Abstract

Eicosanóides são mediadores lipídicos bioativos derivados do ácido araquidônico

1 (AA), que é liberado pela fosfolipase citosólica A

2 (CPLA ​​

2). AA é metabolizado através de três vias principais, ciclo-oxigenase (COX), lipoxigenase (LO) e citocromo P450, para produzir uma família de eicosanóides, os quais individualmente têm demonstrado ter actividade pro- ou anti-tumorigénico em cancro. No entanto, a progressão do câncer provavelmente depende de mudanças complexas em vários eicosanóides produzidos por células cancerosas e por microambiente do tumor e uma análise sistemática do espectro de eicosanóides em câncer não tenha sido realizada. Utilizou-se cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa tandem (LC /MS /MS) para quantificar os eicosanóides produzidos durante a progressão do tumor de pulmão em um modelo de murganho imunocompetente ortotópico de cancro do pulmão, em que o carcinoma do pulmão de Lewis (LLC), as células são injectados para dentro dos pulmões de ratinhos singeneicos . A presença de tumor aumentou tanto a produtos de ciclo-oxigenase e a lipoxigenase vias de uma forma dependente do tempo. Comparando tumores cultivados em CPLA

2 knockout vs camundongos selvagens, demonstramos que as prostaglandinas (PGE

2, PGD

2 e PGF

2a) foram produzidos por ambas as células cancerosas e do microambiente tumoral ( TME), mas leucotrienos (LTB

4, LTC

4, LTD

4, LTE

4) produção necessária CPLA

2 expressão no TME. Utilizando citometria de fluxo, que recuperado neutrófilos associados a tumores e 2 tipos de macrófagos associados a tumores a partir de pulmões portadores de tumor e que os seus perfis de eicosanóides definido distintas por LC /MS /MS. A combinação de citometria de fluxo e LC /MS /MS desvenda a complexidade da produção de eicosanóides no cancro do pulmão e fornece uma base racional para desenvolver estratégias terapêuticas que visam selecionar populações de células para inibir a classes específicas de eicosanóides

Citation:. Poczobutt JM , Gijon M, Amin J, Hanson D, Li H, Walker D, et al. (2013) eicosanóide Profiling num modelo ortotópico de câncer pulmonar da Progressão por Espectrometria de Massa Demonstra Produção seletiva de leucotrienos por células inflamatórias do microambiente. PLoS ONE 8 (11): e79633. doi: 10.1371 /journal.pone.0079633

editor: Anthony Peter Sampson, da Universidade de Southampton Escola de Medicina, Reino Unido

Recebido: 20 Agosto, 2013; Aceito: 04 de outubro de 2013; Publicação: 11 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Poczobutt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecido por NIH R01 R01 CA162226 CA108610 P50 CA058187. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Eicosanóides representam uma família de lípidos bioativos produzidos através do metabolismo do ácido araquidônico. O ácido araquidónico (AA) é um ácido gordo poli-insaturado, o qual é incorporado na posição sn-2 dos fosfolipidos da membrana. A família de PLA

2 enzimas hidrolisar fosfolipídios de membrana para produzir ácidos graxos livres e lysophospholipids. Embora várias formas de PLA

2 foram identificadas, citosólica PLA

2-α, designado no presente estudo como CPLA

2, é específico para fosfolípidos contendo araquidonoil, e é a principal enzima envolvida na libertação regulada de AA em resposta a estímulos mitogénicos ou inflamatórias [1]. AA livre pode ser metabolizado através de três vias principais [2]. As ciclooxigenases (COX-1, 2) produzir prostaglandinas, incluindo PGE

2 e PGI

2, bem como os tromboxanos, lipoxigenases produzir ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs) e leucotrienos, e epoxygenases citocromo P450 produzir epoxygenated ácidos gordos (EETs). Mais de 100 espécies de eicosanóides distintas foram identificadas [3]. A maioria destas moléculas são segregadas a partir de células e actuam de uma maneira autócrina ou parácrina através de uma família de receptores acoplados à proteína G [4]. O repertório de eicosanóides produzidos por um tipo particular de célula vai ser regulada através da expressão de enzimas na via, incluindo sintases jusante específicas. Por exemplo, PGE

2 de produção vai ser regulada através da expressão de enzimas de ciclooxigenase, bem como prostaglandinas-sintases E2, enquanto leucotrienos específicos, tais como LTC

4 requerem expressão da 5-lipoxigenase, bem como LTC

4 sintase.

o cancro do pulmão está associado com o maior número de mortes por câncer em homens e mulheres, ressaltando a necessidade de novas abordagens terapêuticas e preventivas [5]. Estudos em uma variedade de cancros, incluindo o cancro do pulmão, têm implicado eicosanóides individuais como mediadores de iniciação do câncer, progressão e metástase. Mais estudados são as prostaglandinas, especificamente PGE

