Sumário

Apesar de inflamação crônica, lesões de psoríase quase nunca progredir para o câncer de pele. função aberrante do gene CCHCR1 (Coiled-Coil α-helicoidal da proteína Rod 1, HCR) dentro do locus PSORS1 pode contribuir para o aparecimento de psoríase. Como CCHCR1 é expressa em certos tipos de câncer e regula queratinócitos de proliferação (KC) em um modelo de rato transgénico, estudamos sua relação com a proliferação de células escamosas cancro cutâneo (SCC) linhas celulares por matrizes de expressão e RT-PCR quantitativo e em tumores de pele por imuno-histoquímica . CCHCR1 proteína foi detectada na fronteira empurrando de CEC e forro ilhas carcinoma basocelular. Diferente de psoríase, Ki67 tinha um padrão de expressão semelhante como CCHCR1. A coloração mais intensa CCHCR1 ocorreu nas áreas positivas para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). A expressão de mRNA CCHCR1 foi regulada 30-80% nas linhas SCC quando comparado com KCs normal e positivamente correlacionada com a expressão Ki67. As linhas de células de tumor mais agressivo e invasivos (RT3, FaDu) expressa o ARNm CCHCR1 menos do que as células HaCaT não tumorigénicas. Além disso, os promotores de tumores e ácido ocadaico menadiona downregulated ARNm CCHCR1. Conclui-se que, tanto na psoríase e as primeiras fases da transformação KC, CCHCR1 pode funcionar como um regulador negativo da proliferação, mas para além de um certo ponto na oncogênese não pode controlar este fenômeno por mais tempo

Citation:. Suomela S, Elomaa S, T Skoog, Ala-aho R, G Jeskanen, Pärssinen J, et al. (2009) CCHCR1 é regulado para cima em cancro de pele e Associated com EGFR Expression. PLoS ONE 4 (6): e6030. doi: 10.1371 /journal.pone.0006030

editor: Benjamin rico, Harvard Institute of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de dezembro de 2008; Aceito: 21 de maio de 2009; Publicação: 24 de junho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Suomela et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Academia da Finlândia (US-K. conceder nenhuma 115.590., SS conceder nenhuma 122236., RA e VM.K. conceder no. 114409, LL conceder no. 108828), Fundação Juselius Sigrid (US-KJK, VM .K.), A Universidade de Helsínquia fundo de investigação Hospital (TYH 7113), a Fundação finlandesa Cancer Research (VM.K.) e do Programa da União Europeia Quadro 6 (LSHC-CT-2003-503297) (RA e VM.K.) , Turku University Hospital Central EVO concessão (13336 projeto), e finlandesa Sociedade Dermatológica (SS), a Finlândia, o Conselho de Pesquisa sueco (US-K., JK) e Fundação Swedish Cancer (US-K., JK) e Finsen- Fundação Welander (TS), Suécia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nós mostramos anteriormente que o gene CCHCR1 dentro do locus principal PSORS1 psoríase susceptibilidade pode funcionar como um regulador negativo da proliferação KC [1] – [3]. O gene codifica uma proteína CCHCR1 ácido amino 782 (GenBank AY029160) [4], que é diferente expresso na pele psoriática lesionada comparada com a pele normal: lesionally CCHCR1 localiza na basais e suprabasais da epiderme onde KCs é o mais fino possível. A coloração para o marcador de proliferação celular Ki67 mostra a correlação inversa CCHCR1 em lesões de psoríase, consistente com um papel na proliferação KC [1], [4]. Além disso, o nosso modelo de ratinho que sobre-expressam o alelo de risco psoríase CCHCR1 * WWCC sob queratina 14 mostra promotor capacidade diminuída de proliferação de KCs [3], sugerindo menos proteína activa um activador (PA-1) a sinalização mediada nos ratinhos de risco. sinalização AP-1 mediada regula genes associados com a proliferação de células, incluindo EGFR também conhecido como ErbB1 [5].

As lesões de psoríase quase nunca progredir para o câncer de pele, apesar de inflamação crônica que muitas vezes é um fator de risco para o câncer [6] [7]. Tanto a psoriase e o cancro da pele são caracterizadas por uma proliferação descontrolada KC além de angiogénese e inflamação. A proliferação celular e a diferenciação pode ser mediado através da sinalização de EGFR [8]. Vários ligandos de EGFR (TGF-alfa, anfirregulina, factor de crescimento tipo EGF de ligação à heparina) são sobre-expressos em lesões de psoríase, a expressão transgénica e do gene da anfirregulina humana induz um fenótipo de tipo psoríase [8]. sinalização de EGFR também tem sido implicado na patogénese de cancro da pele não-melanoma [8] – [10]. Curiosamente, tanto a melhoria e exacerbação da psoríase têm sido relatados em associação ao tratamento com quinase do câncer inibidor EGFR tirosina [11], [12].

