Abstract

Fundo

Os marcadores séricos representam ferramentas em potencial para a detecção de câncer colorretal (CRC). O objetivo deste estudo foi obter perfis de expressão proteômica e identificar marcadores sorológicos para a detecção precoce do CRC.

Métodos

perfis proteômica de amostras de soro coletadas de 35 voluntários saudáveis, 35 doentes com doença avançada adenoma colorretal (ACA), e 40 pacientes com CCR foram comparados usando a tecnologia Clinprot. Usando ensaios imunoenzimáticos (ELISA), 366 amostras de soro foram adicionalmente analisados, e os estudos de imuno-histoquímica de 400 tecidos foram utilizados para verificar a expressão de cininogênio-1 e seu valor na detecção precoce do CRC.

Resultados

modelos de predição foram estabelecidos entre os três grupos, e cininogênio-1 foi identificado como um potencial marcador para CRC usando a tecnologia Clinprot. ELISAs também detectado no soro significativamente maiores níveis de ACA e os pacientes de CRC 1 cininogênio-comparados aos controles (

P Art 0,05). Além disso, a área sob a curva ROC (AUC) para o soro Cininogênio-1 no diagnóstico da ACA foi de 0,635 (P = 0,003), e para o antigénio carcinoembrionário soro (CEA) foi 0,453 (P = 0,358). A sensibilidade, especificidade e precisão dos cininogênio-1 no soro para o diagnóstico de estágio de Duke A e B CRC foi 70,13%, 65,88% e 67,90%, respectivamente, enquanto que CEA sérico de 38,96%, 85,88% e 63,58%, respectivamente. Além disso, imuno-histoquímica mostrou que a expressão do quininogénio-1 foi significativamente mais elevada nos tecidos e CRC ACA do que na mucosa normal (48,39% vs 15,58% vs 0%,

P

0,05).

Conclusões

Estes resultados sugerem que a tecnologia Clinprot fornece uma ferramenta útil para o diagnóstico da CRC, e cininogênio-1 é um biomarcador de soro potencial para a detecção precoce do adenoma colorretal avançado e CRC.

citação: Wang J, Wang X, Lin S, Chen C, Wang C, Ma Q, et ai. (2013) Identificação de Cininogênio-1 como um biomarcador sérico para a detecção precoce da Advanced Colorectal adenoma e cancro colorectal. PLoS ONE 8 (7): e70519. doi: 10.1371 /journal.pone.0070519

editor: Mitsunobu R. Kano, da Universidade Okayama, Japão

Recebido: 14 de novembro de 2012; Aceito: 25 de junho de 2013; Publicação: 23 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Ciência e Tecnologia Projeto de Planejamento da província de Guangdong (2010B031600098) e Programa de Desenvolvimento Ciência e Tecnologia de Cantão Município (2.060.402). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Estima-se que mais de 143.000 pessoas nos Estados Unidos serão diagnosticadas com cancro colorectal (CRC) em 2012, e mais de 50.000 pessoas morrerão desta doença [1]. Por triagem de indivíduos de risco médio, é a hipótese de que a CRC pode ser detectado em seus estágios iniciais, reduzindo assim as taxas de mortalidade associadas à CRC [2] – [4]. Atualmente, CRC rastreio pode incluir um teste de sangue oculto nas fezes, a sigmoidoscopia, colonoscopia e [5]. Em muitos países de recursos limitados, o teste de sangue oculto nas fezes é utilizado principalmente, apesar da sensibilidade insuficiente deste ensaio [6], [7]. Além disso, com a sigmoidoscopia e sendo procedimentos invasivos e inconvenientes colonoscopia, o seu pedido de exames de CRC tem sido limitada [8]. Portanto, abordagens menos invasivas e não invasivas são necessários para melhorar a sensibilidade e a adesão do paciente em rastreios de CRC.

