Abstract
Este estudo foi realizado para decifrar os papéis interdependentes de (i ) metilação dentro local de ligação E2 I e II (E2BS-I /II) e origem de replicação (nt 7862) na região de controlo longa (LCR), (ii) a expressão de oncogene viral
E7
, (iii) expressão da transcrição (
E7-E1∧E4)
que codifica a proteína do repressor E2 e (iv) a carga viral, em papilomavírus humano 16 (HPV16) câncer cervical relacionado (CaCx) patogênese. Os resultados revelaram sobre-representação (p 0,001) de metilação no nucleotídeo 58 de E2BS-I entre
E2
-intact CaCx casos, comparativamente a
E2
casos -disrupted. seqüenciamento bissulfito de LCR revelou super-representação de metilação no nucleotídeo 58 ou outras CpGs em E2BS-I /II, entre
E2
casos -intact que
E2
casos -disrupted e falta de metilação na origem de replicação no caso de ambos. A transcrição virais (
E7-E1∧E4
) que produz o repressor E2 foi analisada por APOT (amplificação de papilomavírus transcrito oncogénica) -coupled-quantitativa por RT-PCR (de
E7 e
E4
genes) para distinguir episs�ica (puro ou concomitante com integrado) de genomas virais puramente integrados com base na relação,
E7
C
T /
E4
C
T. A quantificação relativa com base no comparativo C
T (ciclo de treshold) Método revelou 75,087 dobra superior
E7
expressão de mRNA em casos episs�icas sobre casos puramente integrados. carga viral e
E2
número de cópias do gene foram negativamente correlacionada com a
E7
C
T (p = 0,007) e
E2
C
T (p 0,0001), respectivamente, cada um normalizada com
ACTB
C
T, entre únicos casos episs�icas. O
k
-means agrupamento análise considerando
E7
C
T de ensaio APOT-coupled-quantitativa-RT-PCR, em conjunto com a carga viral, revelou imensa heterogeneidade entre o HPV16 positiva casos CaCx retratando genomas virais integrados. Os resultados fornecem novos insights sobre HPV16 relacionados CaCx patogênese e destacar que os casos CaCx que abrigam genomas HPV16 episs�icas com intacta
E2 Quais são susceptíveis de ser distintas biologicamente, a partir dos genomas virais puramente integrados em termos de genes do hospedeiro e /ou vias envolvidas na carcinogénese cervical
Citation:. Das Ghosh D, Bhattacharjee B, Sen S, Premi L, Mukhopadhyay I, Chowdhury RR, et al. (2012) Alguns Insights romance no HPV16 relacionada Cervical Cancer Patogênese com base em análises de LCR metilação, a carga viral, E7 e E2 /E4 Expressões. PLoS ONE 7 (9): e44678. doi: 10.1371 /journal.pone.0044678
editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |
Recebido: 22 de junho de 2012; Aceito: 07 de agosto de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012
Direitos de autor: © Das Ghosh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (Grant No. BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), Governo da Índia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
HPV16 parece ser o tipo de HPV de alto risco mais comuns identificados em casos CaCx, lesões pré-cancerosas do colo do útero, e em amostras cervicais citologicamente normais [1], [2]. Na Índia, entre os casos positivos CaCx HPV, a maioria é de ADN HPV16 positivo [3], [4].