Em nossos estudos anteriores, expressão CCHCR1 foi detectada em células nonproliferating na mama e pulmão adenocarcinomas: o marcador de hiperproliferação de Ki67 foi detectada em adjacente, mas não nas mesmas células que CCHCR1 [1]. Por outro lado, o EGF-regulada a expressão da proteína em células HaCaT CCHCR1 [2]. Para entender melhor a função de CCHCR1 na transformação KC e câncer de pele, estudamos a sua expressão nas lesões escamosas pré-malignas e malignas e carcinoma basocelular (CBC). Como o EGFR e o seu alvo a jusante da ciclina D1-estão envolvidos no desenvolvimento do cancro e, possivelmente, afectada pelas vias CCHCR1 putativos, examinámos a sua expressão em comparação com CCHCR1. A relação de CCHCR1 para KC hiperprolifera�o foi destacada por coloração amostras adjacentes com o anticorpo Ki67. Nós também estudaram a correlação do nível de expressão CCHCR1 aos de Ki67 e EGFR em culturas de células com diferentes proliferativa e características invasivas. níveis de mRNA CCHCR1 foram determinados em culturas HaCaT incubadas com diversos agentes bioativos com importância na promoção de tumor, o estresse oxidativo ou inflamação psoriática. Finalmente, os níveis de CCHCR1, Ki67, e EGFR ARNm de expressão foram determinados num micro-arranjo de oligonucleótidos de linhas de células SCC cutâneas e linhas celulares KC epidérmicos humanos normais. Nossos resultados sugerem que CCHCR1 é expressa em cancros da pele não-melanoma em associação com EGFR e Ki67 in vivo. No entanto, em cultura de células as células mais atípicas expressar CCHCR1 menos de células HaCaT imortalizados, e promoção do tumor e proliferação induzida de células HaCaT se correlaciona com a expressão CCHCR1 reduzida.

Resultados

CCHCR1 é expressa em SCC em associação com o EGFR, ciclina D1, e Ki67

para estudar o papel de CCHCR1 na proliferação e transformação de KC, foi investigada a expressão de proteína CCHCR1 por imuno-histoquímica em diferentes tumores da pele em relação ao EGFR, a sua cyclin- alvo a jusante D1, e o marcador de hiperproliferação Ki67. células positivas CCHCR1 estavam presentes em 20/22 CCEs estudados. proliferativas células cancerosas na frente invasiva expressa CCHCR1 (Figura 1A, D, L, S1; Figura 2A, C, E), enquanto que as células cancerosas em meio coesivas foram CCHCR1 negativo. excrescência infiltrante foi típico de áreas positivas CCHCR1, no entanto, as células atípicas eram heterogéneas quanto à expressão CCHCR1 (Figura 2A). CCHCR1 expressão no CEC foi associada com coloração positiva de EGFR em todas as amostras (Figura 1A, C, D, F). Os CCHCR1 ninhos de câncer positiva na derme inferiores foram ciclina D1-positivo também (Figura 2C-F). Células positivas para o marcador de hiperproliferação Ki67 foram localizadas principalmente nas mesmas áreas como células positivas CCHCR1 (Figura 1B, E; 2B). No entanto, em grau III CCEs Ki67 foi mais abundantemente presentes também em áreas tumorais coesivas que estavam desprovidos de expressão CCHCR1 (dados não mostrados). Para efeitos de comparação, uma amostra de pele normal é mostrado com basal KCs positivo para CCHCR1 e EGFR, e espalhadas positividade para Ki67 (Figura 1H-J).

As secções em série de grau I SCC (A-C) e da pele normal (H-J) foram imunocoradas com anticorpos contra CCHCR1, Ki67, e EGFR. ampliações de A-C são também mostrados (D-F, respectivamente). coloração CCHCR1 (G) numa secção adjacente à coloração de EGFR (F). CCHCR1 proteína (A) é expressa em células cancerosas proliferativas na frente invasiva de ilhas de células de cancro de um SCC dérmica em associação com o marcador da hiperproliferação de Ki67 (B) e EGFR (C). As células positivas Ki67 (E) expressar CCHCR1 (D). coloração de EGFR (F) associados com a coloração CCHCR1 (L) em secções adjacentes. amostras de pele normal expressar CCHCR1 (H) e EGFR (J) em KCs basal, enquanto que a expressão de Ki67 (I) é mais escassa. As setas apontam em posições ilustrativos.