A identificação de biomarcadores sorológicos específico para CRC poderia fornecer um método relativamente não invasivo e economicamente vantajoso para a detecção da CRC em comparação com opções de rastreio atuais. No entanto, o soro é um fluido corporal complexa que contém muitas proteínas diferentes. Por exemplo, mais de 10.000 diferentes proteínas foram detectadas em soro humano, e muitas proteínas que são segregadas pelas células ou derramado durante diferentes processos fisiológicos ou patológicos [9], [10]. Portanto, é difícil identificar um marcador do soro específicos de doença. Devido aos avanços nas metodologias proteômicas, é agora possível identificar rapidamente novos marcadores candidatos para o câncer. Por exemplo, vários estudos demonstraram a capacidade para corte com dessorção /ionização por espectrometria de matriz assistida por tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF-MS) para separar misturas complexas de proteínas, facilitando assim uma comparação das variações na expressão da proteína para o normal e As amostras de soro cancerosas [11] – [13]. Em particular, a tecnologia, Clinprot, que se baseia em MALDI-TOF-MS, tem muitas vantagens para a aplicação clínica, incluindo a sua sensibilidade, a facilidade de utilização, e a capacidade para análise de elevado rendimento [14], [15].

Usando MALDI-MS, Seraglia

et al.

[16] relatado anteriormente cininogênio-1 para ser um potencial novo marcador de plasma para CRC. Cininogênio-1 é uma proteína multifuncional que desempenha um papel importante em muitos processos patofisiológicos [17], incluindo a fibrinólise, trombose, inflamação e, bem como tendo um papel na oncogénese [18]. Para confirmar estes resultados e para identificar marcadores romance plasma adicionais para CRC, os soros de pacientes com CCR, doentes com doença avançada adenoma colorrectal (ACA), e indivíduos saudáveis, foram analisados ​​usando a tecnologia Clinprot, ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), e imuno-histoquímica.

Materiais e Métodos

Seleção de Pacientes

Todas as amostras foram coletadas a partir do Hospital Nanfang. Os soros foram recolhidos entre 1 de Outubro de 2009 e 31 de dezembro de 2010. Os tecidos parafina-encaixadas foram coletados entre 1 de Abril de 1999 e 31 de dezembro de 2007. Os pacientes com uma história conhecida de polipose adenomatosa familiar, sem polipose câncer colorretal hereditário, hipertensão, qualquer outra tumores e doenças inflamatórias evidentes, foram excluídos. Os seguintes fatores foram registrados para cada tecido: a idade do paciente, sexo do paciente, tamanho do tumor, localização do tumor para CRC e ACA, histologia do tecido e grau do tumor para neoplasia intra-epitelial para ACA, a diferenciação, a etapa de Duke, e tumor-nódulo-metástase (TNM) fase (7ª ed) para CRC. pacientes adenoma colorretal tendo pelo menos um adenoma ≥10 mm, ou com uma estrutura das vilosidades ou carcinoma

in situ

, foram classificados como pacientes ACA [19].

Este estudo foi realizado de acordo com orientações éticas institucionais e foi aprovado pelo Comitê de Ética médica da Universidade de Southern Medical (# 2011119). formulários de consentimento informado por escrito foram obtidas de todos os pacientes.

Preparação de amostras

Sera foram coletadas de voluntários saudáveis, os pacientes ACA, pacientes com CCR pré-operatórios (antes de qualquer tratamento clínico obtidos), e pós-operatório pacientes CRC (obtido sete dias após a cirurgia). Para a análise Clinprot, um total de 110 amostras de soro foram obtidas a partir de voluntários saudáveis ​​(n = 35), pacientes ACA (n = 35) e pacientes de CRC pré-operatórios (n = 40). Para os testes ELISA, um total de 366 soros foram obtidos a partir de um adicional de 85 voluntários saudáveis, de 80 pacientes, 143 pacientes ACA CRC pré-operatórios, e 58 pacientes de CRC pós-operatórias. Voluntários assintomáticos e aparentemente saudáveis ​​foram selecionados que não têm uma história prévia de câncer. Todas as amostras foram recolhidas em tubos de 5 ml separadores de soro, e depois foram incubadas à TA durante 30 min. Após a centrifugação a 3000 rpm durante 10 minutos, os soros foram distribuídos em alíquotas de 50 jil e armazenados a -70 ° C até ser necessário.