Estabelece-se que, embora o genoma do HPV existe na forma epissomal nas lesões de baixo grau, o genoma viral fica integrado, com graus crescentes de lesão [5]. Apesar desta observação, a análise de associação de infecções de HPV com o desenvolvimento CaCx revela a presença de ambos integrados, bem como formas epissomais de HPV, especialmente de HPV16, em casos CaCx [6]. Nossas observações mostraram que
E2
ruptura do gene é significativamente sobre-representados entre os casos CaCx comparados aos controles [7]. No entanto, mais de 60% dos casos CaCx abrigar intacta
E2
, apesar do fato de que a proteína HPV16 E2 regula negativamente a transcrição da
E6 Comprar e
E7
genes [7] , [8]. Isso nos levou a explorar novos paradigmas da carcinogênese cervical, que oferecem insights sobre os mecanismos envolvidos na sustentada
E6
/
E7
expressão de mRNA mesmo com o gene
E2
intacto, ou seja, presença de genomas virais concomitantes (tanto episs�icas e integrados) ou genomas virais puramente episs�icas [7], [9] – [11]
com base em uma comparação entre quinze HPV16 positivo com citologia normal e cinquenta e sete HPV16. casos CaCx positivas com intacta
gene E2
, propusemos que a perda de actividade do repressor E2, em tais casos, predominantemente do E-linhagem, pode ser atribuído à CpG metilação no nucleotídeo 58 dentro E2 sítio de ligação I (E2BS- I) seguinte para o promotor p97, atenuando, assim, a ligação de E2 a este local [7], [9]. Nós posteriormente observou que a carga viral de
E2
-intact casos foi significativamente maior em comparação com aqueles com o gene da
E2
interrompido. Isso nos levou ainda mais a interpretar que a carga viral em associação com
E2
-status, pode ser de relevância causal na patogênese CaCx [12]. A viabilidade biológica de tais observações é susceptível de ser apoiado pelo facto de que a proteína E2 aumenta a replicação do ADN virai através da interacção com o factor de replicação virai E1 e recrutamento para a origem de replicação [13] – [15] e também desempenha um mais directa papel na replicação facilitar a segregação do genoma viral por amarrar os genomas virais para hospedar cromossomos mitóticos [16] – [17]
Realizamos o presente estudo, com foco em HPV16 positivo E2 intacta e E2 interrompido casos CaCx inicialmente, seguido. por sua classificação em epissomais e integrados formas, para determinar os papéis interdependentes de (i) a metilação dentro E2 locais de ligação I e II (E2BS-I /II) e origem da replicação no LCR, (ii) a expressão de oncogene viral
E7
, (iii) expressão da transcrição (
E7-E1∧E4)
que codifica a proteína do repressor E2 e (iv) carga viral, em HPV16 relacionada CaCx patogénese. Nosso estudo proporciona novos insights sobre os mecanismos alternativos de perda de actividade do repressor E2, que poderiam estar relacionados com E2BS-I /II metilação, a presença da transcrição (
E7-E1∧E4
), que codifica a proteína do repressor E2, carga viral elevada e
expressão E7
entre os casos positivos CaCx HPV16 com episs�ica (puro ou concomitante com integrado) genomas virais e não entre os casos com genomas virais puramente integrados. Neste estudo, foram ainda identificados através do emprego de uma nova técnica, APOT acoplado-quantitativa-RT-PCR, que houve imenso diversidade entre os casos de HPV16 CaCx positivo tanto em termos de número de cópias virais e
E7 expressão
níveis.
Materiais e Métodos
amostras e assuntos
As amostras utilizadas para este estudo foram aninhado a um estudo de coorte naturais em curso [7], [11], [12 ]. As amostras malignas positivos HPV16 (N = 184; histologicamente confirmados carcinomas de células escamosas invasivo e clinicamente diagnosticada como tumor estádio III e acima de acordo com a classificação FIGO) foram derivadas de indivíduos casados, participando de um hospital de referência câncer (Saroj Gupta Centro de Câncer e Instituto de Pesquisa, do Sul 24 Parganas, West Bengal, India). As amostras (tecidos de biópsia frescos) foram coletados dos participantes com consentimento informado aprovado pelo comitê de ética institucional para a experimentação humana do Instituto de Estatística da Índia. Detalhes sobre assuntos, amostras, de isolamento de ADN, de detecção de HPV16 baseada em PCR, determinação de
E2
estado de perturbação pela sobreposição de PCR e estimativa da carga viral são descritos em outros lugares com base DNA-[12]. Dos 184 casos, o número de amostras abrigar intacta
E2
foi de 140, e que ter perturbado
E2
era 44.