Barras de escala:

(A-C) 50 mm; (D-G) de 12,5 uM; (H-J) 25 uM.

As secções em série de grau III (A, B) e grau II (C, D) CCS foram coradas com os anticorpos indicados. Maior ampliação de uma outra SCC grau II (E, F). No grau III CCS (A, B), a expressão de CCHCR1 é heterogénea: muitos, mas não todos, as células cancerosas expressam tanto CCHCR1 (A) e de Ki67 (B). As inserções mostram menor ampliação de uma mesma região, asterisco assinala uma célula cancerosa com CCHCR1 negativa e expressão Ki67. No grau II SCC (C, D), conseqüência infiltrativa é CCHCR1 positivo (C), e os ninhos de câncer positiva CCHCR1 também são ciclina D1-positivo (D). seções adjacentes de grau II SCC (E, F) mostram associação de CCHCR1 e ciclina D1-células positivas. As setas indicam áreas correspondentes.

Barras de escala:

(A, B, E, F) 12,5 mm; (C, D, inserções) 50 mm.

CCHCR1 é expresso pelas células cancerosas paliçada em BCC

Em BCC, CCHCR1 foi expressa principalmente no citoplasma das células cancerosas paliçada das ilhas de carcinoma bem definidos (Figura 3A, C). Três dos 15 espécimes foram BCC esclerosante, mas CCHCR1 não era mais abundante nos mesmos (dados não mostrados). CCHCR1 foi expressa em um padrão granular em sete amostras (Figura 3A, C) co-localizar com o EGFR (Figura 3B, D). Todas as cinco amostras foram estudadas ciclina D1-positiva: no entanto, a sua expressão não foi tão forte como a do CCHCR1 e mais concentrada para o centro dos ninhos tumorais (dados não apresentados). expressão citoplasmática de CCHCR1 em KCs basal em pele normal à procura adjacente à área de BCC variou entre amostras. expressão do EGFR foi maior em KCs basal da pele normal do que em células em paliçada na maioria das amostras.

As secções em série de BCC (A, B) foram coradas com anticorpos contra CCHCR1 e EGFR. ampliações de A e B também são mostrados (C, D, respectivamente). CCHCR1 proteína é expressa em um padrão granular no citoplasma das células cancerosas em paliçada de uma BCC nodular (A, C). expressão CCHCR1 (C) co-localiza com coloração de EGFR (D). CCHCR1 EGFR e são também expressas em KCs basal (A, B). As setas mostram posições correspondentes.

Barras de escala:

(A, B) 50 mm; (C, D) de 25 um.

Para estudar se CCHCR1 e EGFR co-localizados também a nível celular, que transientemente transfectadas células HaCaT com uma construção CCHCR1 e visualizados CCHCR1 e expressão do EGFR com imunofluorescência. CCHCR1 expressão foi detectada como, um padrão citoplasmático em forma de anel, enquanto que a expressão de EGFR foi mais ou menos ligada à membrana e não se co-localizam com a coloração CCHCR1 (Figura 4A-D). Transfectadas e células não-transfectadas mostrou expressão do EGFR semelhante, sugerindo que CCHCR1 não influencia a expressão do EGFR ou de localização (Figura 4B).

CCHCR1 transfectadas células HaCaT (A-D) coradas com anticorpos contra CCHCR1 (A) e EGFR (B). Sobreposição de A e B é mostrado em (C) e coloração com DAPI mostrando núcleos em (D). As células que expressam CCHCR1 (verde) também foram positivos para EGFR (vermelho), mas as duas proteínas não co-localizar-(C). CCHCR1 positiva (seta) e negativa (cabeça de seta) células exibem expressão de EGFR semelhante sugerindo que CCHCR1 superexpressão não afeta a expressão de EGFR (B).

expressão CCHCR1 em keratoacanthomas está associada a infiltração de linfócitos

Queratoacantoma (KA), histologicamente uma neoplasia maligna, mas se comportando de uma forma benigna, é muitas vezes considerado uma lesão “precursor” a SCC. KAs geralmente mostrou coloração CCHCR1 positiva especialmente em KCs da fronteira empurrando em áreas com um infiltrado de linfócitos proeminente em torno do tumor (Figura 5A, C). As células EGFR-positivo estavam presentes nas mesmas áreas nas amostras estudadas (Figura 5B, D). Na área positiva do CCHCR1, expressão Ki67 também foi encontrado em todas as três amostras, mas com menor intensidade do que em CCEs (Figura 5E, F).