Um total de 400 tecidos embebidos em parafina foram analisados ​​por imuno-histoquímica, incluindo a mucosa colorrectal normal de 75 tecidos que foram coletadas de voluntários saudáveis ​​que foram submetidos a uma biópsia da mucosa endoscópica. Além disso, 77 ACA tecidos foram coletadas de pacientes ACA submetidos à ressecção endoscópica, e 248 tecidos CRC foram coletadas de pacientes de CRC que foram submetidos a cirurgia. Todas as amostras foram fixadas em solução de formalina a 10% e embebidos em parafina. Secções (4 mm) foram cortadas e preparadas para os ensaios de coloração de imuno-histoquímica e hematoxilina-eosina.

Extracção de peptídeos a partir de soro utilizando esferas magnéticas, seguido por MALDI-TOF-MS Analysis

peptídeos de soro eram separado e purificado utilizando um kit de purificação de catiões fraca de cromatografia de troca com base em esférulas magnéticas (Bruker Daltonics GmbH). Um total de 110 amostras de soro foram fraccionados de acordo com o protocolo padrão proposto pelo fabricante. rigoroso controle de qualidade foi mantida para garantir a precisão e reprodutibilidade dos resultados obtidos. perfis de péptidos de soro foram subsequentemente analisados ​​utilizando um /TOF-MS Ultraflex MALDI-TOF (Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha). Os espectros foram adquiridos na massa /carga (m /z) gama de 1.000 a 10.000 usando software FlexAnalysis (Bruker Daltonics).

Clinpro software de ferramentas 2.2 (Bruker, Daltonik) foi utilizado para a análise de todos os dados derivados a partir de amostras de soro. Isto incluiu dados brutos obtidos antes do tratamento, subtração de base de espectros, a normalização dos espectros, o alinhamento internas de pico usando picos proeminentes, e um procedimento de pico picking. Além disso, os dados pré-tratados foram visualizados e analisados ​​estatisticamente usando o teste t de Student e algoritmos genéticos (GA). Além disso, os modelos de previsão foram estabelecidos utilizando o GA. Para determinar a precisão dos modelos de previsão gerados, foi realizada a validação cruzada. Resumidamente, todas as amostras foram seleccionadas como um conjunto de treino no algoritmo de classe preditor, em seguida, as mesmas amostras excepto para uma amostra seleccionada aleatoriamente foram utilizadas como um conjunto de teste. Um “teste” foi então realizada dez vezes aleatoriamente.

Peptide Identificação por MALDI-TOF /TOF

Depois de concluir a análise estatística, foram identificados peptídeos diferencialmente expressos. Inicialmente, as massas mono-isotópica de peptídeos na gama de m /z de 1000 a 3000 foram determinadas utilizando um modo de reflexão. Após espectros MS /MS de iões precursoras foram adquiridos no modo TOF /TOF, os dados MS /MS foram submetidas a um banco de dados de busca Mascot para identificar as correspondências proteína de comprimento completo correspondente.

enzyme-linked Immunosorbent Assay ( ELISA)

Todos os soros foram analisados ​​de forma cega e padrões e amostras foram executadas em triplicado. concentrações Cininogênio-1 foram quantificados utilizando um kit ELISA Cininogênio humano (No. EK2001-1, Assaypro, MO, EUA). Resumidamente: (1) 25 ul de padrão ou de amostra e 25 ul quininogénio biotinilado foi adicionado a 96 poços de poliestireno microplacas revestidas com um anticorpo policlonal contra quininogénio humano. Após 2 h à TA, as placas foram lavadas cinco vezes, em seguida, 50 ul de conjugado de estreptavidina-peroxidase foi adicionada a cada poço. Após 30 min à temperatura ambiente, as placas foram lavadas cinco vezes e 50 ul de substrato cromogénio foi adicionado a cada poço. Depois de uma cor azul suficientemente desenvolvida, 50 ul de solução de paragem foi adicionado a cada poço e valores de absorvância a 450 nm foram registados utilizando um leitor de microplacas. Uma curva padrão foi gerada e utilizada para determinar as concentrações de quininogénio-1 presente nas amostras analisadas.

para detectar os níveis de soro de CEA, um kit de imunoensaio enzima disponível comercialmente (Whiga, Cantão, China) foi utilizado de acordo com a as instruções do fabricante.