Determinação do estado de metilação de ADN HPV16 por restrição digestão enzimática e PCR
E2
casos -intact, estado de metilação do E2BS-I [50 ACCGAAA
CCGG
T-61] e também a região da LCR
E6
(LCR-
E6
) foram determinadas por restrição-digestão com
HpaII /MspI
e
McrBC
enzimas (New England Biolabs), respectivamente, e analisados por PCR, seguindo protocolos publicados [9]. Aproximadamente 20% da metilado (com base no
McrBC
digestão de restrição) casos foram selecionados aleatoriamente a partir de cada um dos
E2
-intact (30/140) e
E2
-disrupted (9/44) categorias para seqüenciamento bissulfito, utilizando o par de iniciadores 5′-TAA GGT TTA AAT TTT TAA GGT TAA TTA AAT-3 ‘e 5′-ATC CTA AAA CAT TAC AAT TCT CTT TTA ATA-3’ cobrindo posições 7748 -115 [18].
isolamento de ARN e a transcrição
os ARNs totais inversa, a partir de 41 amostras de cancro, foram isolados, purificados e tratados com DNase I, utilizando o kit Qiagen RNeasy, seguindo o protocolo do fabricante. Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente utilizando 200U de M-MuLV da transcriptase reversa (Fermentas) numa reacção de 20 ul contendo tampão RT 5X [Fermentas; 250 mM de Tris-HCl (pH 8,3 a 25 ° C), KCl 250 mM, MgCl 20 mM
2, 50 mM de DTT], dNTP 10 mM, DTT 0,1 M, 20 U de RNase inibidor e 400 ng de (dT) 17 iniciador P3. A mistura contendo ARN e iniciadores foi aquecida a 70 ° C (10 minutos) e arrefeceu-se (10 minutos) antes da adição de tampão 5X, DTT 0,1 M e inibidor de RNase, e em seguida, incubada a 25 ° C (2 minutos), seguido pela adição de transcriptase reversa e as incubações subsequentes a 25 ° C (10 minutos) e 42 ° C (60 minutos). A reacção foi inactivada a 70 ° C (15 minutos).
A confirmação do estado físico do genoma de HPV16 e à presença do transcrito virai, E7-E1∧E4, em casos CaCx, por APOT acoplados à quantitative- ensaio de RT-PCR – uma nova técnica
Conceito de ensaio APOT-coupled-quantitativa-RT-PCR
o ensaio APOT foi usado principalmente para obter produtos de toda a região amplificada a partir de
E7
para
E2
usando cDNA total de formado com um iniciador oligo-dT (dT) 17-P3, onde P3 foi uma sequência de adaptador (seguindo o princípio de 3 ‘RACE) [19]. Em vez do caminho posterior de confirmar intactness de genomas virais por hibridação Southern, PCRs aninhadas com separadas RT-PCR (TaqMan) conjuntos de iniciador-sonda para
E7
e
E4
foram desenhados neste estudo para verificar o intactness de genomas virais com base na diferença quantitativa entre o
E7 Comprar e
E4
níveis de transcrição.
E7
é sempre (tanto em epissomal e condições integrados) encontrados para estar intacto devido ao seu papel na oncogenicity, e não abrigar qualquer local de splicing-junction. Assim, a quantificação do
E7
transcrição da piscina cDNA viral poderia marcar presença viral independentemente do seu estatuto genômica (epissomal ou integrado). Por outro lado,
E2
codificante do repressor intacta mantém
E4,
que por sua vez contém a região de codificação da proteína E2 dobradiça. Dobradiça-região codificadora supostamente abriga maior parte dos sítios de ruptura para a integração virai no genoma do hospedeiro [20]. Assim, a quantificação da região de codificação da dobradiça dentro
E4
da piscina cDNA viral, poderia marcar presença de intacta
E2
. Então conjuntos sondar-de iniciadores foram concebidos para
E7
e
E4 Compra de base-TaqMan qRT-PCR sobre os produtos APOT-PCR. Reforço diferencial da
E7
e
E4
em epissomas e integra poderia ser indicada por diferenças no C
T-valores de
E7 viajantes – e
espec�ico qRT-PCR.
APOT-PCR.