Cortes seriados de KA (A, B, E, F) foram coradas com os anticorpos contra o EGFR e CCHCR1 (a, B) ou contra Ki67 CCHCR1 e (e, F). ampliações de A e B são mostradas (C, D, respectivamente). A fronteira de um empurrando KA é CCHCR1 positivo (A) co-localizar com o EGFR (B). Outro exemplo é mostrado (E) com um infiltrado de linfócitos proeminente e expressão CCHCR1 citoplasmática das células de fronteira empurrando. expressão de Ki67 mais escassos (M) é definido para as mesmas áreas, mas não necessariamente para as mesmas células. As setas indicam posições correspondentes.

Barras de escala:

(A, B, E, F) 50 mm; (C, D) de 12,5 mm.

doença de Bowen e queratoses actínicas expressar CCHCR1 em áreas espongióticas e inflamatórias

Espongiose, infiltrado inflamatório e proliferação capilar foram associados com a expressão CCHCR1 em 11 /21 doença de Bowen (SCC in situ) amostras (Figura 6A, B). Áreas sem inflamação e espongiose expressaram menos CCHCR1 (Figura 6C), nem foi CCHCR1 expressão associada com KC atipia. Na doença de Bowen, coloração citoplasmática CCHCR1 foi encontrado basalmente e suprabasally em papilas dérmicas (Figura 6B) assemelha-se a coloração da pele lesionada CCHCR1 psoriática (Figura 6E), especialmente em amostras hipertróficas. Também expressão do EGFR na doença de Bowen se assemelhava ao padrão de CCHCR1 (Figura 6D) expressão. Na psoríase, expressão CCHCR1 foi mais intensa em áreas com menos KCs positivos Ki67 (Figura 6F). Oito dos 11 estudados espécimes queratose actínica (AK) tiveram CCHCR1 basal positivo ou suprabasal KCs (Figura 6G). células positivas CCHCR1 foram frequentemente encontrados em regiões com espongiose ou inflamação.

Secções de doença de Bowen (A-D) imunocoradas com anticorpos contra EGFR e CCHCR1 como indicado. Cortes seriados de psoríase (E, F) foram coradas com anticorpos para CCHCR1 e Ki67. Amostras AK (G, H) foram coradas com anticorpos CCHCR1. Na doença de Bowen (A, B), espongiose, infiltrado inflamatório, e proliferação capilar estão associados com a expressão CCHCR1 enquanto que as áreas sem inflamação e espongiose expressar menos CCHCR1 (C). expressão de EGFR (D) no basal e suprabasal KCs de associados papilas dérmicas com a expressão CCHCR1 (B). Também na psoríase (E), CCHCR1 é expresso basalmente ou suprabasally (setas) que se sobrepõe à papilas dérmicas (DP), enquanto cristas epiteliais (rr) que se projecta para dentro da derme são quase negativo para CCHCR1. Em contraste, a expressão de Ki67 (F) se localiza regiões que são quase negativa para células CCHCR1 (pontas de seta). Amostras AK (G) expressar CCHCR1 basally e suprabasally em associação com a KC heterogeneidade, espongiose ou inflamação mas as áreas adjacentes com menos inflamação ou espongiose (H) mancha única fracamente.

Barras de escala:

(A-D) 50 mm; (E, F) 25 uM; (G, H) 12,5 mm.

