Abstract

As diferenças de resultado e recuperação entre os pacientes submetidos a pós-operatória laparoscópica assistida versus cirurgia aberta para o cancro colorectal (CRC) ressecção têm sido amplamente documentada, embora não especificamente para os tumores do lado direito. Nós investigamos as respostas imunológicas às diferentes abordagens cirúrgicas, comparando os dados pós-operatórias em simultâneo obtidos em níveis sistêmicos, locais e celulares. Um total de 25 pacientes e controles do lado direito CRC foram geridas, avaliando -no imediata followup- os parâmetros perioperatórios convencionais e um grande painel de citocinas no plasma, fluidos peritoneal e lipopolissacarídeo (LPS) estimulada por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) culturas de tecidos. Uma melhor recuperação geral de doentes operados com laparoscopia em comparação com um processo convencional, tal como indicado pela análise de parâmetros pré típico e pós-cirúrgicas, foi observada. A avaliação síncrono de 12 citoquinas mostrou que os níveis de plasma pré-operatórios de citocinas pró-inflamatórias de IL-6, IL-8, IL-1, TNFa foram significativamente menores em dadores saudáveis ​​versus pacientes de CRC e que tais diferenças aumentar progressivamente com o estádio do tumor. Após a cirurgia, os IL-6 e IL-8 aumentos foram significativamente maiores em aberto em relação a abordagem laparoscópica somente no CRC em estágios iniciais. Todo o painel de pós-cirúrgica dos níveis de citocinas foram significativamente mais elevados em fluidos peritoneais em comparação com o plasma correspondente, mas sem diferenças significativas dependendo do tipo de cirurgia ou estágio da doença. Em seguida, observou-se que, em comparação com o pré-pós-cirurgia correspondentes derivados estimulado por LPS culturas PBMC, produziram níveis mais elevados de sobrenadante do painel de citocinas todo. Em particular IL-6

in vitro

produção foi significativamente maior em PBMC derivadas de pacientes submetidos à laparoscopia contra intervenção aberta, mas -again- apenas no CRC nas fases iniciais da doença. Nossos resultados mostram, assim, que a laparoscopia em comparação a abrir ressecção direito está associado a um compromission mais curta da homeostase imunológica, principalmente nos estágios iniciais de pacientes de CRC direito

Citation:. Ferri M, Rossi Del Monte S, Salerno G , Bocchetti t, Angeletti S, Malisan F, et al. (2013) Recuperação de imunológica homeostase Positivamente Correlaciona Ambos com Early Stages de direito do cancro colorectal e cirurgia laparoscópica. PLoS ONE 8 (9): e74455. doi: 10.1371 /journal.pone.0074455

editor: Kjetil Tasken, da Universidade de Oslo, Noruega |

Recebido: 26 Abril 2013; Aceito: 01 de agosto de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ferri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do Minstero dell’Instruzione, dell’Università e della Ricerca e de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Itália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o terceiro. causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, cuja terapia padrão permanece a cirurgia [1], [2]. A incidência de direita em comparação com cancros do cólon do lado esquerdo aumentaram durante as últimas três décadas, de modo que, actualmente, os tumores do lado direito representam aproximadamente 50% de todos os cânceres de cólon [3], [4]. Além disso, alguns autores detectaram um prognóstico modestamente melhor no lado esquerdo em comparação com tumores do lado direito, embora este argumento continua a ser assunto de debate [4] – [6]

laparoscópica colectomia segmentar é uma bem estabelecida cirúrgico. técnica que, em comparação com colectomia aberta tradicional, é caracterizada pela menor morbidade, menos dor pós-operatória, a recuperação pós-operatória rápido e uma curta estadia no hospital, mesmo que ambos os métodos são associados à mesma cirurgia radical [7], [8]. No entanto, embora os benefícios de curto prazo de laparoscopia em comparação com a cirurgia aberta convencional são agora bem reconhecido na gestão das diferentes doenças colorretais, esta continua a ser uma questão controversa para os tumores do lado direito [9], [10].