2. Estudos realizados em linhas celulares de cancro demonstraram aumento da produção de PGE

2 mediada através da indução da COX-2 e CPLA

2 a expressão [6] – [8]. A inibição da produção de prostaglandina através bloqueando quer CPLA

2 ou COX-2 inibe o crescimento de células transformadas não-pequenas de cancro do pulmão (NSCLC), e o desenvolvimento de tumores em murganhos, em resposta a agentes cancerígenos químicos [9]. Demonstrou-se que os ratinhos que são deficientes em CPLA

2 (CPLA ​​

2-KO) mostram a inibição da iniciação do tumor de pulmão utilizando um modelo de carcinogénese química [10]. Em contraste, IGP

2, que também é produzida a jusante das enzimas COX, foi demonstrado inibir a iniciação do cancro do pulmão, bem como possuindo efeitos anti-metastáticos [11]. A expressão aumentada de 5- e 12-lipoxigenase também tem sido associada com tumores, incluindo cancro do pulmão [12]. Em contraste, a expressão de 15-lipoxigenase-2 parece ser perdida no cancro do pulmão, e pode desempenhar um papel anti-tumorigénica [13]. produtos de lipoxigenase têm efeitos diretos sobre as células tumorais, mas também são reguladores da angiogênese e pode modificar a função imune [12]. Recentemente ácidos epoxyeicosatrienoic (EETs) produzidos através da via do citocromo P450 têm sido implicados como reguladores de metástase, actuando, pelo menos, em parte através de efeitos específicos de um endoteliais em órgãos distantes [14]. Embora as combinações de inibidores da COX e lipoxigenase têm sido utilizados como agentes terapêuticos e têm mostrado efeitos benéficos em NSCLC [15], ainda não foram examinados os efeitos sobre a metástase. Em adição aos estudos focados em células cancerosas, vários relatórios têm implicado eicosanóides, especificamente PGE

2, como reguladores do microambiente tumoral (TME) [16], [17]. PGE

2 a sinalização através de receptores /EP4 EP3 leva ao recrutamento de fibroblastos de câncer associado [18]. PGE

2, também tem sido demonstrado ser essenciais para promover a formação de linfócitos T reguladores-[19]. Assim, a progressão do câncer é susceptível de envolver mudanças complexas em vários eicosanóides com potencialmente opostas efeitos biológicos. Ambas as células e células do microambiente do cancro são potentes produtoras de eicosanóides, e a progressão do tumor vai depender de uma resposta integrada a um espectro de eicosanóides produzidos numa forma espaço-temporal.

Uma limitação na investigação do cancro do pulmão é a falta de mouse modelos apropriados de câncer de pulmão metastático. Desenvolvemos recentemente um modelo imunocompetentes ortotópico em que as células de cancro de pulmão de murino são directamente implantadas no lóbulo esquerdo de ratinhos singeneicos [20], [21]. Estas células formam um tumor primário, que ao longo de um período de 3-5 semanas metástases para os nódulos linfáticos, bem como o fígado e o cérebro. Utilizando este modelo, que demonstraram que os tumores em crescimento em ratinhos deficientes em globalmente CPLA

2 têm um acentuado prejuízo na progressão e metástase [21]. Uma vez que as células de tumor injectadas expresso de tipo selvagem CPLA

2, estes dados indicam que a produção de eicosanóides por células do microambiente do tumor é crítica para a progressão e metástase do cancro de pulmão. No entanto, não foram definidos os eicosanóides críticos que medeiam estes efeitos.

O advento da análise por espectrometria de massa de lípidos permitiu a medição de vários produtos de eicosanóides a partir de ambas as células e tecidos [22]. Esta técnica permite a determinação quantitativa de um grande número ( 25) de produtos distintos. O objetivo do presente estudo foi aplicar a abordagem de espectrometria de massa para definir sistematicamente mudanças na eicosanóides durante a progressão do câncer de pulmão, e determinar o papel das populações celulares distintas na criação deste perfil. Utilizando o modelo ortotópico imunocompetentes no tipo selvagem e CPLA

2 camundongos knockout somos capazes de avaliar a contribuição do microambiente do tumor para a produção de eicosanóides individuais. Nossos resultados demonstram um padrão de eicosanóides complexo durante a progressão do tumor e identificar células inflamatórias específicas no TME que contribuem seletivamente para eicosanóide produção.

Procedimentos Experimentais

Células

luciferase-expressando Lewis de carcinoma de pulmão de células (LLC-Luc) foram obtidas da ATCC e mantidas em DMEM (Cellgro 19-017 Corning-CV) contendo 10% de soro fetal bovino, penicilina /estreptomicina e G