a imuno-histoquímica

1 Cininogênio-anticorpo foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (SC-25799, CA, EUA). Um protocolo publicado anteriormente foi utilizado para os ensaios de imuno-histoquímica [20], com quininogénio-1 de anticorpo diluído 1:150. Todas as secções foram cega e independente avaliada microscopicamente por dois patologistas bem treinados. A intensidade de coloração foi avaliada utilizando um sistema de pontuação semiquantitativo como se segue: 0, coloração negativa; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; e 3, de coloração forte. A distribuição de coloração também foi graduada de acordo com a percentagem de células coradas presentes na região de interesse: 0, as células positivas constituído 10% das células tumorais; 1, as células positivas constituía 10-50% das células tumorais; 2, as células positivas constituía 50-75% das células tumorais; ou 3, as células positivas constituído 75% de células tumorais. Pontuações para a intensidade e distribuição foram adicionados para fornecer uma pontuação global para cada amostra. negativo Resumidamente, as amostras que receberam zero pontos foram considerados (0), os casos que receberam 1-3 pontos foram considerados fracamente positivo (1+), os casos que receberam 4-7 pontos foram considerados moderadamente positiva (2+), e os casos que receberam uma pontuação final 7 foram considerados fortemente positiva (3+)

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 13.0.. Para testar as diferenças entre os grupos, foi aplicado o teste do qui-quadrado, com a ressalva de que o teste t de Student foi aplicado a idade. Correlações entre os escores de imuno-histoquímica determinados para cininogênio-1 e os parâmetros clínico da coorte foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação de postos de ordem de Spearman. As concentrações de quininogénio-1 e CEA foram encontrados a ter uma distribuição normal. Portanto, esses dados foram comparados usando uma análise de uma via de teste de variância. Em contraste, as comparações múltiplas foram analisadas usando métodos LSD. Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (SEM). Receiver operating characteristic (ROC) foram usadas para determinar os valores de quininogénio-1 no soro e CEA para o diagnóstico de tumores colo-rectais. A Kaplan-Meier (-log rank test) foi utilizado para a análise de sobrevivência. Para todas as análises, um valor P inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Perfis proteômica do ACA e CRC

Soro do Doente

Um total de 110 amostras de soros obtidos a partir de 35 voluntários saudáveis ​​(controles), 35 pacientes ACA, e 40 pacientes com CCR pré-operatórios foram submetidos a Clinprot análise. As principais características clínico-patológicas de pacientes são apresentados na Tabela S1. Os espectros representativos para cada um destes grupos são mostrados na Fig. 1A, e as diferenças em posição e intensidade de pico do pico pode ser observada. Utilizando a análise de MALDI-TOF, foram identificados 70 picos distinguíveis no intervalo de 1000 a 10000 m /z entre amostras de soro a partir de controlos e pacientes ACA, e 43 destes picos foram estatisticamente significativas (P 0,01, detalhes em Materiais S1). Além disso, 61 picos foram distinguidos entre soros de controlo e os soros do paciente CRC, com 54 desses picos sendo estatisticamente significativa (P 0,01, detalhes em Materiais S2)

A:. Espectros de massa Representante do soro de controlo (a ), soro de um paciente com ACA (b), e soro de um paciente com CRC (c). B: MALDI /espectros MS /MS de iões a m /z 1943,95 (a) e m /z 2081,01 (b). Painel c fornece os resultados da pesquisa de banco de dados Mascot, que indicou ambos os picos correspondem a cininogênio-1.

Usando a cada quinta pico, GA foi capaz de gerar modelos de classificação de cross-validado para os diferentes grupos. Os melhores modelos de previsão (detalhes na Tabela 1) atingiram uma capacidade de reconhecimento de 98,96%, 100,00% e 100,00% para comparações de CRC e controle, ACA e controle, e ACA e CRC, respectivamente. Além disso, as estimativas de validade cruzada foram 95,49%, 100,00% e 98,19%, respectivamente.