é agora geralmente aceite que a extensão do trauma cirúrgico influencia a resposta inflamatória aguda [11], que por sua vez pode ser responsável não apenas para complicações possíveis (tais como infecções e adesões abdominais longo prazo) [12], mas também para a formação de metástases de tumor [9], [13], [14]. Apesar de apenas poucas e discutíveis dados sobre a recuperação pós-operatória da homeostase imune em pacientes com CCR foram publicados, é agora bem aceito que um anterior restauração da competência imunológica pode influenciar a recorrência da doença e prognóstico [9], [13], [15], [16]. Além disso, no passado recente, há sinais convincentes de que a resposta imunológica ao câncer e alterações no sistema imune celular poderia ser significativamente afectado por cirurgia [17].

Agora é bem reconhecido que -beyond o C- reativa (CRP), que é provavelmente o principal marcador sérico para contagem de células inflammation- para as células brancas do sangue (WBC) e de células polimorfonucleares (PMN) representa um bom suporte para a avaliação pós-operatória imunológica de pacientes com cancro [18], [19]. No entanto, ainda mais do que as variações no número de células, parece muito importante para verificar possíveis alterações em suas funções, tais como a atividade secreta [20]. Em particular, uma análise mais exaustiva dos processos inflamatórios após a lesão pode atualmente ser fornecido pela avaliação de citocinas.

Portanto, com o objetivo de investigar as respostas imunológicas para diferentes abordagens cirúrgicas em pacientes submetidos à ressecção de cólon direito para o câncer, foi realizada -para o primeiro tempo- uma comparação entre os dados de curto prazo na liberação de citocinas obtidas simultaneamente em níveis sistêmicos, locais e celulares. A fim de organizar uma avaliação abrangente dos perfis pós-operatórias exibidos nesses pacientes, investigou-se a concentração de citocinas tanto no plasma e no líquido peritoneal coletadas em momentos diferentes após a colocação de pós-operatório convencional de um sistema de drenagem, porque a resposta peritoneal local pode ser considerado um determinante importante da recuperação pós-operatória [21]. No entanto, como relatado anteriormente [22], um índice mais convincentes do estado inflamatório ao lado da cirurgia pode ser representado pela análise das células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a capacidade para secretar citocinas

in vitro

, em presença de um lipopolissacarídeo (LPS) mediada por estimulação.

um novo método que utiliza matriz biochip multiplex para a detecção simultânea de um grande painel de múltiplas citocinas em cada amostra tem atraído recentemente um interesse considerável [23]. Aqui a avaliação síncrono de 12 citocinas diferentes foi realizada, incluindo proteínas inflamatórias tais como o factor de necrose tumoral-α (TNF-α), IL-1 (α e β), IL-2, IL-4, IL-6, IL- 10 e interferão-y (IFN-γ), quimiocinas (IL-8, e proteína quimiotática de monócitos-1: MCP-1) e factores de crescimento (factor de crescimento endotelial vascular: VEGF e factor de crescimento epidérmico: EGF). Todos os dados foram finalmente avaliados em comparação com as características clinicobiological e os parâmetros convencionais perioperatórios recolhidos no seguimento imediato.

Colectivamente, os nossos resultados mostram, assim, que a laparoscopia em comparação com abrir ressecção direita está associada com um compromission mais curto do imunológica homeostase, mas principalmente nos estágios iniciais de pacientes de CRC certas.

Materiais e Métodos

estudo design by

o desenho do estudo foi aprovado pelo comitê de ética da universidade e todos os inscritos pacientes deram consentimento informado (Prot. CE 843/2012). Os participantes fornecer seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo.