A expressão de CCHCR1 é regulado para cima e se correlaciona com a expressão Ki67 em linhas de células SCC cutâneas

Em seguida, compararam os perfis de CCHCR1 expressão de mRNA , EGFR, Ki67, e ciclina D1 em diferentes linhas de células SCC cutâneas (cinco primário e metastático três), através da realização de experiências de Affymetrix. O perfil de expressão baseado oligonucleótido microarray mostrou que o gene é expresso em CCHCR1 células SCC (Figura 7A). Os níveis de sinal dos conjuntos de sondas CCHCR1 eram até 80% mais elevada nas linhas de células SCC cutâneas (n = 8) do que no epidérmico humano normal KCs (n = 5), mas não se verificaram diferenças significativas nos níveis de expressão CCHCR1 entre o primário e linhas SCC metastático. Os níveis de expressão em linhas de células SCC foram variáveis, mas os níveis médios mostraram um ligeiro aumento (30%; p 0,05) quando comparado com KCs normal quantitativo em tempo real de RT-PCR (TaqMan) (Figura 7C). Os níveis de sinal dos conjuntos de sondas Ki67 foram 3-4 vezes mais elevadas em linhas de células do que no SCC KCs epidérmicos normais (Figura 7A). Esta observação foi também confirmada por TaqMan PCR (Figura 7D). Importante, os níveis de expressão CCHCR1 correlacionada com os níveis de Ki67 nos dados de microarray (Figura 7B). Uma ligeira correlação (r = 0,46) entre os níveis de ARNm CCHCR1 e Ki67 foi observado nos dados TaqMan assim (Figura 7E). Os níveis de expressão de ARNm de EGFR nas linhas de células SCC-se entre 80% e 180% dos níveis normais de expressão KC em 4 de 8 conjuntos de sondas (Figura 7A). Ambos os conjuntos de sondas de ciclina D1-se presentes em todas as linhas celulares e os níveis de sinal médias eram até 60% mais elevada nas linhas de células SCC, em comparação com KCs normal. CCHCR1 teve uma ligeira correlação negativa com o nível de expressão do EGFR, mas não foi detectada nenhuma correlação entre CCHCR1 e ciclina D1 (dados não mostrados).

A) Ki67, EGFR, ciclina D1 e CCHCR1 perfil de expressão do gene cinco epidérmico normal, KC e oito linhas de células SCC cutâneas (HeatMap). Os valores de sinal de os conjuntos de sondas foram comparados com os valores médios de sinal de cada sonda definida na KCs. O corante baseia-se nos valores de log2 da alteração dos valores de sinal. Os genes regulados positivamente são mostrados em vermelho e genes regulada para baixo são mostrados em verde. foi calculado B) Correlação entre CCHCR1 e conjuntos de sondas Ki67 entre os valores do sinal de um CCHCR1 e uma sonda Ki67 definidas no HG-U133 Plus 3.0 array. Pearson coeficiente de correlação R = 0,88. C) e D CCHCR1) os níveis de expressão de ARNm de Ki67 em linhas celulares normais SCC KCS e cutâneas como medido por qRT-PCR (TaqMan). Os níveis de expressão de Ki67 CCHCR1 e nas linhas de células normais e KCS SCC foram analisados ​​por qRT-PCR e corrigidas para os níveis de ARNm de p-actina das mesmas amostras. foi calculado E) Correlação entre CCHCR1 e conjuntos de sondas Ki67 entre os valores de sinal de níveis CCHCR1 e mRNA Ki67. de Pearson = 0,46.

ácido ocadaico e menadione coeficiente de correlação R regular negativamente a expressão do mRNA CCHCR1 em células HaCaT

A fim de determinar se os agentes bioactivos diferentes alterar a expressão de mRNA CCHCR1, nós tratados células HaCaT culturas com promotores de tumor, indutores de estresse oxidativo e os agentes envolvidos na inflamação psoriática. ácido ocadaico (OA) e menadiona, ambos os compostos mostrados para promover tumores in vivo e induzir o estresse oxidativo, regulada negativamente os níveis de mRNA CCHCR1 em células HaCaT até 10 vezes com o aumento da dose (OA) e 3 vezes (menadiona) (Figura 8A) . EGFR e de ARNm de Ki67 níveis de OA e menadiona tratada células HaCaT foram reprimidos assim (Figura 8B, C). Menadiona ou OA tratamentos essencialmente não altera a expressão do gene GAPDH casa mantendo-se em células HaCaT, o que sugere que estes agentes não afectou a viabilidade das células. Os promotores de tumor 12-forbol-13-miristato-acetato (PMA) e estaurosporina ou o tamoxifen anti-estrogénio, H

2O anisomicina

2 produzindo o stress oxidativo, a leptina, a IL-6 ou endotoxina B de estafilococos, activina ou , não influenciou significativamente os níveis de mRNA CCHCR1 (dados não mostrados).