A primeira PCR com P1 (5′-CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT-3 ‘) e P3 (5’- GAC TCG AGT CGA CAT CG-3 ‘) e o segundo PCR com P2 (5′-CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG-3′) e (dT) 17-P3 (5’- GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘) foram realizados em 41 casos CaCx seguintes protocolos publicados [19]. Os produtos de PCR foram verificados por gel de agarose (1,5%) de electroforese de P2 -.. (DT) 17-P3 produtos
RT-PCR quantitativa de E7 e E4 em produtos APOT-PCR TaqMan
A mistura de reacção (10 ul) de
E7
e
E4
duplex qRT-PCR continha 2X TaqMan® Universal mix PCR master (Applied Biosystems), 3 ng primers e 2 sonda? M . O iniciador-sonda para HPV16
E7
(forward: 5′-AAG TGT GAC TCT ACG CTT CGG TT -3 ‘; reversa: -5’ GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA A- 3 ‘; sonda: 5’-FAM-TGC GTA CAA AGC ACA CAC GTA GAC ATT CGT A-BHQ -3 ‘) e HPV16
E4
(forward: 5’CTT GGG CAC CGA AGA AAC AC -3′; reversa: 5′-GAT TGG AGC ACT GTC CAC TGA GT -3 ‘; sonda: 5′-Vic-ACG ACT ATC CAG CGA CC-BHQ -3’) produziu 78 pb e 118 pb amplicons, respectivamente. O tempo real do programa de PCR incluíram UNG-activação a 50 ° C durante 2 minutos, a desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos e hibridação a 60 ° C durante 1 minuto. O PCR-controlos foram NTC (controlo não-molde), bem como alíquotas separadas a partir de reacções de transcrição inversa com (i), todos os reagentes excepto ARNm, (ii) ARNm e todos os reagentes, mas não a transcriptase inversa, e (iii) o HPV-negativo celular ARNm. O ensaio duplex foi realizada pelo menos duas vezes, com três réplicas por amostra em cada ensaio.
PCR de GAPDH e TP53 para confirmar a presença de mRNA e não de DNA
Presença de ARNm foi confirmada pela PCR com iniciadores abrangendo junção exão-exão do
GAPDH
. O volume de reacção de 10 uL continha 1,25 mM MgCl
2, 100 de dNTP uM, 1 unidade de polimerase de ADN AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) e 50 ng (iniciadores forward: 5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3 ‘; reverso: 5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3’ de ADNc ul) e uma em tampão 10X AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems). O programa de PCR incluíram 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C, hibridação a 55 ° C e elongação a 72 ° C, cada um durante 1 minuto, em conjunto com a desnaturação inicial durante 8 minutos a 95 ° C e um alongamento final de 5 minutos a 72 ° C. Presença de 106 pb amplicon foi verificada em 2,5% de gel de agarose.
A ausência de DNA a contaminação foi confirmada por PCR com iniciadores abrangendo íntrons de
TP53
. O volume de reacção de 20 uL continha 2 mM MgCl
2, 50 dNTP uM, 1 unidade de polimerase de ADN AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems), 40 ng (iniciadores forward: 5′-CCT GAA AAC AAC CTG TTG GTA A- 3 ‘; reverso: 5′-AAG GCA TTG TCT GGA CAT AG-3’ de cDNA) e 2 ul em tampão 10X AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems). O programa de PCR incluíram 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C, hibridação a 56 ° C e elongação a 72 ° C, cada um durante 1 minuto, em conjunto com a desnaturação inicial durante 8 minutos a 95 ° C e um alongamento final de 5 minutos a 72 ° C. Presença de 448 pb amplicon foi verificada em gel de agarose 1,5%.
A quantificação relativa de
E7
e
E2
expressão de mRNA por qRT- PCR (TaqMan)
E7
e
E2
expressões gênicas foram quantificados entre um subconjunto de 30 amostras, das quais 17 eram episs�ica (puro ou concomitante) e 13 foram puramente integrado por qRT-PCR (quantificação relativa com comparativa C
método T). expressão E7 foi quantificada utilizando o mesmo conjunto de iniciador-sonda tal como no ensaio de APOT acoplado-quantitativa por RT-PCR-[
21
].
E2
expressão foi estimada a partir de 82 bp amplicon por E2-específica iniciador-sonda [frente: 5 ‘AAC GAA GTA TCC TCT CCT GAA ATT ATT AG 3’; reversa: 5 ‘CCA AGG CGA CGG CTT TG 3’; sonda: 5 ‘(BODIPYR6G) -CAC CCC GCC GCG ACC CAT A- (DQ) 3’]. A mistura de reacção (10 ul) continham 2 ul de cDNA, 50 iniciadores de Ng, 0,1 uM e sondas TaqMan ® 2X Universal PCR master mix (Applied Biosystems). ACTB humana controle endógeno (VIC /MGB Probe, Primer Limitada) (Applied Biosystems) (tamanho do amplicon = 171 bp) foi utilizado como normalizador. O PCR-programa e os controlos utilizados foram os mesmos que no ensaio APOT acoplado-quantitativa-RT-PCR. Os ensaios, com três repetições por amostra, foram repetidas duas vezes.
