Abstract

Fundo

Anexinas são proteínas cálcio e fosfolipídeos de ligação que formam uma família multigênica conservada evolucionária. Evidências consideráveis ​​indica que A10 anexina (ANXA10) está envolvida na progressão tumoral, embora pouco se sabe sobre o seu papel na carcinogênese oral humana. Neste estudo, nós investigamos o envolvimento de ANXA10 no carcinoma de células escamosas oral (CCEO).

Metodologia /principais conclusões

mRNA e proteína ANXA10 expressões foram avaliados por reação inversa quantitativa cadeia de polimerase transcriptase e immunoblotting, e foi realizado um ensaio de proliferação e análise do ciclo celular em células ANXA10 knockdown

in vitro

. Avaliou-se a correlação entre o estado de expressão ANXA10 em 100 epidermóide estudados primárias e as características clinicopatológicas por imuno-histoquímica. ANXA10 mRNA e os níveis de expressão de proteína foram regulados positivamente em todas as linhas celulares examinados (n = 7,

p Art 0,05). células knockdown ANXA10 mostraram que a proliferação celular diminuiu inactivação de quinase regulada extracelular (ERK) (

P

0,05), e a paragem do ciclo celular na fase G1 resultou da sobre-regulação de inibidores de quinase dependentes de ciclina . a expressão da proteína ANXA10 no carcinoma epidermóide estudados primários também foi significativamente maior do que em vias normais (

p Art 0,05)., e maior expressão foi correlacionada com o tamanho tumoral (

p

= 0,027)

Conclusões /Significado

Nossos resultados propostos para a primeira vez que ANXA10 é um indicador de proliferação celular no carcinoma epidermóide estudados. Os nossos resultados sugerem que a expressão ANXA10 pode indicar a proliferação celular e ANXA10 pode ser um alvo terapêutico potencial para o desenvolvimento de novos tratamentos para o carcinoma epidermóide estudados

citação:. Shimizu T, Kasamatsu A, Yamamoto A, K Koike, Ishige S, Takatori H, et al. (2012) A10 anexina em Câncer Oral Humano: Biomarcador para o crescimento tumoral via G1 S Transition /alvejando MAPK vias de sinalização. PLoS ONE 7 (9): e45510. doi: 10.1371 /journal.pone.0045510

editor: Qiming Jane Wang, da Universidade de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Março, 2012; Aceito: 21 de agosto de 2012; Publicação: 17 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Shimizu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

anexinas são cálcio e proteínas de ligação de fosfolipídios que formam uma evolutiva família multigênica conservada. A desregulação dos membros da família anexina tem sido relatada em numerosos cancros e afecta os padrões de comportamento celulares, tais como a proliferação, capacidade de invasão, e vias de sinalização relacionados com o cancro, sugerindo que anexinas podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento tumoral e progressão [1] – [10] . Anexina A10 (ANXA10), um gene overexpressed nos carcinomas de células escamosas orais (CEB) -derived linhas celulares em nossos dados de microarranjos anteriores [11], tem sido implicada na função celular na endocitose e exocitose; actividade anticoagulante; interacção com o citoesqueleto; diferenciação; e proliferação celular [12], [13]; ea relevância de malignidade no esôfago de Barrett, cancro gástrico e cancro da bexiga [14] – [16].

A proliferação de células cancerosas humanas é largamente controlada na fase G1 do ciclo celular. O MAP quinase (MAPK) cascatas de sinalização surgiram como principais intervenientes na proliferação de várias células de câncer [17]. Estudos prévios relataram que vários anexinas especificamente modular a quinase regulada extracelular (ERK) /MAPK cascata de sinalização a montante [18], [19]. activação de ERK desempenha um papel fundamental na transição G1 /S [20], [21]. Os membros da ciclina

–

quinase dependente (CDK) interagindo proteína /proteína inibidora da quinase (Cip /Kip) se ligam família para complexos ciclina-CDK e inibir suas atividades, levando a paragem do ciclo celular G1. Ciclina D1, ciclina E, p21

KIP1 e p27

níveis KIP1 são afetadas por múltiplas vias de sinalização, incluindo a via ERK /MAPK sinalização [22] – [25]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais ANXA10 modula estas respostas celulares não foram completamente elucidados em carcinoma epidermóide estudados.