CCHCR1 (a), Ki67 (B), e os níveis de expressão de ARNm de EGFR (TaqMan) em células HaCaT após o tratamento com os promotores de tumor (C) OA e menadiona. CCHCR1 (D), Ki67 (E) e de expressão de ARNm de EGFR (F) em HaCaT, A5, II4, RT3, A431, e FADU células. As células invasivas e II4 FADU e células metastáticas RT3 expressaram menos CCHCR1 (D) e de Ki67 (E) do que as células HaCaT e A5. As células A431 (F) expressam ARNm de EGFR claramente mais do que outras linhas celulares. Os clones transformados pelo ras A5, II4, e RT3 e células FADU expressar EGFR menos do que as células HaCaT. Quantitativas resultados de RT-PCR são mostrados em relação aos níveis de ARNm a partir de células de controlo (atribuído o valor 1) correspondente. Os níveis de expressão de CCHCR1, Ki67, e EGFR em células HaCaT foram normalizadas para os níveis de ARNm de GAPDH nas mesmas amostras. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

CCHCR1 é regulada negativamente nas linhas celulares de tumores mais agressivos

Para aprofundar o estudo do papel da CCHCR1. na transformação KC, comparou-se a expressão do mRNA CCHCR1 em linhas de células com diferentes metastático e propriedades invasivas. Com base em TaqMan quantitativa de RT-PCR, e Ki67 CCHCR1 níveis de expressão foram semelhantes em linhas celulares imortalizadas HaCaT transformadas com Ras e tumorigénico A5 (Figura 8D, E). No entanto, com tumorigenicidade ascendente em ras-transformação, II4 invasivo e células metastáticas RT3 expressaram menos mRNA CCHCR1, e esta tendência também foi observada com células A431 malignas (Figura 8D). Do mesmo modo, as células que são FADU mais invasiva do que HaCaT e células A431 [13] expressaram menos CCHCR1, Ki67, e EGFR (Figura 8D-F). Também Ki67 e expressão EGFR diminuiu com ras-transformação (Figura 8E, F). Interessantemente, as células A431 foram as únicas células que expressam o EGFR significativamente mais do que as células HaCaT (Figura 8F), Ki67 e CCHCR1 expressão restante a um nível mais baixo (Figura 8D, E).

CCHCR1 expressão de ARNm é regulada negativamente quando queratinócitos está em um estado de proliferação rápida

para estudar a expressão de ARNm em células HaCaT CCHCR1 imortais mas não tumorigénicas de diferentes fases proliferativas, foram realizadas experiências de cultura de células de acordo com a estratégia de Pivarcsi et ai. [14]. Nas nossas experiências, as células confluentes HaCaT (controlos) e células confluentes depois de um período de fome 1-semana (células forçados a quiescência) expressa CCHCR1 mais do que as células HaCaT estimuladas a proliferar pela adição de soro para uma subcultura não confluentes (Figura 9A). expressão CCHCR1 diminuiu especialmente durante os primeiros quatro dias. O estado de proliferação das células (como confirmado por expressão de ARNm de Ki67) correlacionado negativamente com a expressão CCHCR1 (Figura 9B): diminuição na expressão CCHCR1 foi associada com aumento da expressão de Ki67. À medida que as células reattained confluência, a expressão de CCHCR1 voltou a aumentar para o nível original (Figura 9A). Uma das quatro experiências foi feita usando números ainda mais baixos de células. Aqui demonstramos uma proliferação intensa durante os primeiros pontos de tempo (24 h e 48 h) como a expressão relativa de ARNm de Ki67 aumentou 6 vezes em comparação com células de controlo (dois conjuntos de células de controlo que dão os dois valores em torno de valor 1). A correlação negativa da expressão CCHCR1 com expressão de Ki67 foi ainda mais profundo como ARNm CCHCR1 relativa ao mesmo tempo diminuído perto de zero a partir dos dois valores das células de controlo em torno de um valor (Figura 9D). Curiosamente, os níveis de mRNA EGFR seguido o padrão de expressão CCHCR1 em vez de padrão de expressão Ki67 (Figura 9C, E). Ao forçar as células HaCaT para diferenciar com médio-alto de cálcio, a expressão de CCHCR1 permaneceu inalterada, conforme medido com TaqMan PCR (dados não mostrados), concordando com os nossos dados anteriores de que os níveis de ARNm CCHCR1 eram não alterado em KCs normal, diferenciada [1]. Involucrina foi usada como um marcador de diferenciação para confirmar o estado de diferenciação das células HaCaT por administração de cálcio [15].