Análises Estatísticas
teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizada para identificar se o teste-variáveis como número de cópias virais, expressões de gene de manutenção e genes virais seguido distribuição normal. teste t de 2 amostras independentes e pelo teste de Mann-Whitney foram usadas para identificar associação com fenótipo da doença, respectivamente, para as variáveis que se seguiram distribuição normal e aqueles que não o fez. O teste do qui-quadrado foi realizado para testar a associação de metilação dentro E2BS-I com
E2
-status interrupção entre as amostras CaCx. O
k
-means algoritmo de agrupamento (
k
= número de clusters) foi utilizada para categorizar diferentes formas de genomas virais puramente integrados. Todas as análises foram realizadas utilizando pacote de software, SPSS para Windows v16.0.
Resultados
Padrão de metilação do LCR ea intacta E2BS-I (nucleótido 58) dos casos positivos CaCx HPV16 alojamento ou interrompidas
E2
Após o nosso estudo anterior [9] nós investigamos o papel da CpG metilação no nucleótido (nt) 58 dentro E2 sítio de ligação I (E2BS-I), em CaCx patogênese por uma comparação directa entre HPV16 casos positivos CaCx abrigando genomas virais com gene E2 intacto ou interrompido usando um conjunto expandido de cento e oitenta e quatro amostras CaCx. digestão de restrição (
Hpall /MspI
) e análise de PCR subsequente revelou metilação na E2BS-I (nucleótidos 58), proximal à promotor de p97 dentro do LCR, para ser significativamente mais elevado (p 0,001) entre
E2
casos -intact (69/140; 49,28%), comparativamente a
E2
casos -disrupted (5/44; 11,36%).
análise
bissulfito-seqüenciamento de DNA LCR de 39 casos CaCx confirmou que entre os
E2
casos -intact (n = 30), a metilação foi mais proeminente (Figura 1) em posições de nucleótido 31 (local SPI vinculativo, 63,33%), 37 e 43 (E2BS-II, 86,66% e 60%, respectivamente), 52 e 58 (E2BS-I, 70% e 83.33%, respectivamente) em comparação com a origem de replicação virai (posição 7862, 3,3%). Além disso, em comparação com
E2
casos -intact,
E2
casos -disrupted (n = 9) retratado não metilação nas posições 7862 e 31 e menor de metilação nas outras posições. eletroferogramas representativos são apresentados na Figura S1.
(A) diagrama de barras que compara percentagem de amostras em diferentes metilado CpG dentro do LCR do genoma de HPV16 entre
E2
-intact e
E2
amostras -disrupted. (B) Representação esquemática das posições CpG assinaladas no LCR: 7862 – origem de replicação viral; 31 – local de ligação SPI; 37 e 43 – E2BS II; 52 e 58 – E2BS I.