Nós relatamos os resultados de uma análise abrangente da expressão aberrante de ANXA10 em carcinoma epidermóide estudados que são funcionalmente e clinicamente ligadas à progressão tumoral .

linhas celulares

resultados

Avaliação de mRNA ANXA10 e expressão da proteína em CCEO derivados

Para investigar o status de expressão de ANXA10 identificado como um gene relacionado ao câncer pelo nosso anterior dados de microarray [11], foi realizada quantitativa em tempo real reversa-PCR de transcrição (qRT-PCR), e análise de imunotransferência utilizando sete linhas celulares derivadas de CEB e queratinócitos humanos normais orais (HNOKs). ANXA10 mRNA e estado expressão da proteína foram significativamente sobre-regulada em todas as linhas celulares de CCEO em comparação com os do HNOKs (Figura 1A, B; *

p Art 0,05). Análise da expressão indicaram que ambos os produtos de transcrição e tradução dessa molécula foram altamente expresso em linhas celulares derivadas de CEB.

(A) Quantificação de

ANXA10

níveis de ARNm em linhas celulares derivadas de CEB por qRT análise-PCR. Significativo aumento da regulação do

ANXA10

mRNA é visto nas sete linhas celulares CCEO derivados em comparação com os do HNOKs. Os dados são expressos como a média ± SEM de valores a partir de três ensaios (*

P

0,05; teste de Mann-Whitney U). (B) Análise de imunotransferência de proteína ANXA10 nas linhas e HNOKs celulares CCEO derivados. expressão ANXA10 proteína (peso molecular, 37 kDa) é regulado para cima nas linhas celulares CCEO derivados em comparação com os do HNOKs. dados de proteínas densitométrica ANXA10 são normalizados para os níveis de proteína-tubulina a. Os valores são expressos como uma percentagem dos HNOKs.

Estabelecimento de células knockdown ANXA10

Uma vez que a expressão ANXA10 foi regulada nas linhas celulares de CCEO, assumimos que ANXA10 pode jogar um papel importante na epidermóide estudados. Para avaliar a ANXA10 funções

in vitro

, um experimento shRNA foi realizada utilizando as células SA3 e HO-1-u-1. As manifestações de ARNm e proteína ANXA10 nas células shANXA10-transfectadas foram significativamente inferiores nas células transf ectadas com shMock (Sa3 e Ho-1-L-1 derivadas de células transfectantes, Figura 2A, B; *

P

. 0,05)

(a) qRT-PCR demonstra que a expressão de ARNm nas células ANXA10 shANXA10-transfectadas (Sa3- e transfectantes HO-1-L-1-derivadas; 2 clones cada) são significativamente mais baixos do que nas células shMock-transfectadas (*

P

0,05; teste de Mann-Whitney U). Análise (B) de imunotransferência mostra que os níveis de proteína em células ANXA10 shANXA10-transfectadas (Sa3- e HO-1-L-1-transfectantes derivados; 2 clones cada) também diminuiu significativamente comparada com a das células transfectadas shMock

análises funcionais de células knockdown ANXA10

Para avaliar o efeito da ANXA10 knockdown no crescimento celular, foi realizado um ensaio de proliferação celular. Transfectada com o ANXA10 shRNA (shANXA10) – e o controlo shRNA (shMock) -transfected células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10

4 células viáveis ​​/poço contados em 7 dias consecutivos. Houve uma redução significativa no crescimento celular das células transfectadas shANXA10 comparação com as células transfectadas com shMock (SA3 ou HO-1-L-1 derivadas de células transfectantes, a Figura 3; *

P

0,05 ).

Para determinar o efeito de shANXA10 sobre a proliferação celular, e as células shANXA10- shMock-transfectadas são inoculadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 10

4 células viáveis ​​/poço. Ambos os transfectantes foram contados em 7 dias consecutivos. O crescimento celular de células shANXA10-transfectadas (Sa3- e transfectantes HO-1-L-1-derivadas; 2 clones cada uma) é significativamente inibido em comparação com as células transfectadas shMock após 7 dias (168 horas). Os resultados são expressos como a média ± SEM de valores a partir de três ensaios. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as células shANXA10- e shMock-transfectadas (*

p Art 0,05; Mann-Whitney U).