Entre maio de 2008 e abril de 2011, todos os pacientes diagnosticados com câncer de cólon direito na Unidade de Cirurgia do Hospital Sant’Andrea foram avaliados e 25 deles foram selecionados consecutivamente para este estudo, com base nos seguintes critérios.

os critérios de elegibilidade previstos pacientes afetados por adenocarcinoma de cólon primário, prevista para ressecção eletiva por colectomia direita, matriculados antes de qualquer terapia neoadjuvante e submetidos a colocação de pós-cirúrgica de um baixo vácuo sistema de drenagem para recolha de fluidos peritoneal

os critérios de exclusão foram:. uma história pré-existente de cirurgia abdominal ou câncer e doenças inflamatórias, o início de complicações intra e pós-cirúrgicos, a admnistration de sangue intra e pós-operatório transfusões de interferir com a resposta imunitária, detecção pré ou intra-operatória de carcinomatose peritoneal, cirurgia de emergência ou de complicações abdominais. O grupo de estudo consistiu em 25 pacientes (12 homens e 13 mulheres, com idades entre 59 a 83 anos) que foram administrados após a cirurgia (10 submetidos a minimamente invasiva e 15 a procedimentos convencionais) seguindo o mesmo protocolo: (a) as amostras de sangue seriadas foram coletadas no pré-operatório, aos 6, 24, 48 e 72 horas (horas) de pós-operatório; (B) recolha de fluidos peritoneais pós-cirúrgica foi realizada a 24 e 48 horas; (C) As células mononucleares foram obtidas a partir de sangue periférico (PBMC) antes e 24 horas após a cirurgia e cultivadas durante mais 48 horas: em seguida, os sobrenadantes foram recolhidos para cada cultura. Conseguimos dois grupos de controle diferentes. O primeiro incluiu 10 voluntários saudáveis ​​(5 homens e 5 mulheres com idades de 47 a 70 anos), cujas amostras de sangue foram retiradas para dosagens simultâneos e de série de citocinas e de culturas de CMSP (como acima). Um grupo de controlo adicional consistiu de 2 pacientes suplementares que foram submetidos a colectomia direita por cirurgia aberta para doenças colorretais não neoplásicas e estavam aplicando então processado exatamente os mesmos procedimentos utilizados para pacientes com câncer, incluindo plasma, coleta de fluidos peritoneal e culturas de CMSP.

Os seguintes parâmetros foram registrados em todos os pacientes: idade, sexo, índice de massa corporal (IMC), da Sociedade americana de Anestesiologia (ASA) de pontuação, tempo de incisão, perda de sangue estimada, tempo de operação, o tempo para a ingestão oral retomada, quantidades de analgésicos usados ​​para o controle da dor, tempo para a primeira evacuação, tempo de deambulação, permanência hospitalar. As características clinicopatológicas dos pacientes foram obtidas a partir dos relatórios patológico do tumor após cirurgia. Os tumores foram classificados como proposto pelo 6

ª edição da classificação TNM dos tumores malignos da União Internacional Contra o Câncer (UICC). Os pacientes foram estratificados em dois grupos de acordo com o estágio do tumor: “precoces” pacientes 13 para as fases I-II da doença e 12 pacientes “avançadas” para os estádios III-IV da doença

Cirurgia

Todos os pacientes foram submetidos a colectomia direita e foram divididos em dois possíveis abordagens cirúrgicas: (a) uma técnica laparoscópica minimamente invasiva ou (b) uma cirurgia aberta convencional. Todas as ressecções foram realizadas de acordo com os princípios oncológicos aceitas com a mesma extensão da ressecção para ambos os grupos, incluindo ligadura embarcação alta, desembaraço nodal ea margem intestinal adequado. Para ressecções laparoscópicas, pneumoperitônio foi criado e abordagem intracorporeal através de 4 portas abdominais (1-1,2 cm de diâmetro) foi usado para manobras cirúrgicas. O intestino foi exteriorizada através de uma pequena incisão periumbilical (5-7 cm de comprimento) para ressecção e anastomose. A colectomia aberta foi feito através de uma incisão na linha média (16-20 cm de comprimento) utilizando técnicas cirúrgicas convencionais. Em todos os pacientes restauração da continuidade do intestino foi realizada com uma anastomose íleo-transversa grampeado e um sistema de drenagem de baixo vácuo foi colocado para a recolha de fluidos peritoneal.