A confirmação da presença da transcrição viral
E7-E1∧E4
que codifica repressor E2 em casos CaCx com base em APOT acoplados à quantitative- ensaio de RT-PCR e classificação de amostras em episs�ica (puro ou concomitante) e formas genómicas virais puramente integrados
Depois de confirmar a ocorrência de metilação em CpGs dentro E2 locais adjacentes para promotor p97 obrigatório em casos abrigar intacta
E2 Comprar e ausência em casos abrigar interrompido
E2
, o nosso próximo objetivo foi confirmar a presença de transcritos E7-E1∧E4 na antiga para confirmar a expressão do repressor
E2
transcrições em tais casos, em contraste com os casos ter perturbado
E2
. Utilizou-se o ensaio de APOT caso em que, a presença do tamanho da banda de 1050 pb após a electroforese de produtos PCR obtidos com P2 e (dT) iniciadores 17-P3 em gel de agarose a 1,5%, (Figura 2A), foi considerado específico para o repressor
E2
-splice variante,
E7-E1∧E4
,
codificados de gene intacto
E2
. Ausência da banda 1050 pb e presença de bandas de outros do que 1050 pb comprimentos indicar a presença de transcritos integrar derivados [19]. No entanto, a presença da banda de 1050 pb em conjunto com as faixas de fora-de tamanho indicam a presença de formas mistas ou concomitantes isto é, a co-existência de epissomal e formas integradas de genomas virais. Essa análise identificou 22 casos CaCx retratando a presença de
E7-E1∧
E4 transcrição e, portanto, as transcrições do repressor E2 e 19 casos CaCx falta a presença desta transcrição. Os casos CaCx poderia, assim, ser especulado como hospedeiros epissomal (n = 4), concomitante (n = 18) e integrada (n = 19) formas de genomas virais, que confirmou subsequentemente através da realização de PCR em tempo real (ensaio TaqMan) usando o Os produtos de PCR obtidos com iniciadores de 17 P3 P2 e (dT), que correspondem a
E7
e
expressão E4
, em vez de hibridação Southern.
O PCR em tempo real ( RT-PCR) dados correspondentes a
E7
e
E4
(Figura 2B) foram representados como
valores de T C, onde C
T é definido como o ciclo limiar da PCR em que, o produto amplificado foi detectado pela primeira vez.
E7 viajantes – e
E4
eficiências de PCR espec�icos não diferem com base na quantificação absoluta pelo método de curva padrão, utilizando diferentes números de cópias (1,75 × 10
8, 1,75 × 10
6 e 1,75 × 10
4 cópias) de pUC19 plasmídeo vector com inserção sequência de referência de HPV16 (Figura S2). A presença de ARNm foi confirmada por PCR com iniciadores que abrangem junção exão-exão de
GAPDH (Figura 2C) e ausência de contaminação de ADN foi confirmada por PCR com iniciadores que abrangem intrões de
TP53
(Figura 2D )
(A) eletroforese em gel Representante mostrando P2 -. (dT) produtos de 17 P3. Pista 1: Amostra de exibição presença de 1.050 bp band-indica o tamanho do genoma viral epissomal. Presença de outros band-tamanhos indica o estado concomitante; As pistas 2, 3, 4, 6: ausência de banda-size 1.050 pb indica o status integrada dessas amostras. Pista 5: 100 bp ladder (Roche). (B) parcelas de amplificação à base de TaqMan RT-PCR quantitativa de
E7 Comprar e cDNA
E4
.
E7
é transcrito em ambos os episs�ica (puro ou concomitante) e casos integrados, mas
E4
é transcrito em apenas casos episs�icas. (C) de agarose de electroforese em gel de produtos de PCR de
GAPDH
ADNc (iniciadores abrangem junção exão-exão). Pista 1: controle negativo; Pista 2: linha de células CaSki ADN (controlo negativo); Lanes 3-7: cDNAs de amostra que mostram o tamanho banda específica de 106 pb; Pistas 3 e 7 mostram episs�ica (puros ou concomitantes) amostras T323 e T329, respectivamente, enquanto, pistas 4-6 mostram amostras puramente integrados T327, T326 e T328, respectivamente; Pista 8:
Hae
III digerido marcador de DNA x174 (Promega)?. (D) a eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR de
TP53
cDNA (primers abrangem íntrons). Pista 1-6, 8, 9: cDNA amostra não mostrando tamanho da faixa específica de 448 pb; As faixas 1, 2, 4, 6 e 9 mostram puramente amostras integrada T326, T327, T345, T344 e T328, respectivamente, enquanto, pistas 3, 5 e 8 mostram episs�ica (concomitantes puro ou) amostras T329, T323 e T339, respectivamente; A pista 10: linha de células CaSki ADN (controlo positivo); Pista 11: ADN da amostra (controlo positivo); Pista 12: água (controle negativo); Pista 7:?.