Identificação do CRC Marcadores

A maior concentração de péptidos com valores m /z 1943 e 2081 foram evidentes em CRC espectros, mas não em espectros de controlo (

P

0,01). Usando MALDI-TOF /TOF-MS e a base de dados Mascot (Fig. 1B), MS /MS de fragmentação destes dois péptidos identificados as seguintes sequências, NLGHGHKHERDQGHGHQ e HNLGHGHKHERDQGHGHQ, respectivamente. Além disso, estes péptidos foram encontrados para representar regiões do mesmo cininogênio-1 precursor, inibidor de proteinase a2-tiol.

concentrações séricas de Cininogênio-1 e CEA para a Grupos Sera diferente

Para validar a expressão de quininogénio-1 detectada em soros de pacientes com CCR, ensaios de ELISA no soro foram realizados utilizando 366 soros obtidos a partir de 85 voluntários saudáveis, de 80 pacientes, 143 pacientes ACA CRC pré-operatórios, e 58 pacientes de CRC pós-operatórias. Idade, sexo, soro cininogênio-1 concentrações e concentrações de CEA entre os diferentes grupos foram apresentados na Tabela 2. As concentrações médias de cininogênio-1 detectados nos controles e pacientes com CCR pré-operatórios foram 153,22 ± 8,43 mg /ml e 215.62 ± 7,63 mg /ml, respectivamente, com o último sendo significativamente maior (

P =

0,000). Além disso, os níveis de cininogênio-1 foram significativamente menores nos pacientes com CCR após a cirurgia (188,04 ± 11,70 mg /ml;

P =

0,044). Para pacientes ACA, a média Cininogênio-1 foi detectada concentração 194,26 ± 10,14 pg /mL, que foi significativamente maior do que a do grupo de controlo (

P = 0,003

). Em contraste, não houve diferença significativa entre cininogênio-1 concentrações detectadas em pacientes com CCR pré-operatórios e pacientes ACA (

P =

0,082).

Para concentrações séricas CEA, os níveis de pré-operatório pacientes de CRC, os pacientes de CRC pós-operatórias, pacientes ACA, e controlos foram 14,66 ± 2,25 ug /l, 4,48 ± 0,72 ug /l, 3,10 ± 1,15 ug /L, e 2,43 ± 0,28 mg /L, respectivamente (ACA

vs.

controle saudável,

P = 0,797

;.. CRC

vs controle

saudável,

P =

0,000)

valor diagnóstico da Serum Cininogênio -1 e CEA para colorectal tumores

para avaliar o valor diagnóstico da cininogênio-1, foi realizada uma análise da curva ROC. Como mostrado na Fig. 2 AA, a área sob a curva ROC (AUC) para o soro Cininogênio-1 em associação com um diagnóstico de ACA foi 0,635 (Cl 95%: ,551-,719, P = 0,003), enquanto que a AUC associada com um diagnóstico de CRC foi 0,706 (IC 95%:. ,635-,777, P = 0,000; Fig 2 Ac). Com base nessas curvas ROC, um soro cininogênio-1 concentração de 162.99 ng /ml foi selecionado como o valor de corte ideal para diferenciar pacientes e controles ACA, com sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, e as taxas de precisão sendo 51,25%, 63,53 %, 56,94%, 58,06% e 57,58%, respectivamente. Da mesma forma, um soro cininogênio-1 concentração de 173,96 ug /ml foi selecionado como o valor de corte ideal para diferenciar pacientes e controles CRC, com a sensibilidade associada, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, e as taxas de precisão, sendo 63,64%, 65,88%, 75,83%, 51,85% e 64,47%, respectivamente

a:. a curva ROC para o soro cininogênio-1 (a) e CEA (b) para o diagnóstico de ACA, e a curva ROC para o soro kininogen- 1 (c) e CEA (d) para um diagnóstico de CRC. B: uma comparação da sensibilidade (Se), especificidade (SP), valor preditivo positivo (VP +), valor preditivo negativo (PV-) e precisão (Ac) as taxas para detecção de cininogênio-1 e CEA para o diagnóstico de Duque de fase A e b CRC (a) ou a fase C do duque e D CRC (b)