Todos os pacientes receberam i.v. morfina durante 24 horas de pós-operatório e i.v. As drogas não esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), a pedido. Os pacientes foram autorizados a tomar líquido quando seu intestino sons tornam-se audíveis, e eles foram progrediu para uma dieta sólida como tolerada. Mobilização e remoção do cateter foi encorajado, logo que o paciente estava fisicamente capaz. Os pacientes receberam alta quando totalmente ambulatorial e tolerante de uma dieta sólida.

Sangue, peritoneal e células Amostras

Quatro mililitros de amostras de sangue venoso heparinizado foram coletadas, incluindo pacientes e controles, antes e 6, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia (T0-6-24-48-72). Após centrifugação, as amostras foram armazenadas a -80 ° C até ensaios para determinar a concentração de citocinas, proteína C-reactiva (CRP, marcador de fase aguda) as contagens totais de leucócitos, linfócitos e granulócitos polimorfonucleares.

e 24 48 horas após a cirurgia, os fluidos peritoneais foram recolhidos e, em seguida, as concentrações de citocinas foram medidos tal como descrito abaixo. Cerca de dez mililitros de 24 horas as amostras de sangue foram também recolhidas para isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizando a centrifugação com gradiente de densidade sobre Ficoll-Paque ™ Plus (Amersham Biosciences /GE Healthcare), quer a partir de 25 pacientes de CRC ou a partir de 10 dadores sãos utilizados como controlos. As células foram então cultivadas em triplicado a uma densidade de 1 x 10

6 células /ml em 24 poços /placa (Becton Dickinson, Oxnard, CA) em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) e antibióticos e estimuladas com lipopolissacáridos 1,0 ug /mL de (LPS) (todos os reagentes da Sigma Chemicals Co., St. Louis, MD). Após mais 48 horas de cultura, sobrenadantes de células foram obtidas e coletadas para determinar a concentração de citocinas.

Os perfis inflamatórios perioperatórios de os todos os pacientes foram então investigadas, em diferentes momentos de avaliação 12 níveis de citocinas no plasma, fluidos peritoneal e celular os sobrenadantes de cultura recolhidos como descrito acima

a determinação de níveis de citoquina

Para a avaliação simultânea dos 12 seguintes citocinas: IL-1., IL-1, IL-2, IL-4, IL- 6, IL-8 e IL-10; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de necrose tumoral-α (TNF-α); interferão-γ (IFN-γ) e quimioatractiva de monócitos da proteína-1 (MCP-1), uma matriz de biochip multiplex em equipamentos Evidência (Randox Labs. Ltd. Crumlin, Reino Unido) foi utilizada como relatado anteriormente [23]. Os ensaios foram realizados no plasma, os fluidos peritoneais e sobrenadantes de cultura de PBMC, seguindo as instruções do fabricante. Da concentração do analito presente na amostra foi calculada automaticamente utilizando curvas de calibração de rotina gerados (Evidence Software versão 1.4).

Análise Estatística

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (SD), média ± erro padrão (SEM) ou mediana e intervalo interquartil

A significância estatística foi definido em

p Art .. 0,05

A normalidade da distribuição dos dados foi verificada com teste de Shapiro-Wilk, e os dados não foram distribuídos normalmente transformada logaritmicamente antes da análise. Comparação entre e dentro dos grupos foi feita por testes não pareados Mann-Whitney ou e emparelhado ou Wilcoxon-Pratt testa respectivamente. O coeficiente de correlação de Pearson ou Spearman foi utilizado para avaliar as relações entre as variáveis. Para as variáveis ​​categóricas foi utilizado o Qui-quadrado ou teste de Fisher. A análise estatística foi realizada utilizando o Graph Pad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA), e SigmaPlot V.1 1 (Copyright: © 2008 Systat Software, Inc.).