Hae III
digerido x174 marcador de ADN (Promega)
De acordo com o ensaio de APOT acoplado-quantitativa-RT-PCR, o estado genómico do VPH 16 também poderia ser interpretado com base no rácio,
E7
C
T /
E4
C
T. As amostras CaCx (19/41), mostrando
E7
e
ACTB
expressão, mas nenhum
E4
expressão (
E7
C
T /
E4
C
T = indeterminado), foram designados como casos com genomas virais integrados. amostras CaCx (18/41), mostrando mais expressão de
E7
que
E4
(
E7
C
T /
E4
C
T≤1), juntamente com
expressão ACTB
, foram considerados como casos que retratam a presença de ambos epissomal e genomas virais integrados (concomitantes). Houve quatro casos CaCx que mostram níveis similares de expressão de ambos
E7
e
E4
(
E7
C
T /
E4
C
T = 1), juntamente com
ACTB
expressão, e estas foram consideradas como amostras abrigando genomas virais episs�icas. Não houve significativa (p = 0,186; t-teste) diferença no
ACTB
expressão de mRNA entre os casos CaCx abrigando genomas virais episs�icas (pura e concomitante) com média ± sd = 32.98 ± 3.99 e puramente integrados genomas virais com significa ± dp = 34,99 ± 3,26. Assim, 53,66% (22/41) dos casos CaCx abrigava genomas intactos virais dos quais, 18,18% (4/22) tiveram genomas episs�icas puros e 81,82% (18/22) tiveram genomas concomitantes (Tabela 1).
Reanálise dos nossos dados sobre E2BSI metilação no nt 58 em LCR neste subconjunto de amostras, também revelou que tal metilação foi significativamente (p
tendência = 0,001) maior entre os casos que retratam episs�ica (pura e concomitante) genomas virais (17/22; 77,27%) em comparação com aqueles com genomas puramente integrados virais (5/19; 26,32%).
a análise da expressão de
E7
e
E2
genes em casos CaCx abrigando episs�ica (pura e concomitante) ou genomas HPV16 e correlação com a carga viral
puramente integrado
Nosso próximo objetivo foi investigar se os dois tipos de cânceres, (i) aqueles episs�ica abrigando ( pura e concomitante) e (ii) integrado formas virais, diferiam na expressão oncogénica viral, por meio da análise
E7
mRNAs. Foram quantificados
E7
expressão (normalizado pelo
ACTB
) por-base TaqMan qRT-PCR dos produtos de ADNc gerados directamente a partir do ARNm, de um subconjunto de 17 epissomal (puramente epissomal e concomitante) e 13 casos puramente integrados.
E7
expressão de mRNA (
E7
C
T /
ACTB
C
T) foi encontrado para ser distribuídos normalmente em ambos os episs�ica (Kolmogorov-Smirnov valor Z = 0,418, p = 0,995) e (Kolmogorov-Smirnov valor Z = 1,06, p = 0,211) casos integrados. A relação,
E7
C
T /
ACTB
C
T, foi significativamente menor (p 0,001; teste t) entre episs�ica (média ± sd = 0,84 ± 0,15) do que integrados (média ± DP = 1,12 ± 0,18) casos que indicam maior expressão
E7
no primeiro.
a quantificação relativa com base no comparativo C
método T também revelou a diferença significativa (p 0,001; Mann-Whitney U) entre Sc
T (
E7
C
T –
ACTB
C
T) valores de casos com viral integrado genomas (mediana Sc
T = 1,26) e com genomas episs�icas (mediana Sc
T = -4,97). A análise fold-change (usando 2
-ΔΔCT, onde
T =
T de episs�ica ΔΔC mediana Sc – mediana Sc
T do integrado), representado que
expressão E7
nos casos com episs�ica (concomitante pura e) genomas virais foi 75.087 dobras maior do que os casos com genomas virais puramente integrados
número de cópias virais (log natural transformado) por 100 ng de DNA genômico, também foram significativamente maiores (p . 0.001 ; Mann-Whitney U) entre os 17 casos episs�icas (ln mediana (carga viral) = 18,02 por 100 ng de ADN) em comparação com os 13 casos puramente integrados (ln mediana (carga viral) = 9,28 por 100 ng de ADN). A relação,
E7
C
T /
ACTB
C
T, foi encontrado para ser significativamente correlacionada com a carga viral (p = 0,007; R
2 = 0,398) no interior das amostras epissomais (puro e concomitante) (Figura 3A), mas não nas amostras puramente integrados (p = 0,51;. R
2 = 0,038) (Figura 3B)
(a) correlação de
E7
C
T /
ACTB
C
T com a carga viral (valores de log natural) em casos CaCx com episs�ica (puramente epissomal e concomitante) genomas virais; (B) Correlação de
E7
C
T /
ACTB
C
T com carga viral (valores log natural) em casos CaCx com genomas virais integrados; (C) Correlação de
E2
C
T /
ACTB
C
T com a carga viral (valores de log natural) em relação ao gene
E2
em casos CaCx com episs�ica (puramente episs�icas e concomitantes) genomas virais.