A AUC para CEA sérico como um diagnóstico da ACA foi 0,459 (IC 95%:. 0,370-0,547, P . = 0,358; Figura 2 Ac), e como um diagnóstico de CRC foi 0,695 (Cl 95%: 0,627-0,767, P = 0,000; Figura 2 Ad).. O valor de corte amplamente aceite de 5 ug /L de soro para CEA foi usado neste estudo uma vez que o valor limite calculado a partir da curva ROC foi de 5,095 ug /L. Portanto, usar este valor de corte para diferenciar pacientes com CCR e controles, a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, e as taxas de precisão foram encontrados para ser 38,46%, 85,88%, 82,09%, 45,34% e 56,14%, respectivamente. Assim, CEA foi associada com menores taxas de sensibilidade e precisão em comparação com cininogênio-1.

Os acima mencionados cinco parâmetros também foram utilizados para avaliar cininogênio-1 e detecção CEA para o estágio de um duque e os pacientes B CRC. Para cininogênio-1, as taxas foram de 70,13%, 65,88%, 65,06%, 70,88% e 67,90%, respectivamente. Para o CEA, as taxas foram 38,96%, 85,88%, 71,43%, 60,83% e 63,58%, respectivamente. Excepto para a especificidade e os valores preditivos positivo, os valores dos outros parâmetros associados com quininogénio-1 foram melhores do que aqueles para o CEA (Fig. 2 B). Quando os pacientes fase C e D CRC de Duke foram analisados, as acima mencionadas cinco parâmetros para quininogénio-1 foram 72,73%, 65,88%, 62,34%, 75,68% e 68,87%, respectivamente, e para o CEA, foram 34,85%, 85,88%, 65,71 %, 62,93% e 63,58%, respectivamente. Semelhante à fase A do Duque e os pacientes B CRC, os parâmetros para cininogênio-1, com excepção de especificidade e valores preditivos positivos, foram melhores do que aqueles para CEA (Fig. 2 Bb). Além disso, a sensibilidade, valor preditivo negativo e taxas de precisão foram melhorados quando os pacientes CRC teve um resultado positivo para cininogênio-1 no soro e /ou CEA soro. Em contraste, as taxas de especificidade associados a esses testes positivos diminuiu substancialmente (Tabela 3).

Os níveis de expressão de Cininogênio-1 em Normal Colorectal Mucosa, ACA tecidos, e CRC tecidos

Cininogênio -1 pode ser detectado no sangue sob condições fisiológicas. No entanto, não fica claro se os níveis mais elevados de quininogénio-1 detectada no soro de doentes com tumores colorrectais deriva do próprio tumor colo-rectal. Assim, ensaios imuno-histoquímicos foram realizados para avaliar a expressão de quininogénio-1 em tecidos colorrectais. Foram examinados um total de 75 tecidos normais colorectal mucosa, 77 tecidos ACA, e 248 tecidos CRC. Não foi encontrada diferença significativa na expressão de cininogênio-1 entre homens contra mulheres entre os três grupos (

P Art 0,05). Além disso, a imunorreactividade para quininogénio-1 foi encontrada no citoplasma de células ACA e CRC (Fig. 3 A-C), e o nível de quininogénio-1 foi significativamente mais elevada em tecidos de CRC do que em tecidos ACA ou mucosa normal (48,39 %

vs

15,58%

vs

0%,

P Art .. 0,05; A Fig. 3D)

colorações imunológicas representativos de cininogênio-1. em mucosa normal colorretal (a), o tecido ACA (B), e tecido de CRC (C). Ambos visão geral (20 ×) e ampliação (40 vezes) imagens são fornecidas, com este último fornecido como caixas de inserção no canto superior esquerdo de cada painel. D: Quantificação de cininogênio-1 níveis no controle, grupos ACA, e CRC. E: As curvas de sobrevida para o controle, grupos ACA, e CRC. A linha azul representa pacientes com CCR negativos para cininogênio-1 expressão e a linha verde representa os pacientes de CRC positivos para cininogênio-1 expressão.