A) A expressão relativa de ARNm CCHCR1 (como medido por TaqMan) em diferentes pontos no tempo (de 24 h 8 d) depois de soltar as células de fome soro e cultura de alta densidade. Expressão de CCHCR1 não diferiu entre as células (controle) confluentes e células de repouso (em jejum). As células de controlo expressas CCHCR1 2,5 vezes mais do que as células HaCaT proliferativa (24-48 h, 3-4 d). Como foi reattained confluência (8 d), a expressão de CCHCR1 aumentada para o nível das células de controlo. B) Correlação entre CCHCR1 relativa e os níveis de expressão de Ki67. Quando os níveis de expressão de mRNA CCHCR1 foram comparados com os de Ki67, uma correlação negativa foi visto, o que confirma o estado proliferativo das células HaCaT. expressão C) ARNm de EGFR correlacionada com a expressão de ARNm CCHCR1. D) Correlação entre CCHCR1 e expressão Ki67 no experimento com menor densidade celular. A correlação negativa de expressão CCHCR1 com expressão Ki67 foi ainda mais profunda quanto mRNA CCHCR1 relativa diminuiu perto de zero nas duas células controle. E) Correlação entre CCHCR1 e expressão EGFR no experimento com menor densidade celular. Aqui, novamente, a expressão CCHCR1 correlacionada com a expressão de EGFR. resultados de TaqMan PCR estão apresentados em relação aos níveis de ARNm a partir de células de controlo correspondentes atribuído o valor 1. Os níveis de expressão de CCHCR1, Ki67, e EGFR em células HaCaT foram normalizadas para os níveis de ARNm de GAPDH nas mesmas amostras. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Discussão

Os resultados aqui apresentados mostram que CCHCR1, um gene candidato para a psoríase, foi expressa. na maioria dos SCCs, CBCs e KAs estudados, o que sugere que CCHCR1 pode ter um papel importante não só na proliferação KC mas também na transformação. expressão do EGFR correlacionada com a expressão CCHCR1, e ciclina D1, um alvo a jusante de EGFR e um regulador positivo da progressão do ciclo celular [16], foi também encontrada expressa nas mesmas áreas. Na epiderme normal, ambos o EGFR e CCHCR1 são expressos basalmente [4], [8] (Figura 1). A expressão de EGFR, “um factor de sobrevivência para as células de tumor”, é ainda considerada como sendo necessária para manter KCs num estado proliferativo [8]. Postulamos que EGFR podem regular a expressão CCHCR1 como demonstramos recentemente que a estimulação EGF regula positivamente a expressão da proteína CCHCR1 [2]. Nossos experimentos aqui com células HaCaT transfectadas sugeriu que a superexpressão de CCHCR1 não regula a expressão de EGFR.

De acordo com nossas descobertas, KCs transformados têm um estatuto CCHCR1 diferente em relação ao marcador de hiperproliferação estatuto Ki67, em comparação com os não-tumorigénico KCs. Distinto do benigna psoríase distúrbio hiperproliferativo ([1]; Figura 6E-F), expressão do marcador de hiperproliferação de Ki67 foi aqui demonstrada nas mesmas áreas que expressão CCHCR1 na frente invasiva de CCEs. Nós mostramos anteriormente que em adenocarcinomas da mama e do pulmão, as células positivas são CCHCR1 Ki67 negativo [1] mas desta discrepância pode ser devida a diferenças entre as células de adenocarcinoma e SCC ou o órgão local do cancro. A correlação positiva com CCHCR1 e expressão Ki67 em cancros da pele foi apoiado pelo perfil de linhas de células SCC cutâneas expressão. No entanto, não houve correlação negativa com CCHCR1 e expressão do EGFR nestas mesmas linhas celulares, bem como nas células tumorais invasivas FADU [17], sugerindo que a transcrição do EGFR foi inibida. No entanto, isto pode refletir diferentes EGFR variantes estudadas, uma vez que a sonda específica para a variante 2 parecia ser mais reprimidos do que a variante 1 ou sondas que reconhecem todas as variantes.