O episs�ica casos (puros e concomitantes) mostraram expressão simultânea de
E2
mRNA (média (
C
T /
ACTB
C
T) ± sd = 0,92 ± 0,18), enquanto os casos puramente integrados não conseguiram fazê-lo. A relação,
E2
C
T /
ACTB
C
T, foi encontrado para ser significativamente correlacionados (p 0,001; R
2 = 0,621) (Figura 3C) com
E2
número de cópias do gene (ln mediana (
E2
carga) = 15,41 por 100 ng de ADN) entre tais casos abrigando episs�ica (pura e concomitante) genomas virais.
A análise conjunta dos
E7
C
valores T de ensaio-quantitativa-RT-PCR APOT-acoplados e carga viral entre as amostras CaCx retratando genomas HPV16 puramente integrados que empregam
k
-means agrupamento
a falta de correlação de
expressão E7
com a carga viral, entre os casos CaCx com genomas virais integrados, apontou para a possibilidade de existência de heterogeneidade entre tais casos CaCx em relação ao
expressão E7
. Nós, portanto, analisada com mais profundidade os nossos dados através da realização de uma análise de cluster (
k
-means agrupamento) com base na carga viral e
E7
C
T (APOT-coupled-quantitativa-RT-PCR ). Essa análise poderia optimamente classificar os casos com genomas virais interrompidas (46,34%; 19/41) em quatro grupos (Figura 4), conforme ilustrado na Tabela 2. Os respectivos cluster-centros foram representados na Tabela 3. O
ACTB
expressão de ARNm destes casos não se correlacionou com nenhum dos sua carga viral (p = 0,588; regressão linear), ou
E7
C
valores T (APOT acoplado-quantitativo de RT-PCR-) (p = 0,753; regressão linear)
Cluster 1:. baixa carga viral e baixa expressão
E7
; Cluster 2: carga viral alta e baixa expressão
E7
; Cluster 3: carga viral moderado e moderado
E7
expressão; Cluster. 4: baixa a moderada carga viral e
E7
expressão alta
Destes quatro grupos, Grupo 1 (média de carga viral ± sd = 6,87 ± 1.074, média
E7
C
T ± dp = 37,91 ± 1,416) incluiu 6 amostras (31,60% das amostras puramente integrados). No geral, estes tiveram baixa carga viral e baixa expressão
E7
. Cluster 2 (média de carga viral ± dp = 17,01 ± 1.447; média
E7
C
T ± dp = 36,38 ± 1.948) também incluiu 6 amostras (31,60% das amostras puramente integrados), que teve alta viral de carga e baixa expressão
E7
. Entre estas amostras,
ACTB
transcrição (com a mesma quantidade de ADNc que o utilizado no APOT acoplado-quantitativa por RT-PCR-análise para
E7
e
E4
) não se correlacionou com a carga virai (p = 0,942; regressão linear). Cluster 3 (média de carga viral ± dp = 14,72 ± 3.359; média
E7
C
T ± dp = 12,47 ± 2.128) incluíram 5 amostras (26,32% das amostras puramente integrados) e estes retratado carga viral moderada e
E7
expressão moderada. Cluster 4 (média de carga viral ± sd = 9,36 ± 2,694, média
E7
C
T ± sd = 2,41 ± 0,467) incluído 2 amostras (10,56% das amostras puramente integrados), que revelou baixa a moderada carga viral e expressão
E7
muito elevado. As distâncias das amostras dos centros de seus clusters correspondentes são apresentados na Tabela 2. Assim, dos quatro grupos, dois foram encontrados a ser caracterizada por moderada a alta
E7
expressão e os dois restantes representado baixo