Para investigar um mecanismo subjacente potencial que explicaria reduziu a proliferação celular nas células shANXA10-transfectadas, foram avaliados os ERK, que são frequentemente sobre-regulada em endometrial e outros tipos de câncer [26] – [29]. ERK fosforilada (pERK) de proteína diminuíram significativamente em células shANXA10-transfectadas em comparação com células shMock-transfectadas (Figura 4). Estes resultados sugerem que a via de sinalização de ERK é frequentemente atenuadas em células shANXA10-transfectadas.

ANXA10 causas knockdown diminuição dos níveis de ERK fosforilada (pERK) em comparação com as células transfectadas com shMock (Sa3- e Ho-1-L -1-transfectantes derivados; 2 clones cada uma); o nível de ERK é inalterada. dados de proteínas densitométrica pERK /ERK são normalizados para níveis de proteína tubulina-a.

Para investigar o mecanismo de progressão do ciclo celular em células shANXA10-transfectadas, foi realizada a análise de citometria de fluxo de células shANXA10-transfectadas. A percentagem da fase G1 em células shANXA10-transfectadas foi significativamente (

P

0,05) mais elevada do que nas células simuladamente transfectadas (Figura 5A, B). Também avaliamos o nível de expressão de dependentes de ciclina inibidores da quinase (CDKIs: p21

Cip1 e p27

KIP1), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4 e CDK6. Tal como esperado, enquanto as CDKIs foram sobre-regulada, uma significativa diminuição da regulação da ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 e foram detectadas em células shANXA10-transfectadas (Figura 5C). Estes resultados indicaram que a sub-regulação de ANXA10 inibiu a proliferação celular detendo a fase G1.

Para investigar a progressão do ciclo celular, analisou-se por citometria de fluxo determinação de conteúdo de ADN por um FACScalibur na G0-G1, S, e, G2-M fases. Determinou-se o nível de expressão de CDKIs (p21

Cip1and p27

KIP1), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 e para identificar o mecanismo pelo qual ANXA10 inibe a progressão do ciclo celular na fase G1. (A) após a sincronização de fase G0 /G1, com privação de soro, análise de citometria de fluxo foi realizada para investigar o ciclo celular nas células shANXA10- e shMock-transfectadas. A percentagem da fase G1 nas células shANXA10-transfectadas (Sa3- e transfectantes HO-1-L-1-derivadas; 2 clones cada) tem aumentado significativamente em comparação com as células pseudo-transfectadas (

P 0,05,

U

teste de Mann-Whitney). (B) Depois de sincronizar a fase G2 /M a tratada com nocodazol, análise citométrica de fluxo foi realizada para investigar o ciclo celular nas células shANXA10- e shMock-transfectadas. A percentagem da fase G1 nas células shANXA10-transfectadas (Sa3- e transfectantes HO-1-L-1-derivadas; 2 clones cada) também aumentou marcadamente em comparação com as células pseudo-transfectadas (

P

0,05,

U

teste de Mann-Whitney). Análise (C) Immunoblotting mostra-regulação de p21

Cip1and p27

KIP1 e para baixo-regulação da ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4 e CDK6 nas células shANXA10-transfectadas (Sa3- e Ho-1 transfectantes-u-1 derivada;. 2 clones cada) em comparação com as células transfectadas-shMock

Avaliação da expressão ANXA10 no carcinoma epidermóide estudados primários

imunohistoquímica Representante (IHC) resultados para ANXA10 proteína no tecido oral normal e CEB primária são apresentados na Figura 6A-D. As pontuações ANXA10 IHC do citoplasma de carcinoma epidermóide estudados primários foram significativamente (Figura 6E; *

P

0,001) maior do que em tecidos normais, em que as pontuações de IHC de tecidos e epidermóide estudados orais normais variou 27,5-132,4 (mediana, 93,5) e 60,5-230,4 (mediana, 150,6), respectivamente. A Tabela 1 mostra as correlações entre as características clínico-patológicas dos pacientes com CEB e o status da expressão da proteína ANXA10 usando o sistema de pontuação IHC. Entre as classificações clínicas, carcinoma epidermóide estudados ANXA10-positivos foram correlacionadas com o tamanho tumoral (

p

= 0,027) e do estágio TNM dos epidermóide estudados (

p

= 0,041).

Os resultados representativos para IHC proteína ANXA10 em tecido normal oral (A, B) e CEB primária (C, D) (A, C) ampliação original, 100x. As barras de escala, 50