Resultados

Pré e Pós-cirúrgico dos pacientes Características

25 pacientes CRC do lado direito -uniformly estratificadas em 13 precoce (I-II) e 12 estágios avançados (III-IV) da doença- foram inscritos para laparoscópica ou intervenção aberta convencional, que definiu dois diferentes grupos comparáveis ​​com relação a numerosidade, idade, sexo, índice ASA e IMC (tabela 1).

a fim de comparar os parâmetros perioperatórios de laparoscopia versus convencionais procedimentos abertos, tempo de incisão, a duração da intervenção e perda de sangue, bem como de partida do movimento primeira intestino e dieta sólida, uso de analgésicos, tempo de deambulação e permanência hospitalar foram coletados (tabela 2). Ao todo, eles mostram uma melhor recuperação geral para pacientes operados com a laparoscopia, como indicado por uma diferença significativa entre as duas abordagens cirúrgicas no período de incisão (

p Art 0,0001), (

p

= 0,0008), tempo de dieta sólida (

p

= 0,005), tempo para deambulação (

p

= 0,003) e de internação (

p

= 0,0002), mesmo embora o tempo operatório foi maior (

p

= 0,0008).

pré e pós-operatórias números de WBC e PMN foram avaliados nos diferentes grupos e controles. Nas primeiras 72 horas após a cirurgia, em comparação com a análise pré-operatório, assim como para dadores saudáveis, um aumento significativo no número de células foi observada (pico entre 6 e 24 horas), que tendem a normalizar, de forma independente de qualquer tipo de cirurgia ou estágio da doença . Da mesma forma, os níveis plasmáticos de PCR mostra aumentos progressivos, a partir de 6 horas e atingindo um máximo de 48 horas após a intervenção. No entanto, esta análise mostra diferenças significativas em relação às diferentes abordagens cirúrgicas, mas não para subgrupos estágio do tumor com base. Em particular, os níveis de PCR após 24 horas foram significativamente maiores (

p Art 0,01) em pacientes submetidos a abrir versus cirurgia laparoscópica, que essas diferenças -embora sempre detectable- não resultou estatisticamente significativa nas outras vezes ( 6, 48 e 72 horas).

os níveis pré-cirúrgica pró-inflamatórias citocinas diretamente correlacionados com o estágio da doença

para melhor comparar as duas abordagens cirúrgicas diferentes, medimos simultaneamente os níveis plasmáticos de 12 citocinas a partir de sangue derivadas de pacientes de CRC antes e após ressecção.

pré-cirúrgica (T0) níveis de IL-6, IL-8, IL-1β, TNFa (linha de base) foram significativamente (

P

. 0,05) inferior a dadores saudáveis ​​versus pacientes CRC e estas diferenças aumentam progressivamente com o estágio do tumor (Fig 1), enquanto que nas outras citocinas não foram observadas diferenças significativas (dados não mostrados). Em particular, excepto para TNFa, as citocinas todos citados mostram um aumento significativo nos níveis de linha de base quando em comparação precoce (I-II) a avançado (III-IV) estádios da doença (

P

0,05) (Fig. 1).

níveis de citocinas foram medidos a partir do plasma de grupo controle (Ctrl), ou 25 pacientes CRC antes da cirurgia (total), incluindo 13 precoce (I-II) e 12 estágio avançado (III-IV ) de doença. Os valores são expressos em média ± SEM e as estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado. Os valores de P são assumidos como estatisticamente significativo a

P

0,05 (*);

p Art 0,01 (**);

p Art 0,001 (***). ns = não significativo.

Curiosamente, os pacientes de controle adicionais -carrying níveis gastrointestinais neoplásicas não pathologies- show de citocinas semelhantes a voluntários saudáveis ​​(dados não mostrados). Além disso, as linhas de base os níveis de citocinas foram comparáveis ​​para os dois grupos de ressecção laparoscópica abertos e (dados não mostrados).