Correlação de Cininogênio-1 Expression com características clínico-patológicos do ACA e CRC pacientes

As correlações entre níveis cininogênio-1 citoplasmáticos e características clínico-patológicas de ACA e pacientes com CCR foram analisados ​​separadamente. Enquanto acúmulo citoplasmático de cininogênio-1 correlacionou-se negativamente com a histologia do tecido para pacientes ACA (

r

s

= -0,250, P = 0,029), não se correlacionou com a localização do tumor, o tamanho do tumor, ou grau de neoplasia intra-epitelial (todos os

P Art 0,05, detalhes na Tabela S2). Em contraste, o acúmulo citoplasmático de cininogênio-1 significativamente correlacionada com o estado de metástase palco e linfonodo de Duke para CRCs (

r

s

= 0,151, P = 0,018 e

r

s

= 0,128, P = 0,045, respectivamente). No entanto, não se correlacionou com a localização do tumor, o tamanho do tumor, a diferenciação das células tumorais, ou metástases à distância (todo o

P Art 0,05, detalhes na Tabela S3).

Análise de Sobrevivência

pacientes com CCR (n = 110) foram posteriormente analisadas para avaliar uma possível associação entre cininogênio-1 imuno e sobrevida do paciente. Na Figura 3E, a curva de sobrevida de acordo com cininogênio-1 níveis citoplasmáticos é mostrado. O tempo médio de sobrevivência para pacientes de CRC com negativa contra cininogênio-1 expressão positiva foi 45,21 ± 3,17 meses e 38,15 ± 3,07 meses, respectivamente. Assim, pacientes com negativo expressão cininogênio-1 tiveram um período de sobrevivência mais longo do que aqueles com cininogênio-1 expressão positiva, embora a diferença não foi significativa (

P =

0,166).

Discussão

Triagem de adenomas e em estágio inicial CRC diminuiu a incidência ea mortalidade por CRC em os EUA ao longo das últimas décadas [3]. No entanto, métodos de rastreio actuais não fornecem boa sensibilidade. Portanto, os esforços continuam a ser dirigidas para o desenvolvimento de novos marcadores sorológicos de diagnóstico ou de rastreio para CRC. Além disso, os avanços na tecnologia proteómica facilitaram a identificação de novos biomarcadores. Em particular, a tecnologia Clinprot foi encontrada para prover resultados altamente precisos e reprodutíveis, um bom nível de sensibilidade, e é compatível com um formato de elevado rendimento para a rápida identificação de proteínas [21]. Consequentemente, os perfis de proteómica para várias doenças humanas foram obtidos utilizando metodologia Clinprot [22] – [24]. No presente estudo, o protocolo Clinprot fornecida modelos prevendo para CRC e ACA versus controles saudáveis, e também entre ACA e CRC. Além disso, as capacidades de reconhecimento destes modelos foram 98,96%, 100,00% e 100,00%, respectivamente. Assim, Cininogênio-1 foi identificado como um potencial marcador de CRC e ACA, e estes resultados foram validados utilizando ELISA. Tomados em conjunto, estes resultados confirmam a precisão da tecnologia Clinprot.

As evidências acumuladas continua a demonstrar um papel para cininogênio-1 na carcinogênese [25]. Por exemplo, níveis significativamente reduzidos de quininogénio-1 foram detectados na urina de pacientes com carcinoma do ovário, em comparação com sujeitos de controlo [26]. Estudos anteriores também demonstraram que quininogénio-1 exibe propriedades anti-angiogénicas e medeia as acções inibitórias sobre a proliferação de células endoteliais [27]. Além disso, em doentes com cancro, níveis mais baixos de expressão quininogénio-1 foram detectados em amostras de sangue, e estes níveis podem contribuir para a sobrevivência das células cancerosas presentes [28]. No entanto, o papel de quininogénio-1 na carcinogénese, especialmente no CRC, permaneceu obscuro. No presente estudo, os níveis séricos de 1 cininogênio-nos doentes com ACA ou CRC foram encontrados para ser significativamente maior em comparação com os controles saudáveis. É amplamente aceito que a ACA é uma lesão pré-cancerosa da CRC [29]. Assim, um aumento significativo no soro Cininogênio-1 níveis nestes pacientes pode representar um marcador para a detecção precoce de CRC, e isto é consistente com os resultados de Qiu

et ai.