Apesar CCHCR1 positiva e expressão Ki67 in vivo em câncer de pele e em Affymetrix ensaio de linhas de células CCS, que mostram que os ARNm CCHCR1 e Ki67 são regulados negativamente em células cultivadas com transformação ascendente e também em células não tumorigénicas HaCaT tratados com compostos que promovem tumores in vivo. RT3 e metastático células invasivas II4 expressa CCHCR1 e Ki67 inferior a tumorigénico A5 e células imortalizadas HaCaT, o que sugere que CCHCR1 e expressão de Ki67 aumenta inversamente com o nível de ras-transformação. Do mesmo modo, a expressão do EGFR foi regulada negativamente em todas as células transformadas com Ras, mesmo em células A5. ARNm CCHCR1 também foi diminuída nas células invasoras FADU comparação com A431 correlacionando-se com a regulação positiva de EGFR a partir de células A431 FaDu. elevada expressão do EGFR em células A431 em comparação com células FADU está de acordo com estudos anteriores [17]. Além disso, em CCEs, a imunocoloração CCHCR1 foi heterogênea em células atípicas – muitas células atípicas também eram desprovidas de Ki67

Os promotores de tumor OA e menadione subregulado a expressão de CCHCR1, Ki67 e EGFR mRNAs em células HaCaT.. OA inibe fosfatases de proteína serina /específicas de treonina, incluindo proteínas fosfatases 1, 2A, e PP3 [18] e activa /2, JNK e p38 MAPK vias celulares ERK1 de sinalização e os factores de transcrição AP-1 [19] – [21] Para além a activação de Akt-1, um pró-sobrevivência de serina-treonina-quinase [22]. Menadione inibe a tirosina fosfatases de proteínas ativadoras ErbB2 que está sobre-expressos em BCC e reprimidos em SCC em relação à epiderme normal [23]. Curiosamente, a actividade de EGFR tem sido implicado na carcinogénese induzida por OA e activação induzida por menadiona ErbB2 [24], [25]. Além disso, o EGFR tem sido relatado para activar ERK1 /2 e Akt no CEC [10].

A radiação ultravioleta é um dos factores mais importantes que predispõem para o cancro da pele e também é conhecida para activar EGFR [9]. Nós não detectaram alterações significativas nos níveis de mRNA CCHCR1 em células HaCaT cultivadas por vários períodos após a radiação UVA /UVB (Suomela, Latonen e Saarialho-Kere, dados não publicados). Não foi possível demonstrar qualquer efeito de H

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2 (o stress oxidativo produzindo) sobre a expressão de ARNm CCHCR1 quer, ainda que também OA, bem como menadiona são conhecidos para induzir a formação de espécies de oxigénio reactivas e peroxidação de lípidos em células imortalizadas linhas de [26], [27], o que sugere que o stress oxidativo não estava envolvido na interacção da OA e CCHCR1.

Finalmente, foi demonstrado que em células HaCaT, a expressão CCHCR1 diminuiu com a proliferação, de acordo com a nossa anterior relatórios [1], [3], [4]. Após provocando proliferação de células HaCaT, como descrito anteriormente [14], o mais proliferativa, as células não tumorigénicas HaCaT foram, a menos CCHCR1 foi expressa. Curiosamente, a expressão de ARNm de EGFR seguido da expressão de mRNA que CCHCR1 em vez de expressão de Ki67, sugerindo um efector a montante comum nas vias de sinalização. Não podemos, no entanto, neste cenário excluem o efeito de confluência celular sozinho na expressão CCHCR1 como também afeta a proliferação de células HaCaT.

A transformação maligna de psoriática lesional KCs é muito raro, apesar da proliferação descontrolada KC e co -Existência de inflamação crônica. A razão para a proteção contra o desenvolvimento de câncer permanece incerto. Reduzidos níveis de AP-1 em KCs psoríase têm sido sugeridos como uma explicação [28], [29]. AP-1 via mediada também está envolvido na activação de EGFR levando a hiperproliferação KC [5]. Quando os ratinhos transgénicos CCHCR1 risco, com o receptor da vitamina D downregulated [30], foram feridos e PMA-tratadas, a proliferação foi reduzida KC [3], sugerindo que a sinalização menos activo AP-1 ou STAT3. Além disso, a vitamina D, uma droga utilizada no tratamento de psoríase, regula negativamente EGFR e ciclina D1-[31]. CCHCR1 também tem sido proposta para regular a migração da polimerase de ARN II subunidade 3 (RPB3) [32], que activa o factor de activação de transcrição 4 (ATF4 ou CREB2) [31] associar-se com a paragem do crescimento [34], [35] e sendo capazes de formar heterodímeros com os membros da família de AP-1. O presente estudo implica que CCHCR1, um gene candidato para a psoríase, tem uma função na biologia KC também na transformação maligna. [14].