IL-6 e IL-8 pós-cirúrgica níveis plasmáticos são mais baixos após a laparoscopia comparação à cirurgia aberta apenas nos estágios iniciais dos pacientes

Quando comparamos os níveis plasmáticos pós-operatórias do painel de citocinas todo, só foi observada uma diferença significativa na laparoscópica contra pacientes de ressecção abertas para a IL-6 e IL-8 (Fig. 2). Surpreendentemente, embora os nossos dados exibidos cinéticas distintas para cada citocina, observou-se que os aumentos de aberto versus abordagens conservadoras para tanto a IL-6 e IL-8 pode ser claramente observado apenas em CRC fases iniciais, enquanto avançado -in tumors- a escolha de cirurgia não influenciar ainda mais os níveis de citocinas no pós-operatório. Em particular, pós-cirúrgica de IL-6 apresentada detecção aumentos significativos após 24 e 48 horas em pacientes submetidos a técnica invasiva convencional em comparação com a laparoscopia, embora o pico da produção de citocinas foi conseguida em 6 horas em ambos os grupos (FIG. 2). Os incrementos significativos de IL-6 no T24 e T48 participou principalmente nos estágios iniciais, enquanto que em estágio avançado da doença não foram observadas diferenças substanciais entre laparoscópica e os grupos de cirurgia aberta. Além disso, de forma semelhante a IL-6, nem a IL-8 níveis pós-cirúrgicas foram geralmente mais elevada em aberto em relação à cirurgia laparoscópica, mas esta diferença resultou significativo às 48 horas apenas e, outra vez, especialmente para as fases iniciais da doença (Fig. 2) . Notavelmente, uma diminuição progressiva da IL-8 foi detectado até 48 horas após a laparoscopia, mas não após a intervenção invasiva (Fig. 2).

Pré-(T0) e pós-operatório (T6-48) IL-6 e IL -8 níveis níveis foram medidos a partir de plasma de 25 pacientes CRC antes da cirurgia (fase I-IV), incluindo 13 no início 12 avançado (estágio III-IV) estágio da doença (fase I-II) e. Os valores são expressos em média ± SEM e as estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado. Os valores de P assumem-se como estatisticamente significativo a

p

. 0,05 (*)

Para as outras duas citocinas que foram significativamente diferentes na detecção pré-operatória de linha de base, (IL-1β e TNF?), não há mudanças significativas de conservadora em comparação com a técnica cirúrgica convencional ter sido detectada (dados não mostrados). Os níveis dos outros oito citocinas, cujos valores pré-cirúrgico em pacientes de CRC e não neoplásicas não foram significativamente diferentes em comparação com dadores saudáveis, aumentou após a ressecção do tumor, mas independentemente do tipo de cirurgia ou fase da doença (dados não mostrados). Curiosamente, IL-6 aumenta directamente correlacionada com os níveis de PCR, ou 24 horas (r

2 = 0,51 com

p

= 0,0086) ou 48 horas (r

2 = 0,49 com

p

= 0,012) após a cirurgia, enquanto que para as restantes citocinas plasmáticas não há relações com PCR foi observada (dados não mostrados).

os níveis de citoquina de pacientes de CRC em fluidos peritoneais recolhidos passadas 24 e 48 horas após a cirurgia foram igualmente medido. Um aumento significativo na concentração de citoquina em relação ao plasma correspondente, variando de aumento de 400 vezes da IL-6 ao aumento de 2 vezes para a MCP-1 (dados não mostrados) foi observado. No entanto não há diferenças significativas em todo o painel de citocinas -Dependendo tempo (T24 e T48) e tipo de cirurgia ou fase da doença que já foi detectada (dados não mostrados).

IL-6

In vitro

Produção por PBMC, após LPS Estimulação, é significativamente aumentada após a laparoscopia, apenas em estágios iniciais da doença

