIP)

Os ensaios XChIP foram realizados como os estudos anteriores [21]. Em resumo, a cromatina das células AsPC-1 (3 × 10

7) foi recolhido com 1 mL de tampão IP contendo cocktail inibidor da protease. Cromatina foi cortado usando um sonicador em uma caixa de gelo (6 ciclos de pulsos de 10s, de 350 W, com intervalos de 60 segundos) e reticulação foi revertido pela adição de 20 ul de NaCl 5 M durante a noite a 65 ° C. O ADN foi extraído utilizando o ensaio de fenol /clorofórmio. 20 ul de ADN foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1,5% e o restante foi utilizado como ADN ENTRADA. foi utilizado policlonal ChIP grau anticorpo de cabra Gli1 (0,1 ug /mL) (Santa Cruz Company) para imunoprecipitação, a IgG de rato (0,1 ug /mL) (Santa Cruz Company) foi adicionada como um controlo aleatório, polimerase de ARN de anticorpo II (0,1 ug /mL) como um controlo positivo e um anticorpo β-actina (0,1 ug /mL) como um controlo negativo. O iniciador da região do promotor de GAPDH (Santa Cruz Company) foi utilizado como um controlo negativo. (Tabela 2).

vectores repórter da luciferase ensaios

Os vectores repórter promotor luciferase S100A4 foram construídos por Genechem Co., Ltd, Shanghai, China. Resumidamente, um fragmento de ADNc de 1,5-kb (a partir de -766 a 734 do gene S100A4 humano) com XhoI e HindIII foi sintetizado e clonado nos locais Xho I e Hind III do vector de luciferase pGL3 de base para produzir pGL3-1.5 contendo S100A4 três locais que obriguem GLI1 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) e CTGGTGGGG (126~134)]. Nos vectores de mutagénese, GLI1 sequências potenciais locais de ligação foram substituídos, respectivamente, por GATTCTTAA sequência que não tenha locais de ligação conhecida para quaisquer factores de transcrição [22]. Os únicos aguardando site de vetores de mutagénese GLI1 incluídos pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) e CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) e CTGGTGGGG (126~134)] e pGL3-1.5 S100A4 Mut 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) e GATTCTTAA (126~134)]. Os múltiplos locais de ligação GLI1 vectores de mutagénese incluídos pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) e CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) e GATTCTTAA (126~134)] e pGL3 1,5 S100A4 Mut 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) e GATTCTTAA (126~134)]. As construções finais vetor foram verificados através de sequenciação de ADN para garantir a precisão. células AsPC-1 foram transfectadas com 5 ug de tanto o pGL3-1500 S100A4 ou as construções mutantes pGL3-1500 S100A4 e 2 ug do constructo de luciferase de Renilla (pGL4.75, Promega) como um controlo interno para a normalização, utilizando o método de reagente de Lipofectin protocolo. 48 horas após a transfecção, as células AsPC-1 foram usados ​​para os ensaios de luciferase de acordo com o protocolo do kit de repórter de luciferase duplo (Promega) e as volues foram readed usando um luminómetro. Cada experimento foi repetido pelo menos 3 vezes, cada vez em triplicado.

As amostras dos pacientes

Neste trabalho, 102 bancados tecidos de câncer embebidos em parafina de pacientes de PC diferentes (de 63 homens e 39 mulheres , com idade média de 56,7 anos, variação 44-75 anos) foram analisados ​​por imuno-histoquímica. Todos os pacientes concordaram nesta pesquisa. Todas as amostras foram obtidas a partir do hospital de Tongji University, China o décimo das pessoas e todos os pacientes assinaram um documento de consentimento, no qual eles concordaram que a excisão cirúrgica do tumor maligno seria usado em pesquisas médicas antes de suas operações. As comissões de ética das Universidades Tongji aprovou o processo de aprovação e os estudos.

ensaios de Imuno-histoquímica

Os tecidos PC embebidos em parafina foram usados ​​para identificação de Shh, Gli1, S100A4 e E-caderina. Shh anticorpo policlonal foi adquirido de R D Companhia e os outros (Gli1, S100A4 e E-caderina) eram de Sant Cruz Company. Os ensaios de imunohistoquímica foram realizadas como os estudos anteriores e os níveis de Shh, Gli1, S100A4 e genes E-caderina de expressão foram classificadas com base em orientações previamente descritos [23].

Análise Estatística

para todas as análises estatísticas, utilizou-se um pacote de software SPSS17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). As variáveis ​​contínuas foram expressas como média ± SE e um teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliação estatística. As correlações entre a expressão de Shh, Gli1, S100A4 e proteínas E-caderina e da relação entre as características clínicas dos pacientes e as cinco proteínas foram analisadas pelo teste de Spearman.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão diferencial da família de genes S100 sobre Gli1 em células ASPC-1

Para delinear a expressão genética induzida por sinais Shh-GLI1 em células de câncer de pâncreas, as células AsPC-1 foram usadas para ensaios de cDNA microarray comparando lentivírus-control vs células lentivírus-Gli1i. Ao focalizar os genes relacionados com a EMT em dados de cDNA, encontramos a relação positiva entre os sinais de Shh e S100 genes da família [21]. Em nossa tela (os sinais de expressão incluiu 23 membros do S100 genes da família, exceto para S100A17 e S100A18) 10 genes, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P e TCHH, foram expressos e 13 genes, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN e FLG não foram expressas em células AsPC-1. análise de comparação do grupo-controle lentivírus vs células do grupo lentivírus-Gli1i mostrou que S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 e S100A14 foram regulada mediante Gli1. (Figura 1A). Os dez genes, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P e TCHH, foram escolhidos para validação em tempo real por RT-PCR. Como mostrado na Figura 1B, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 e S100A14 foram encontrados para ser regulada, sem alterações significativas nas outras cinco genes. Estes dados são consistentes com a obtida a partir do cDNA microarray

A:. CDNA microarray de dados sobre a família gene S100; B: Os níveis de membros da família de genes parciais S100 por qRT-PCR de expressão diferencial. A expressão de GAPDH é como um controlo. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

Previsto obriguem locais GLI1 e genes putativos alvo GLI1 dentro S100A família de genes

Para aprofundar o estudo do mecanismo de Shh-Gli1 via de sinalização na regulação da família do gene S100, baixamos as sequências de ADN de genes S100A de gene Bank e analisadas sequências homólogas de Gli1 local aguardando (GACCACCCA) através da utilização de ferramentas de bioinformática Blastz . Os dados de bioinformática mostraram que quase todos os membros da família de genes S100A contêm muitas sequências homólogas altamente conservadas (a diferença não seja mais do que uma base) e esses sites Gli1 obriguem putativos exibiram as características do arranjo cluster. A Tabela 3 mostrou a Gli1 putativo aguardando locais dentro da região reguladora proximal contendo regiões intergênicas, regiões intragênicos, regiões untranscripted e regiões não traduzidas (não mais de 5,0 kb de distância de TSS). Os dados provavelmente conferiu um grau geral um pouco maior de evidências de que esses candidatos são, de facto, diferencialmente expressos no cenário de câncer de pâncreas, possivelmente como alvos a jusante de uma forma aberrante reativado.

O novo gene alvo e sua eficaz Gli1 obrigatório de identificação locais em AsPC-1