[30]. Embora, em um estudo da expressão quininogénio-1 detectada em 118 amostras de plasma obtidas a partir de pacientes com cancro gastrintestinal, níveis significativamente mais baixos de quininogénio-1 foram detectados [31]. Enquanto isto está em contraste com os resultados do presente estudo, esta diferença pode ser devida a diferenças no tamanho da amostra, recursos de amostra, e o método de detecção utilizado.

As medições dos níveis de CEA foram encontrados como sendo inadequados para rastreios da população devido à falta de sensibilidade deste ensaio nos primeiros estágios de BF, [33] [32]. Um painel da Sociedade Americana de Oncologia Clínica também recomendou contra o teste CEA para o rastreio CRC [34]. Do mesmo modo, os ensaios CEA realizados no presente estudo não mostrou nenhum valor diagnóstico para ACA (AUC = 0,453), e também exibiu uma sensibilidade mais baixa (38,96%

vs.

70,13%) e precisão (63,58%

vs.

67,90%) para a fase de um duque e B CRC, em comparação com cininogênio-1. Estes resultados indicam que os níveis séricos de monitorização quininogénio-1 é mais valioso do que a detecção de CEA nas fases iniciais de CRC. Além disso, quando ambos os níveis séricos de quininogénio-1 e níveis de CEA em pacientes foram monitorizados CRC, a especificidade e valor preditivo positivo de estes resultados melhorados. Portanto, a detecção de quininogénio-1 em combinação com outros marcadores tumorais é recomendado. Além disso, se um paciente for considerada positiva para quininogénio-1 e CEA, mas negativo para a proteína alfa fetal, então é possível que ele /ela sofre de CRC em vez de o cancro do fígado. serão necessários mais estudos para confirmar esta hipótese.

Em pacientes com CCR no pós-operatório, os níveis séricos de cininogênio-1 foram menores do que os de pacientes com CCR pré-operatórios. Embora ainda não está claro por que isso foi observado, é a hipótese de que o aumento da produção de cininogênio-1 deriva de tecidos tumorais. Isto é apoiado pelos resultados obtidos imuno-histoquímica mostrou que quininogénio-1 acumulados no citoplasma das células de tumor colorectal. No entanto, os detalhes mecanicistas deste processo permanecem obscuros. Além disso, o acúmulo citoplasmático de cininogênio-1 significativamente correlacionada com o estatuto de metástases em linfonodos em pacientes com CRC. No entanto, uma análise de sobrevivência de pacientes com CCR de acordo com cininogênio 1-expressão não encontraram nenhuma diferença significativa entre o grupo expressão cininogênio-1 negativo e positivo, indicando o valor prognóstico da cininogênio-1 é limitado.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a relatar a detecção de cininogênio-1 em pacientes ACA e CRC, com a validação por ELISA e imunohistoquímica. Com base nestes resultados, quininogénio-1 parece ser um marcador CRC potencial, o que pode ser valioso para a detecção precoce de CRC, particularmente em combinação com outros biomarcadores em rastreios de população para CRC. Uma análise de pacientes adicionais, incluindo o processamento padronizado das amostras obtidas, é necessária para verificar e expandir os resultados atuais. Além disso, estudos sobre os mecanismos de cininogênio-1 em tumores colorretais são garantidos.

Informações de Apoio

Tabela S1.

As principais características clínico-patológicas de pacientes incluídos na descoberta e validação coortes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s001

(DOC)

Tabela S2. .

Correlação entre cininogênio-1 expressão e características clínico-patológicas de pacientes ACA

doi: 10.1371 /journal.pone.0070519.s002

(DOC)

Tabela S3. .

Correlação entre cininogênio-1 expressão e as características clínico-patológicas de pacientes com CCR

doi: 10.1371 /journal.pone.0070519.s003

(DOC)

Materiais S1.

ClinProt Peak Estatística entre o controle saudáveis ​​e pacientes ACA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s004

(XLS)

Materiais S2.

ClinProt Peak Estatística entre o controle saudáveis ​​e pacientes com CCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s005

(XLS)

Agradecimentos

Os autores agradecem Profs . Yali Zhang Yadong e Wang, por suas sugestões sobre patologia.