a capacidade de PBMC derivadas de dadores saudáveis, laparoscópica ou pacientes de cirurgia aberta para produzir citocinas foi ainda analisada in vitro, medindo as citoquinas presentes no sobrenadante de PBMC estimulado por LPS tanto antes e 24 horas após a cirurgia. Em primeiro lugar, observou-se níveis mais elevados de citocinas nos sobrenadantes recolhidos a partir de PBMC estimulada por LPS em comparação com culturas de células não estimuladas derivadas de amostras de sangue, quer em dadores saudáveis ​​ou de pacientes de CRC antes e 24 horas após a cirurgia (dados não mostrados). Em seguida, presurgery em comparação com as culturas de células derivadas de pós-cirúrgica correspondentes produziram níveis mais elevados de sobrenadante do painel citoquina inteira (dados não mostrados). Dentro das amostras pré-cirúrgicas, a produção de citocinas foi maior nos sobrenadantes derivados das fases iniciais do que os derivados de fase avançada de CRC (dados não mostrados). Por outro lado, pós-cirúrgica PBMC, derivadas de pacientes de CRC sujeitos a ressecção laparoscópica contra aberta, produzem maiores quantidades de citocinas e aumento da eficiência da estimulação com LPS (variando de aumento de 15 vezes para a IL-6, para aumento de 2,5 vezes para o MCP-1 em estimulado por LPS vs amostras não estimuladas). Em particular, a detecção de IL-6 nos sobrenadantes de PBMC cultivadas derivadas de pacientes de CRC 24 horas após a cirurgia é mostrado na Figura 3, sendo a mais representativa de todo o painel de citocinas. LPS induziu uma melhoria significativa da produção de citocina, quer após intervenção laparoscópica ou aberta, embora a eficácia de estimulação foi mais significativa em sobrenadantes de células de PBMC derivadas de pacientes submetidos a cirurgia laparoscópica vs aberta (

P

0,01 vs

p Art .. 0,05) (figura 3)

IL-6 níveis foram medidos em sobrenadantes recolhidos a partir de culturas PMBC estimuladas com LPS. Amostras provenientes de 25 pacientes de CRC (total, fase I-IV), incluindo 13 no início 12 avançado (estágio III-IV) estágio da doença (fase I-II) e. Os valores são expressos em média ± SEM e as estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado. Os valores de P são assumidos como estatisticamente significativo a

P

0,05 (*);

p Art 0,01 (**);

p Art 0,001 (***). ns = não significativo.

É importante salientar que, quando comparamos mediada por LPS efeitos em culturas pós-cirúrgicas derivados precoce versus estágio avançado da doença, uma estimulação significativa da secreção de IL-6 foi encontrada exclusivamente no início (I-II), ao passo que não foram observadas diferenças significativas nos estágios avançados da doença, cujos valores (± LPS) foram sempre menores em comparação com as correspondentes fases iniciais (Fig. 3). Além disso, o LPS efeito estimulante foi mais significativo nas células derivadas de laparoscópica (

P

0,01) comparado ao abrir (

P

0,05) procedimento, em pacientes de CRC nas fases iniciais da doença (I-II), que essas diferenças não foram significativas quando a laparoscopia foi comparado ao abrir grupo da cirurgia em pacientes afetados pela CRC em estágios avançados (III-IV) (fig. 3). Quando comparamos a ausência de tratamento e estimulada por LPS sobrenadantes, não foram observadas diferenças significativas nos controles de cirurgia aberta e laparoscópica, enquanto que um aumento significativo na LPS estimulado células derivadas de pacientes submetidos à laparoscopia contra intervenção aberta foi detectada (

p

.. 0,01) (Figura 3)

de modo semelhante à IL-6, também para a IL-8, IL-1β, TNFa e MCP-1, induzida por LPS aumentos significativos (

p

0,05) nos sobrenadantes das células cultivadas foram encontrados, mas independentemente do tipo de cirurgia e a fase de pacientes de CRC (dados não mostrados). Nas outras citocinas restantes detectados nos sobrenadantes de PBMC cultivadas de pacientes com câncer, a estimulação LPS não produziu qualquer aumento significativo da produção e, além disso, não existem diferenças substanciais foram observados comparando indivíduos submetidos à cirurgia conservadora ou aberta e tendo cedo ou estágio avançado da doença (dados não mostrados).

Discussão

neste estudo, mostramos pela primeira vez que a análise simultânea de citoquinas a partir de 12 sistémica (sangue), (fluidos peritoneais) locais e celular (sobrenadantes de culturas de células) amostras provenientes de pacientes com câncer de cólon direito submetidos a diferentes abordagens cirúrgicas para ressecção do tumor. 25 pacientes afetados pelo câncer do cólon direito, 13 rolamento fase inicial e 12 estágio avançado da doença, destinado a minimamente invasiva laparoscopia ou intervenção aberta convencional, foram investigados na pré-termo curto e pós-operatório para a produção de citocinas. Na verdade, apesar de uma conexão causal entre o câncer de cólon e inflamação tem sido bem estabelecida [24], as possíveis implicações de citocinas respostas de curto prazo, em pacientes submetidos a diferentes procedimentos cirúrgicos para cirurgia do câncer colorretal direito ainda não estão esclarecidos. Os nossos resultados mostram que a recuperação da homeostase imune de pacientes submetidos a colectomia CRC não só poderia estar relacionada com o tipo de cirurgia [25], mas também para o estágio da doença tumoral.

A análise de fase aguda convencional marcadores mostra -como esperados [2], [20], [25], [26] – uma melhoria significativa no pós-operatório em número WBC e PMN, no prazo de 72 horas após a cirurgia, o que tende progressivamente a normalizar, mas independentemente de qualquer tipo de cirurgia ou estágio da doença. Pelo contrário, os incrementos de PCR, a partir de 6 horas e com pico 48 horas após a intervenção e sendo mais elevada em aberto versus cirurgia laparoscópica, apareceu significativamente diferentes no que diz respeito ao tipo de intervenção (como esperado cfr. [2], [27] – [29]), mas não para os subgrupos de fase-tumor com base. Mesmo que esses marcadores são considerados um índice convincente da resposta inflamatória aguda ao trauma cirúrgico, novos estudos são necessários para estabelecer o papel de diferentes abordagens cirúrgicas na determinação -não somente a recuperação pós-operatória de functioning- imunológico, mas mais geralmente o resultado em pacientes de CRC [24]. Na luz dessas observações, a avaliação pós-cirúrgica a curto prazo do perfil de citocinas sistémica, local e celular pode se tornar uma variável independente na avaliação prognóstica de pacientes acometidos de câncer de cólon direito. Na verdade, como relatado anteriormente [19], [30], [31], algumas citocinas podia ser considerada não só um biomarcador da resposta de fase aguda, bem relacionada com o grau de trauma cirúrgico, mas também são potencialmente capazes de influenciar o resultado de curto prazo no pós-operatório [32], a restauração da homeostase imune [13], a incidência de complicações infecciosas e recorrências locais [14], [33] e os resultados oncológicos a longo prazo [16].

a nossa análise pré-cirúrgica mostra que alguns níveis de citocinas (IL-6, IL-8, IL-1b e TNF?) foram significativamente maiores no plasma dos pacientes acometidos por câncer colorretal em comparação com dadores saudáveis ​​e estas diferenças aumentam progressivamente em estágios tumorais avançados. Isto não é surpreendente, porque várias investigações revelaram uma correlação direta entre o aumento dos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias e estágio do tumor colorretal e progressão, nomeadamente em matéria de IL-6, cuja expressão é frequentemente aumentado na doença câncer e considerada um preditor de mau prognóstico [23] , [24], [34] – [41]. Nossos dados confirmam investigações anteriores que indicam uma relação entre IL-6 secreção (atingindo um máximo de 6 horas após a cirurgia) e a seguinte produção CRP (atingindo um máximo de 48 horas após a cirurgia) [27], [42]. Embora as opiniões aumento apoiar o papel da PCR como um preditor de menores taxas de sobrevivência em pacientes com vários tipos de câncer, incluindo CRC [43], não houve resultados definitivos foram publicados a respeito de seu valor eficaz como uma variável independente sobre a recuperação pós-operatória [29]. No entanto, relatos anteriores mostraram alguns resultados contraditórios sobre os níveis plasmáticos de citocinas pré-cirúrgicas, provavelmente imputável a diferenças nas metodologias realizadas [23].

tem sido proposto que os níveis de citocinas no plasma pós-cirúrgicas pode ser considerado um bom marcador da resposta de fase aguda em geral e utilizado para controlar o impacto da cirurgia, que é potencialmente diferente de acordo com os procedimentos operatórios diferentes [20], [44], [45].